核酸的提取純化和電泳檢測試驗(yàn)報告

本文格式為Word版，下載可任意編輯——核酸的提取純化和電泳檢測試驗(yàn)報告分子生物學(xué)試驗(yàn)山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

核酸的提取、純化和電泳檢測

摘要質(zhì)粒是獨(dú)立存在于染色體外、能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，分布于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動植物細(xì)胞中，但在細(xì)菌細(xì)胞中含量最多。提取和純化質(zhì)粒DNA的方法好多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB-氯化銫密度梯度離心法等等，其中堿變性法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分開目的，本試驗(yàn)采用堿變性法提取E.coliDH5α中Puc19質(zhì)粒DNA，并通過RNase消化及酚-氯仿抽提除去質(zhì)粒DNA溶液中的RNA以及RNase等一些可溶性蛋白，最終獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。細(xì)菌基因組DNA呈環(huán)狀袒露于擬核區(qū)，本試驗(yàn)中細(xì)菌染色體DNA的提取采用試劑盒的方式。本試驗(yàn)的目的在于把握堿變性法提取質(zhì)粒DNA及染色體DNA提取的原理、各種試劑的作用和方法，把握DNA的純化方法，即用RNase消化RNA以及用酚、氯仿抽提法除去質(zhì)粒中的蛋白質(zhì)，學(xué)習(xí)并把握凝膠電泳進(jìn)行DNA的分開純化及純度檢測的試驗(yàn)原理，凝膠的制備及電泳方法及相應(yīng)的方法操作。關(guān)鍵詞質(zhì)粒DNA堿變性提取法瓊脂糖凝膠電泳細(xì)菌染色體DNA

引言

1.核酸分開純化

1.1總原則

保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性

化學(xué)損傷——縮短化學(xué)試劑作用時間，以減少其對核酸的損失；

物理損傷——動作輕柔以減少機(jī)械剪切力；盡量低溫操作以減少高溫?fù)p傷；生物降解——參與相應(yīng)酶抑制劑，防止生物降解排除其他分子的污染

蛋白質(zhì)——苯酚/氯仿/蛋白酶KRNA污染——RNase

其他DNA——區(qū)別變性與復(fù)性

有機(jī)溶劑——萃取、乙醇沉淀與洗滌金屬離子——乙醇沉淀與洗滌1.2核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求

核酸樣品不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子其他生物大分子的污染應(yīng)降到最低程度排除其他核酸分子的污染1.3核酸提取的一般過程

破碎細(xì)胞（防止核酸酶的作用）

破碎抽提核酸(裂解細(xì)胞釋放內(nèi)容物)——關(guān)鍵步驟

核酸的純化除去雜質(zhì)（蛋白質(zhì)、脂類、核酸）4°C最正確和最簡單；-70°C是長期保存的良好溫度，為一次性保存；-20°C

核酸樣品的保存（主要條件時溫度和介質(zhì)）-TE緩沖液最常用

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2.質(zhì)粒DNA的提取及純化——堿變性提取法（堿裂解/變性法）RNase消化及酚-氯仿抽提

2.1質(zhì)粒DNA的制備方法

質(zhì)粒(Plasmid)是獨(dú)立存在于染色體外、能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，分布于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動植物細(xì)胞中，但在細(xì)菌細(xì)胞中含量最多。細(xì)菌質(zhì)粒大小介于1～200Kb之間，是應(yīng)用最多的質(zhì)粒類群，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)它們利用宿主細(xì)胞的復(fù)制機(jī)構(gòu)合成質(zhì)粒自身的DNA。

提取和純化質(zhì)粒DNA的方法好多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB-氯化銫密度梯度離心法和Wizard法等。其中，堿變性提取法最為經(jīng)典和常用，適于不同量質(zhì)粒DNA的提取。該方法操作簡單，易于操作，一般試驗(yàn)室均可進(jìn)行。提取質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于酶切、序列測定及分析。EB-氯化銫密度梯度離心法，主要適合于相對分子質(zhì)量與染色體DNA相近的質(zhì)粒，具有純度高、步驟少、方法穩(wěn)定，且得到的質(zhì)粒DNA多為超螺旋構(gòu)型等優(yōu)點(diǎn)，但提取成本高，需要超速離心設(shè)備。少量提取質(zhì)粒DNA還可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的質(zhì)粒DNA中常含有RNA，但不影響限制性核酸內(nèi)切酶的消化、亞克隆及連接反應(yīng)等。在實(shí)際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)以及質(zhì)粒DNA的用途進(jìn)行選擇。本試驗(yàn)選擇堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。

