研究生分子生物學(xué)工作基礎(chǔ)

核酸化學(xué)第一頁(yè)，共26頁(yè)。一，核酸分為核糖核苷酸（RNA）和脫氧核糖核苷酸（DNA），它們的基本組成單位是核苷酸第二頁(yè)，共26頁(yè)。DNA和RNA組成的差異

堿基戊糖磷酸DNAAGCT

脫氧核糖----RNAAGCU

核糖----第三頁(yè)，共26頁(yè)。二、核苷酸及其連接

第四頁(yè)，共26頁(yè)。三、DNA的結(jié)構(gòu)1．DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指核酸分子中核苷酸的排列順序及其連接方式。由于DNA中核苷酸彼此之間的差別僅見(jiàn)于堿基部分，因此DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)又指其堿基排列順序，即DNA序列(sequence)2．DNA的空間結(jié)構(gòu)（1）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)特點(diǎn)如下。i，DNA分子由兩條反向平行（一條是5一3、另一條是3一5走向）的多核苷酸鏈圍繞同一個(gè)中心軸盤曲而成，兩條鏈均為右手螺旋。DNA鏈的骨架由交替出現(xiàn)的親水的脫氧核糖基和磷酸基構(gòu)成，位于雙螺旋的外側(cè)；堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)。ii，兩條多核苷酸鏈間以配對(duì)堿基之間形成的氫鍵相聯(lián)系：一條鏈中的A與對(duì)側(cè)鏈的T配對(duì)，形成兩個(gè)氫鍵；G與C配對(duì)，形成三個(gè)氫鍵；氫鍵方向與長(zhǎng)軸垂直。這種堿基配對(duì)（basepairing）又稱堿基互補(bǔ)（Fig.3-10），所以組成DNA的兩條鏈為互補(bǔ)鏈。iii，堿基對(duì)平面在螺旋中的位置與螺旋軸幾乎垂直，相鄰堿基對(duì)沿軸旋轉(zhuǎn)36о，上升0.34nm。每個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)含10個(gè)堿基對(duì)，螺旋的螺距為3.4nm，直徑是2.0nm。DNA兩股鏈之間的螺旋狀凹陷一面較淺，稱為小溝(minorgroove)；對(duì)側(cè)較深，稱為大溝(majorgroove)(Fig.3-11)。近年研究證明，大、小溝攜帶了其他分子可識(shí)別的信息，是蛋白質(zhì)-DNA相互作用的基礎(chǔ)。IV，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要由互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵和堿基堆積力來(lái)維持。第五頁(yè)，共26頁(yè)。第六頁(yè)，共26頁(yè)。（2）DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)與染色質(zhì)組裝

在細(xì)胞中，雙螺旋還可以進(jìn)一步盤曲形成更加復(fù)雜的、多種形式的空間結(jié)構(gòu)，其中以超螺旋（supercoil）最常見(jiàn)

由于雙螺旋本身具有方向性，因此，超螺旋的旋轉(zhuǎn)方向不同可形成兩種不同手性的超螺旋：負(fù)超螺旋(negativesupercoil)，其超螺旋方向與雙螺旋方向相反，即左手超螺旋，這是生物體中最常見(jiàn)的DNA超螺旋形式；正超螺旋(positivesupercoil)，其超螺旋方向與雙螺旋方向相同，即右手超螺旋，目前僅發(fā)現(xiàn)于一種嗜熱菌Sulfolobus體內(nèi)

