《生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)》綜合設(shè)計(jì)性大實(shí)驗(yàn)課件

《生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)》綜合設(shè)計(jì)性大實(shí)驗(yàn)合作性學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)實(shí)施流程及要求課堂理論學(xué)習(xí)：輔導(dǎo)相關(guān)生化大分子提取分離純化基本知識(shí)項(xiàng)目發(fā)布：了解項(xiàng)目內(nèi)容網(wǎng)上預(yù)約：理論自學(xué)——設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案——網(wǎng)上遞交——教師修改及審核——實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目實(shí)施——論文上交——教師批閱——評(píng)分實(shí)驗(yàn)分組：各自組合，最多不超過4人/組，推選組長，負(fù)責(zé)平時(shí)討論、項(xiàng)目方案設(shè)計(jì)及材料收集實(shí)驗(yàn)實(shí)施要求：平時(shí)按各組計(jì)劃時(shí)間分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，組長有義務(wù)指導(dǎo)下組相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，每次實(shí)驗(yàn)必須登記。全班交流：實(shí)驗(yàn)結(jié)束安排課堂討論交流，每組準(zhǔn)備一人匯報(bào)，一人記錄；要求用PPT總結(jié)匯報(bào)項(xiàng)目實(shí)施、實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新、疑難點(diǎn)，其他組學(xué)生質(zhì)疑，教師點(diǎn)評(píng)。指導(dǎo)教師：汪財(cái)生、斯越秀思考題（課前設(shè)疑）1.如何保持生化物質(zhì)的生物活性？一般生化物質(zhì)在堿性條件下容易變性，還是在酸性條件下容易變性？2.一般從天然生物材料制作生化物質(zhì)的過程大體可分為幾個(gè)階段？3.在制備生化物質(zhì)前應(yīng)如何選擇原料？4.什么叫動(dòng)態(tài)吸附和靜態(tài)吸附？它們在應(yīng)用上有何區(qū)別？5.對(duì)酸性物質(zhì)的提取，常在什么條件下進(jìn)行？對(duì)堿性物質(zhì)的提取，常在什么條件下進(jìn)行？對(duì)兩性物質(zhì)的提取，常在什么條件下進(jìn)行？6.以血清球蛋白為例解釋提取制備每步驟的基本原理？7.干燥離子交換劑應(yīng)如何進(jìn)行處理？何謂離子交換劑轉(zhuǎn)型？8.動(dòng)植物總DNA或RNA提取的方法主要有哪些？以豬脾臟DNA提取為例試述每步驟主要原理是什么？如何判斷所提取DNA的純度？9.蛋白質(zhì)濃度測定方法有哪些？如何鑒定所提取蛋白的純度？未知蛋白質(zhì)分子量測定方法有哪些？第一部分

生化物質(zhì)的制備分析

一般從天然生物材料制作生化物質(zhì)的過程大體可分為六個(gè)階段：

1.原料的選擇和預(yù)處理

2.原料的粉碎；3.提取，即從原料中經(jīng)溶劑分離有效成分，制成粗品的工藝過程；4.純化，即粗制品經(jīng)鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、吸附、層析、透析、超離心、膜分離、結(jié)晶等步驟進(jìn)行精制的工藝過程；

利用生化制備技術(shù)從生物材料中獲得特殊的生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酶、激素、核酸等生化產(chǎn)品時(shí)，通常要注意以下幾個(gè)問題：

6.成品及制劑，即半成品或原料藥經(jīng)精細(xì)加工制成片劑、口服液、針劑、凍干劑等供飲用或臨床應(yīng)用的各種劑型。5.干燥及保存；2．在生物材料中，有些化合物含量很低或極微，有的只有1／l0000，甚至更少。制備時(shí)，原材料用量很大，得到產(chǎn)品很少，與投料量相比“虎頭蛇尾”。近年來，用所謂“釣魚法”，利用某些分子特有的專一親和力，將某一化合物從極復(fù)雜的體系中“釣”出來，與其他化學(xué)分離技術(shù)相比具有很大的優(yōu)越性。