提取原則：①盡量保持核酸的完整性，即保持自然狀態(tài)，防止核酸酶對核酸的降解（生物損傷），也要防止化學(xué)因素（酸、堿等）或物理因素（高溫、機(jī)械剪切等）引起核酸變性或破壞。②最大限度減少染色體DNA的污染，去除RNA、可溶性蛋白質(zhì)雜質(zhì)。2.2堿裂解法

堿裂解/堿變性法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，是基于染色體DNA（線性DNA）與質(zhì)粒DNA（超螺旋DNA）的變性與復(fù)性的條件差異而達(dá)到分開目的。質(zhì)粒DNA具特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)，在特別的環(huán)境條件下，如加熱、極端pH值、有機(jī)溶劑、尿素、酰胺試劑等會導(dǎo)致質(zhì)粒DNA變性，去除變性條件又可以使DNA復(fù)性。堿裂解法根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分開質(zhì)粒DNA。在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，質(zhì)粒DNA以共價閉合環(huán)狀形式存在。SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能裂解細(xì)菌細(xì)胞，又能使細(xì)菌蛋白質(zhì)變性。SDS處理細(xì)菌細(xì)胞后會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁破碎，從而使質(zhì)粒DNA及細(xì)菌基因組DNA從細(xì)胞中同時釋放出來，但兩者變性與復(fù)性所依靠的溶液pH值不同。在pH12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會完全分開。當(dāng)以pH4.8的KAc(或NaAc)高鹽緩沖液調(diào)理其pH值至中性時，由于共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而確鑿，變性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋構(gòu)型，而溶解于溶液中；而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會那么迅速而確鑿，染色體DNA不能復(fù)性而與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)呈白色絮狀沉淀，這種沉淀通過離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分開。溶于上清的質(zhì)粒DNA，可用無水乙醇和鹽溶液，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA與RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀DNA的同時，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNaseA將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過酚/氯仿抽提除去，最終獲得純度較高的質(zhì)粒DNA，之后可再用超離心、電泳、離子交換柱層析等方法進(jìn)一步純化質(zhì)粒。

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總結(jié)：

堅(jiān)韌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜

染色體DNA

RNA、可溶性蛋白質(zhì)

溶菌酶、SDS

變性復(fù)性條件不同

蛋白酶、RNase、有機(jī)溶劑

堿變性法提取質(zhì)粒DNA一般包括三個基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞以擴(kuò)增質(zhì)粒；收集和裂解細(xì)胞；分開和純化質(zhì)粒DNA。

3.細(xì)菌染色體DNA的提取

3.1細(xì)菌基因組DNA特點(diǎn)

細(xì)菌的染色體基因組尋常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成細(xì)菌的染色體相對聚集在一起，形成一個較為致密的區(qū)域，稱為類核（nucleoid）。類核無核膜與胞漿分開，類核的中央部分由RNA和支架蛋白組成，外圍是雙鏈閉環(huán)的DNA超螺旋。染色體DNA尋常與細(xì)胞膜相連，連接點(diǎn)的數(shù)量隨細(xì)菌生長狀況和不同的生活周期而異。在DNA鏈上與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄有關(guān)的信號區(qū)域與細(xì)胞膜優(yōu)先結(jié)合，如大腸桿菌染色體DNA的復(fù)制起點(diǎn)（OriC）、復(fù)制終點(diǎn)（TerC）等。細(xì)胞膜在這里的作用可能是對染色體起固定作用，另外，在細(xì)胞分裂時將復(fù)制后的染色體均勻地分派到兩個子代細(xì)菌中去。有關(guān)類核結(jié)構(gòu)的詳細(xì)狀況目前尚不明白。

具有操縱子結(jié)構(gòu)（有關(guān)操縱子結(jié)構(gòu)詳見基因表達(dá)的調(diào)控一章）其中的結(jié)構(gòu)基由于多順反子，即數(shù)個功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，受同一個調(diào)理區(qū)的調(diào)理。數(shù)個操縱子還可以由一個共同的調(diào)理基因（regulatorygene）即調(diào)理子（regulon）所調(diào)控。

在大多數(shù)狀況下，結(jié)構(gòu)基因在細(xì)菌染色體基因組中都是單拷貝但是編碼rRNA的基因rrn往往是多拷貝的,這樣可能有利于核糖體的快速組裝，便于在急需蛋白質(zhì)合成時細(xì)胞可以在短時間內(nèi)有大量核糖體生成。3.2細(xì)菌染色體DNA提取的原理