第七頁(yè)，共26頁(yè)。第八頁(yè)，共26頁(yè)。真核細(xì)胞基因組DNA的超級(jí)結(jié)構(gòu)與染色質(zhì)的組裝密切相關(guān)。首先，由雙螺旋DNA與一組稱為組蛋白(histones)的蛋白質(zhì)共同構(gòu)成核小體(nucleosome)。在一個(gè)典型的核小體中，大約有200個(gè)堿基對(duì)，其中146個(gè)堿基對(duì)與由組蛋白H2A、H2B、H3和H4各兩分子組成核小體的核心緊密纏繞；組蛋白H1則與處于核小體之間的連接DNA（linkerDNA）相連。在電子顯微鏡下，可觀察到核小體成串存在，呈念珠狀。在細(xì)胞分裂期間，形成核小體是DNA長(zhǎng)度壓縮的第一步。其次，在核小體形成的基礎(chǔ)上，DNA鏈進(jìn)一步折疊成每圈6個(gè)核小體、直徑為30nm的纖維狀結(jié)構(gòu)。這種30nm纖維再扭曲成襻，許多襻環(huán)繞核骨架(nuclearscaffold)形成棒狀的染色質(zhì)。核骨架中含有以組蛋白H1和拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅡI為主的多種蛋白。第九頁(yè)，共26頁(yè)。第十頁(yè)，共26頁(yè)。四、RNA的結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)單股多聚核苷酸鏈中核糖核苷酸的排列順序和共價(jià)連接就是RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)盡管RNA分子是單股多聚核苷酸鏈，但是可有局部雙鏈結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)是在二級(jí)結(jié)構(gòu)形式基礎(chǔ)上折疊形成的空間構(gòu)象，其中常見(jiàn)的形式之一就是“假結(jié)”（pseudoknot）（Fig.3-16B）。RNA分子的折疊（folding）結(jié)構(gòu)不僅在結(jié)構(gòu)上與蛋白質(zhì)相似，而且在功能方面也有類似之處，即具有折疊形式的RNA有分子識(shí)別、結(jié)合或催化功能，例如具有三級(jí)結(jié)構(gòu)形式的tRNA和核酶（ribozyme）

第十一頁(yè)，共26頁(yè)。第十二頁(yè)，共26頁(yè)。1．mRNA的結(jié)構(gòu)m7GpppAAAAAAAADNAhnRNAmRNAAUGAUGUAAUCG5untranslationregion3untranslationregion←Translationregion→↑↑第十三頁(yè)，共26頁(yè)。AUGAUGUAAUAGUGAUAAUAGUGAAAAAAAmRNA第十四頁(yè)，共26頁(yè)。2．tRNA的結(jié)構(gòu)第十五頁(yè)，共26頁(yè)。3．rRNA的結(jié)構(gòu)第十六頁(yè)，共26頁(yè)。4．非編碼蛋白質(zhì)RNA

除了參與蛋白質(zhì)生物合成的mRNA,tRNA和rRNA外，細(xì)胞中還存在另一類非編碼蛋白質(zhì)的RNA(non-codingRNA,ncRNA)，此類RNA的一個(gè)共同特點(diǎn)是缺乏長(zhǎng)的開(kāi)放讀碼框架（ORF），不具有編碼蛋白質(zhì)的能力。至今，200多種ncRNA已經(jīng)被證實(shí)。研究表明，這些ncRNA在基因表達(dá)以及應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)等方面起著重要的調(diào)節(jié)作用。因此，有人也將其稱為調(diào)節(jié)RNA（regulatoryRNA）。所以，在細(xì)胞中基因的功能性產(chǎn)物除蛋白質(zhì)外，還包括這些非編碼蛋白質(zhì)RNA，如在核酸分類中曾經(jīng)提到的UsnRNA、microRNA等microRNA的生物合成：第十七頁(yè)，共26頁(yè)。第十八頁(yè)，共26頁(yè)。五．核酸的理化性質(zhì)1．紫外吸收由于核酸所含的嘌呤和嘧啶分子中都有共軛雙鍵，使核酸分子在250~280nm波長(zhǎng)處有光吸收，其最大吸收峰在260nm處。這個(gè)性質(zhì)可用于核酸的定量測(cè)定2．變性、復(fù)性和雜交

變性：

雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定靠堿基堆積力和氫鍵維持。許多因素，如加熱、酸堿過(guò)強(qiáng)等因素均可破壞核酸內(nèi)這兩種非共價(jià)鍵，導(dǎo)致DNA兩條鏈完全解離，稱為核酸變性(denaturation)。核酸變性中以DNA變性為最有意義，而DNA變性中又以DNA的熱變性最常見(jiàn)。DNA變性是DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞、雙螺旋解體的過(guò)程。DNA變性時(shí)，堿基對(duì)之間的氫鍵斷開(kāi)，堿基堆積力破壞，但不伴隨共價(jià)鍵的斷裂，這是與DNA降解過(guò)程的區(qū)別DNA變性常伴隨著一些物理性質(zhì)的改變。如粘度降低，浮力密度增加，旋轉(zhuǎn)偏振光的改變等，尤其重要的是紫外吸收光密度值（OD260）的改變。在雙螺旋結(jié)構(gòu)中，上下相鄰的平行堿基堆積會(huì)導(dǎo)致雙螺旋DNA溶液的OD260值比相同組成的游離核苷酸混合物的OD260值低約40％，這種效應(yīng)稱為減色(hypochromic)效應(yīng)。DNA變性時(shí)引起這一效應(yīng)的降低，與未發(fā)生變性的相同濃度DNA溶液比較，變性DNA在波長(zhǎng)260nm的光吸收增強(qiáng)，這種效應(yīng)稱為增色(hyperchromic)效應(yīng)