3．許多生物活性物質(zhì)，一旦離開了生物體內(nèi)環(huán)境，很易變性及被破壞，應(yīng)十分注意保護(hù)這些化合物生物的活性，常選擇十分溫和的條件，盡可能在較低溫度和潔凈環(huán)境中進(jìn)行。一般來說制備的操作時(shí)間長、手續(xù)較繁瑣。因?yàn)樵S多大分子在分離過程中，過酸、過堿、重金屬離子、高溫、劇烈的機(jī)械作用、強(qiáng)烈的輻射和機(jī)體內(nèi)自身酶的作用，均可破壞這些分子的結(jié)構(gòu)或生理活性。

4．生化分離制備過程幾乎都在溶液中進(jìn)行，各種溫度、pH、離子強(qiáng)度等參數(shù)，對(duì)溶液中各種組成的綜合影響，常常無法固定，有些實(shí)驗(yàn)或工藝的設(shè)計(jì)理論性不強(qiáng)，常帶有很大的經(jīng)驗(yàn)成分。因此，要建立重復(fù)性好的成熟工藝，對(duì)生物材料、各種試劑及其輔助材料等都要嚴(yán)格地加以規(guī)定。

原料選擇和預(yù)處理

選什么樣的原材料應(yīng)視生產(chǎn)目的而定。一般要注意以下幾個(gè)方面:

1．要選擇有效成分含量高的新鮮材料；2．來源豐富易得；3．制造工藝簡單易行；4．成本比較低；5．經(jīng)濟(jì)效果要好。如蛋白質(zhì)原料的選擇

蛋白質(zhì)類生化產(chǎn)品的原料來源有動(dòng)植物組織和微生物等，原則是要選擇富含所需蛋白質(zhì)多肽成分的、易于獲得和易于提取的無害生物材料。

對(duì)天然蛋白質(zhì)生化產(chǎn)品，為提高其質(zhì)量、產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本，對(duì)原料的種屬、發(fā)育階段、生物狀態(tài)、來源、解剖部位、生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主菌或細(xì)胞都有一定的要求，了解這些，可使分離純化工作事半功倍，反之則收效甚微。

2．發(fā)育生長階段

幼年動(dòng)物的胸腺比較發(fā)達(dá)，老齡后逐漸萎縮，因此胸腺原料必須采自幼齡動(dòng)物。

3．生物狀態(tài)

動(dòng)物飽食后宰殺，胰臟中的胰島素含量增加，對(duì)提取胰島素有利，但膽囊收縮素的分泌使膽汁排空，對(duì)膽汁的收集不利。嚴(yán)重再生障礙性貧血癥患者尿中的EPO（erythropoietin,紅細(xì)胞生成素）含量增加。

4．原料來源

血管舒緩素可分別從豬胰臟和豬顎下腺中提取，兩者生物學(xué)功能并無二致，而穩(wěn)定性以顎下腺來源為好，因其不含蛋白水解酶。6.從簡化提純步驟著手如從鴿肝中提取乙?；福鑼?dòng)物饑餓后取材，可減少肝糖原，以簡化純化步驟。7．對(duì)生物技術(shù)產(chǎn)品宿主菌或細(xì)胞的要求

選擇生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主受體菌或細(xì)胞也應(yīng)考慮到后處理的問題。如用大腸桿菌表達(dá)，由于其不能將所表達(dá)的蛋白質(zhì)分泌到體外，故提取時(shí)必須破壁，增加了提取的困難，而且還可能含有毒素類有害因子；

不同的生物體或同一生物體不同的組織，其破碎的難易不一樣，使用的方法也不完全相同。動(dòng)物的臟器組織，常用絞肉機(jī)機(jī)械法粉碎；植物肉質(zhì)組織可以磨碎；許多微生物均具有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，常用自溶、冷熱交替、加砂研磨、超聲波、加壓處理等破碎方法。如果提取的有效成分是體液或細(xì)菌胞外某些多肽激素、酶等，則不需要破碎細(xì)胞。