基因工程試驗(yàn)所需要的基因組DNA尋常要求分子量盡可能大，以此增加外源基因獲得率，但要獲得大片段的DNA非易事。細(xì)菌基因組是環(huán)狀DNA，在抽提過程中，不可避免的機(jī)械剪切力必將切斷DNA。因此要盡可能地溫柔操作，減少剪切力，減少切斷DNA分子的可能性；分子熱運(yùn)動也會減少所抽提到的DNA分子量，所以提取過程也要盡可能在低溫下進(jìn)行。另外細(xì)胞內(nèi)及抽提器皿中污染的核酸酶也會降解制備過程中的DNA，所以制備過程要抑制其核酸酶的活性。在提取過程中EDTA的作用就是螯合二價金屬離子，起到抑制核酸酶活性的作用。與質(zhì)粒DNA相比選擇瓊脂糖凝膠濃度應(yīng)低。

4.瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA的分開純化

4.1電泳

電泳(electrophoresis)是帶電物質(zhì)在電場中向著與其電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會向相反的電極移動。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場中，其中的電離子會發(fā)生移動，移動的速度可因電離子的大小形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分開、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。

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凝膠電泳技術(shù)操作簡單而迅速，分辯率高，分辯范圍廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠(ethidiumbromide，EB)或SYBRGold染色直接觀測到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。需要的話，這些分開的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的試驗(yàn)。分子生物學(xué)中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以大量不同的構(gòu)型和方位進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠分辯率高，使用于較小分子核酸(5—500bp)的分開和蛋白質(zhì)電泳。它的分辯率十分高，長度上相差1bp或質(zhì)量上相差0.1%的DNA都可以彼此分開，這也是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行DNA序列分析的分子基礎(chǔ)。雖然它能很快地進(jìn)行電泳，并能容納較大的DNA上樣量，但是與瓊脂糖凝膠相比，在制備和操作上繁瑣。瓊脂糖是從海藻中提取的長鏈狀多聚物，由β-D-吡喃半乳糖與3,6-脫水-L-吡喃半乳糖組成，相對分子質(zhì)量為104-105。瓊脂糖加熱至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液體，澆在模版上冷卻后形成凝膠，其凝固點(diǎn)為40-45℃。瓊脂糖凝膠相對于聚丙烯酰胺凝膠分辯率低，但它的分開范圍更大(50至百萬bp)，小片段DNA(50-20000bp)最適合在恒定輕度和方向的電場中水平方向的瓊脂糖凝膠內(nèi)電泳分開。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測定DNA的相對分子質(zhì)量，分開經(jīng)限制酶水解的DNA片段，進(jìn)一步純化DNA等。4.2瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳，以瓊脂糖凝膠為支持物，利用DNA泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，使不同大小的DNA分子根據(jù)分子量而分開，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠(EB)或SYBRGold染色直接觀測到，甚至含量少至20Pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。4.21瓊脂糖

每一個瓊脂糖鏈含有大約800個分子，瓊脂糖聚合鏈形成螺旋狀纖維聚集成直徑20-30nm的超螺旋結(jié)構(gòu)。纖維是半剛性的，瓊脂糖濃度不同，形成的纖維長度不同。固化的時候，螺旋纖維形成三維的篩網(wǎng)，瓊脂糖濃度不同，形成的通道直徑50nm到>200nm，三維結(jié)構(gòu)依靠于氫鍵維持，加熱成液體狀態(tài)就破壞了氫鍵。4.22電泳遷移速率的影響因素

糖凝膠電泳是一種常用的方法，溶液中，核酸在溶液中由于磷酸基而帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率主要取決于下面六個因素：

①樣品DNA分子的大小：電泳時，線性雙螺旋DNA分子是以頭尾位向前遷移的，其遷移速度與分子量（所含堿基）的對數(shù)值成反比，這是由于大分子有更大的摩擦阻力。

②DNA分子的構(gòu)象：分子量一致而構(gòu)象不同的DNA分子，其遷移速率不同。在抽提質(zhì)粒DNA過程中，由于各種因素的影響，使超螺旋的共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA）的一條鏈斷裂，變成開環(huán)DNA(opencircleDNA,ocDNA）分子，假使兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀DNA(LinerDNA）分子。這三種構(gòu)型的分子（圖1-3-1）有不同的遷移率。一般狀況下，超螺旋型（cccDNA)遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的是開環(huán)狀（ocDNA）分子。

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圖1不同構(gòu)象DNA

③瓊脂糖濃度：瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動速度不同。尋常凝膠濃度愈低，則凝膠孔徑愈大，DNA電泳遷移速度越快，即分子量越大，選用的凝膠濃度應(yīng)越小。（分開不同大小DNA片段的適合瓊脂糖凝