第十九頁(yè)，共26頁(yè)。利用增色效應(yīng)可在波長(zhǎng)260nm處監(jiān)測(cè)溫度引起的DNA變性過(guò)程，DNA變性發(fā)生在一定的溫度范圍內(nèi)，這個(gè)溫度范圍的中點(diǎn)叫融解溫度(meltingtemperature)，用Tm表示。當(dāng)溫度達(dá)到融解溫度時(shí)，DNA分子內(nèi)50％的雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞。不同的DNA解鏈曲線的形式大致相同，但Tm值則有差異。Tm值與DNA的堿基組成和變性條件有關(guān)。DNA分子的GC含量越高，Tm值也越大，這是由于每一GC堿基對(duì)有3個(gè)氫鍵，比只有兩個(gè)氫鍵的AT堿基對(duì)更穩(wěn)定。因此，DNA分子所含的GC堿基對(duì)越多，兩條鏈分開(kāi)所需的能量越大，解鏈所需的溫度越高；Tm值還與DNA分子的長(zhǎng)度有關(guān)，DNA分子越長(zhǎng)，Tm值越大。此外，溶液離子強(qiáng)度增高也可使Tm值增大。復(fù)性：DNA的變性是可逆的。在適宜條件下，如溫度或PH值逐漸恢復(fù)到生理范圍，分離的DNA雙鏈可以自動(dòng)退火(annealing)，再次互補(bǔ)結(jié)合形成雙螺旋，這個(gè)過(guò)程稱為復(fù)性(renaturation)。核酸的分子雜交：

復(fù)性作用表明了變性分開(kāi)的兩個(gè)互補(bǔ)序列之間的反應(yīng)。復(fù)性的分子基礎(chǔ)是堿基配對(duì)。因此，不同來(lái)源的核酸變性以后，合并在一起，只要這些核酸分子含有可以形成堿基互補(bǔ)配對(duì)的序列，復(fù)性也會(huì)發(fā)生于不同來(lái)源的核酸鏈之間，形成雜化雙鏈(heteroduplex)，這個(gè)過(guò)程稱為雜交(hybridization)。不同來(lái)源的DNA可以雜交，DNA與RNA、RNA與RNA之間也可以雜交。若標(biāo)記一個(gè)已知序列的核酸，通過(guò)雜交反應(yīng)就可以確定待測(cè)核酸是否含有與之相同的序列。這種標(biāo)記的核酸稱為探針(probe)。由此發(fā)展出的分子雜交技術(shù)己成為分子生物學(xué)研究中不可缺少的基本技術(shù)，如Southern印跡（DNA-DNA雜交）、Northern印跡（DNA-RNA雜交）技術(shù)第二十頁(yè)，共26頁(yè)。六．核酸的核苷酸序列測(cè)定

1．化學(xué)裂解法Maxam-GilbertMethodforDNASequencing

此方法的基本步驟為，(1)先將DNA的末端之一標(biāo)記放射性同位素(32P或35S)；(2)再對(duì)DNA樣品分別進(jìn)行多組具堿基特異的、隨機(jī)的、不完全的化學(xué)修飾；(3)采用修飾堿敏感的特異化學(xué)試劑在修飾堿基位置斷開(kāi)DNA鏈；(4)通過(guò)具有可分辨鏈長(zhǎng)短僅一個(gè)核苷酸之差的聚丙烯酰胺凝膠電泳，將DNA斷裂片段按分子大小分離開(kāi)；(5)根據(jù)放射自顯影膠片上顯示的末端標(biāo)記片段的分布情況，直接讀出DNA的核苷酸序列

第二十一頁(yè)，共26頁(yè)。第二十二頁(yè)，共26頁(yè)。2．雙脫氧DNA鏈合成終止法

Sanger(Dideoxy)MethodforDNASequencing

第二十三頁(yè)，共26頁(yè)。七．DNA的合成1．DNA復(fù)制