主要通過機(jī)械力的作用，使組織粉碎。粉碎少量原料時(shí)，可使用高速組織搗碎機(jī)（10000r／min）、勻漿器、研缽、研船等。工業(yè)生產(chǎn)上一般常用的粉碎設(shè)備有電磨機(jī)、球磨機(jī)、萬能粉碎機(jī)、絞肉機(jī)、擊碎機(jī)等。

(一)機(jī)械法

(二)物理法1.反復(fù)凍融法把待破碎的樣品冷至－15～－20℃，使之凝固，然后緩慢地溶解，如此反復(fù)操作，大部分動(dòng)物性的細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆?？梢云扑?。

在細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法。操作時(shí)，將材料投入沸水中，在90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中，使之迅速冷卻，絕大部分細(xì)胞被破壞。

2.冷熱交替法3．超聲波處理法

多用于微生物材料，處理的效果與樣品濃度、使用頻率有關(guān)。用大腸桿菌制備各種酶時(shí)，常用50～100mg／L菌體的濃度，在1KHz～10KHz（千赫茲）頻率下處理10～15min。對(duì)于其他細(xì)菌，則視具體情況而定。操作中注意避免溶液中氣泡的存在，制備對(duì)超聲波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。4.壓破碎法

加氣壓或水壓（如上海高壓勻漿泵廠生產(chǎn)的高壓勻質(zhì)機(jī)），達(dá)20.59～34.32MPa（210～350kgf／cm2）的壓力時(shí)，可使90%以上細(xì)胞被壓碎。多用于微生物酶制劑的工業(yè)制備。

(三)生化及化學(xué)法

1．自溶法

即新鮮的生物材料存放在一定的pH和適當(dāng)溫度下，利用組織細(xì)胞中自身的酶系將細(xì)胞破壞，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來的方法。自溶的溫度，動(dòng)物材料選在0～4℃，微生物材料則多在室溫下進(jìn)行。

自溶時(shí)，需加少量的防腐劑，如甲苯、氯仿等，以防止外界細(xì)菌的污染。因自溶的時(shí)間較長，不易控制，故制造具有活性的核酸、蛋白質(zhì)時(shí)比較少用。2．酶處理法

用外來酶處理生物材料，如溶菌酶（Lysozyme）是專一地破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的酶。如用噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞制造DNA時(shí)，采用pH8的0.1mol／L三羥甲基氨基甲烷（Tris）－0.01mol／L乙二胺四乙酸（EDTA）制成每毫升含2億個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，然后加入100μg—1mg的溶菌酶，在37℃保溫10min，細(xì)菌胞壁即被破壞；還有把蝸牛酶用于酵母細(xì)胞的破碎；用胰酶處理豬腦制備腦安素。用于專一性分解細(xì)胞壁的酶還有纖維素酶（破壞植物細(xì)胞）、細(xì)菌蛋白酶、酯酶、殼糖酶等。3.表面活性劑處理法

表面活性劑的分子中，兼有親脂性和親水性基團(tuán)，能降低水的界面張力，具有乳化、分散、增溶作用。較常用的有十二烷基硫酸鈉(SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉等。

生化物質(zhì)的提取

利用一種溶劑對(duì)不同物質(zhì)溶解度的差異，從混合物中分離出一種或幾種組分的過程稱為提?。╡xtraction），提取又稱萃取或抽提，其含義基本相同。用冷溶劑從固體態(tài)物質(zhì)提取的過程可稱為浸漬（maceration）；用熱溶劑者可稱為浸提（digestion），也稱浸煮

一、物質(zhì)的性質(zhì)與提?。ㄒ唬┪镔|(zhì)的性質(zhì)與提取方法的選擇

選擇合適的溶劑系統(tǒng)與提取條件。

（二）活性物質(zhì)的保護(hù)措施1．采用緩沖系統(tǒng)2．添加保護(hù)劑（半胱氨酸，還原性谷胱甘肽等）3．抑制水解酶的作用(SDS,EDTA)4．其他保護(hù)措施(避免過酸過堿和劇烈攪拌）（三）生化物質(zhì)的提取

一般生產(chǎn)上多用2～3次提取。溶劑用量（L）為生物材料的2～5倍，少數(shù)情況也有用10～20倍量溶劑作一次性提取。目的是節(jié)省提取時(shí)間，降低有害酶的作用。

二、影響提取的因素

（－）溫度（二）酸堿度

（三）鹽濃度

三、提取方法

（一）用酸、堿、鹽水溶液提取（二）用表面活性劑提?。ㄈ┯袡C(jī)溶劑提取

對(duì)酸性物質(zhì)的提取，常在堿性條件下進(jìn)行；對(duì)堿性物質(zhì)的提取，常在酸性條件下進(jìn)行；對(duì)兩性物質(zhì)的提取，則使水溶液的pH值在遠(yuǎn)離該兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)為佳。（三）超臨界氣體的萃取技術(shù)

以氣體為萃取劑，當(dāng)氣體處于超過臨界溫度和臨界壓力時(shí)，呈現(xiàn)一種既非液相又非氣相的流體，兼有液體和氣體的特性。如密度接近于液體，粘度卻接近于氣體，具有良好的溶劑性質(zhì)。

氣體萃取劑必須具有臨界壓力低，臨界溫度接近于室溫，化學(xué)穩(wěn)定性好，價(jià)廉易得等特點(diǎn)。主要有二氧化碳、氮?dú)?、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷等，最常用的是二氧化碳。其方法主要有等溫法和等壓法兩種，借助于壓力或溫度的調(diào)節(jié)分離萃取劑與被萃取物。

該技術(shù)應(yīng)用于酶、不飽和脂肪酸的提?。ㄈ玺~油和卵磷脂的提?。?、精制和回收，也可用于生化產(chǎn)品的溶劑脫除。某些生化產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中，采用了丙酮和甲醇溶劑，欲脫去溶劑又要避免產(chǎn)品的分解，需選擇超臨界氣體提取。與減壓干燥法相比較，前者不多消耗能源，且縮短脫溶時(shí)間。

四、提取液的分離

提取所得到的溶液，需與固體或另一液體分離。溶液與固體的分離，一般處理方法有三種：自然沉降、過濾、離心。

自然沉降是在液體介質(zhì)中，固體自然下沉而分離的過程。當(dāng)混懸液處理量較大，且固體和液體的比重懸殊時(shí)，可用此法。沉降分層后，可用虹吸等方法將液體部分移去。

過濾系利用多孔材料阻留固體，而使液體通過，達(dá)到固體與液體分離的過程。離心是利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的離心力進(jìn)行分離物料的一種操作，其中通過過濾介質(zhì)分離液體和固體者為離心過濾；利用液體比重的大小分離出不同比重的液體者為離心分離；利用液固兩相比重的差異進(jìn)行沉降分離者為離心沉降。生化物質(zhì)的分離純化技術(shù)

生化物質(zhì)分離純化技術(shù)包括：生化產(chǎn)品的分離分析和生化產(chǎn)品的制備。前者主要對(duì)生物體內(nèi)各組份加以分離后進(jìn)行定性、定量鑒定，它不一定要把某組分從混合物中分離提取出來；而后者則主要是為了獲得生物體內(nèi)某一單純組分。

為了保護(hù)目的物的生理活性及結(jié)構(gòu)上的完整性，生物產(chǎn)品的制備中的分離方法多采用溫和的“多階式”方法進(jìn)行，即常說的“逐級(jí)分離”方法。為了純化一種生化物質(zhì)常常要聯(lián)合幾個(gè)，甚至十幾個(gè)步驟，并不斷變換各種不同類型的分離方法，才能達(dá)到目的。因此操作的時(shí)間長，手續(xù)繁瑣，給制備工作帶來眾多影響。親和層析法具有從復(fù)雜生物組成中專一的“釣出”特異生化成分的特點(diǎn)，目前已在生物大分子，如酶、蛋白、抗體和核酸等的純化中得到廣泛應(yīng)用。（一）分離純化原理

（1）根據(jù)分子形狀和大小不同進(jìn)行分離。如差速離心與超離心，膜分離（透析、電滲析）與超濾法，凝膠過濾法。

（2）根據(jù)分子電離性質(zhì)（帶電性）的差異進(jìn)行分離。如離子交換法，電泳法，等電聚焦法。

（3）根據(jù)分子極性大小及溶解度不同進(jìn)行分離。如溶劑提取法，逆流分配法，分配層析法，鹽析法，等電點(diǎn)沉淀法及有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法。（4）根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)的不同進(jìn)行分離。如選擇性吸附與吸附層析法。（5）根據(jù)配體特異性進(jìn)行分離——親和層析法。（二）分離純化的程序和生產(chǎn)設(shè)計(jì)（1）確定制備物的研究目的及建立相應(yīng)的分析鑒定方法；（2）制備物的理化性質(zhì)穩(wěn)定性的預(yù)備試驗(yàn)；（3）材料處理及抽提方法的選擇；（4）分離純化方法的摸索；（5）產(chǎn)物的均一性測定。

1．分離純化初期使用方法的選擇

早期分離純化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法較為有利，這些方法負(fù)荷能力大，分離量多兼有分離提純和濃縮作用，為進(jìn)一步分離純化創(chuàng)造良好的基礎(chǔ)。

早期分離方法的選擇原則是從低分辨能力到高分辨能力，而且負(fù)荷量較大者為合適，但隨著許多新技術(shù)的建立，一個(gè)特異性方法的分辨力愈高，便意味著提純步驟愈簡化，收率愈高，生化物質(zhì)的變性危險(xiǎn)愈少，因此親和層析法，纖維素離子交換層析法、連續(xù)流動(dòng)電泳、連續(xù)流動(dòng)等電聚焦等在一定條件下，也用于從粗提取液中分離制備小量目的物。2．各種分離純化方法的使用程序

生化物質(zhì)的分離都是在液相中進(jìn)行，故分離方法主要根據(jù)物質(zhì)的分配系數(shù)，分子量大小，離子電荷性質(zhì)及數(shù)量和外加環(huán)境條件的差別等因素為基礎(chǔ)。例如純化其一兩性物質(zhì)時(shí)，前一步已利用該物質(zhì)的陰離子性質(zhì)，使用了陰離子交換層析法，下一步提純時(shí)再應(yīng)用其陽離子性質(zhì)作層析或電泳分離便會(huì)取得較好分離效果。

如有些雜質(zhì)在各種條件下帶電荷性質(zhì)可能與目的物相似，其分子形狀與大小與目的物相差較大，而另一些雜質(zhì)的分子形狀與大小可能與目的物相似，但在某條件下與目的物的電荷性質(zhì)不同，在這種情況下，先用分子篩，用離心或膜過濾法除去分子量相差較大的雜質(zhì)，然后在一定pH值和離子強(qiáng)度范圍下，使目的物變成有利的離子狀態(tài)，便能有效地進(jìn)行層析分離。

在安排純化方法順序時(shí)，還要考慮到有利于減少工序，提高效率，如在鹽析后采取吸附法，必然會(huì)因離子過多而影響吸附效果，如增加透析除鹽，則使操作大大復(fù)雜化。如倒過來進(jìn)行，先吸附，后鹽析就比較合理。

3．分離后期的保護(hù)性措施

在分離操作的后期必須注意避免產(chǎn)品的損失，主要損失途徑是器皿的吸附，操作過程樣品液體的殘留，空氣的氧化和某些事先無法了解的因素。為了取得足夠量的樣品，常常需要加大原材料的用量，并在后期純化工序中注意保持樣品溶液有較高的濃度，以防制備物在稀溶液中的變性，有時(shí)常加入一些電解質(zhì)以保護(hù)生化物質(zhì)的活性，減少樣品溶液在器皿中的殘留量。（三）分離純化方法的評(píng)估

每一個(gè)分離純化步驟的好壞，除了從分辨能力和重現(xiàn)性兩方面考慮外，還要注意方法本身的回收率，特別是制備某些含量很少的物質(zhì)時(shí)，回收率的高低十分重要。一般經(jīng)過5～6步提純后，活力回收在25％以上。但不同物質(zhì)的穩(wěn)定性不同、分離難易不同，回收率也不同。

對(duì)每一步驟方法的優(yōu)劣的記錄，體現(xiàn)在所得產(chǎn)品重量及活性平衡關(guān)系上。這一關(guān)系，可通過每一步驟的分析鑒定求出。例如酶的分離純化，每一步驟產(chǎn)物重量與活性關(guān)系，通過測定酶的比活力及溶液中蛋白質(zhì)濃度的比例。其他活性物質(zhì)也可通過測定總活性的變化與樣品重量或體積與測出的活力列表進(jìn)行對(duì)比分析，算出每步的提純倍數(shù)及回收率。

（四）生化產(chǎn)品純度的鑒定

一個(gè)制備物是否純，常以“均一性”表示。均一性是指所獲得的制備物只具有一種完全相同的成分，均一性的評(píng)價(jià)常須經(jīng)過數(shù)種方法的驗(yàn)證才能肯定。有時(shí)某一種測定方法認(rèn)為該物質(zhì)是均一的，但另一種測定方法卻可把它分成兩個(gè)甚至更多的組分，這就說明前一種鑒定方法所得的結(jié)果是片面的。如果某物質(zhì)所具有的物理、化學(xué)等方面性質(zhì)經(jīng)過幾種高靈敏度方法的鑒定都是均一的，那么大致可以認(rèn)為它是均一的。當(dāng)然，隨著更好的鑒定方法的出現(xiàn)。還可能發(fā)現(xiàn)它不是均一的。絕對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)只有把制備物的全部結(jié)構(gòu)搞清楚，并經(jīng)過人工合成證明具有相同生理活性時(shí)，才能肯定制備物是絕對(duì)純凈的。

生物分子純度的鑒定方法很多，常用的有溶解度法，化學(xué)組成分析法，電泳法，免疫學(xué)方法，離心沉降分析法，各種色譜法，生物功能測定法，以及質(zhì)譜法等。第二部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介豬血清γ-球蛋白分離純化及鑒定實(shí)驗(yàn)一、

蛋白質(zhì)的分離純化是研究蛋白質(zhì)化學(xué)及其生物功能的重要手段。不同的蛋白質(zhì)的分子量、溶解度、以及在一定條件下帶電的情況有所不同，可以更據(jù)這些性質(zhì)的差別，分離及提純各種蛋白質(zhì)。1.1內(nèi)容提要免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig）是人體接受抗原刺激后，由漿細(xì)胞所產(chǎn)生的一類具有免疫功能的球狀蛋白質(zhì)，是直接參與免疫反應(yīng)的抗體蛋白的總稱。各種免疫球蛋白能特異地與相應(yīng)的抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物（免疫復(fù)合物），從而阻斷抗原對(duì)人體的有害作用，對(duì)細(xì)菌等抗原的殺傷最后由補(bǔ)體去完成。

γ-球蛋白也稱為丙種球蛋白，相對(duì)分子量為15-16萬，沉降系數(shù)為7S；是一組在結(jié)構(gòu)與功能上有密切關(guān)系蛋白質(zhì)。楊據(jù)Ig的免疫化學(xué)特性，可分為五大類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，其分子不論哪一類，都由四鏈組成，即由兩條相同的長多肽鏈稱H鏈（又稱重鏈）及兩條相同的短肽鏈稱L鏈（又稱輕鏈）組成。機(jī)體大部分免疫功能力都依賴于IgG類免疫球蛋白，它約占免疫球蛋白總量的70-90%。IgG是人和動(dòng)物血漿蛋白的重要組分之一，制備γ-球蛋白的原料通常用動(dòng)物血液，其次還有動(dòng)物胎盤和初乳乳清。制備方法有低溫乙醇法、利凡諾法、鹽析法、離子交換法等。

1.2實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)掌握免疫球蛋白（IgG

）的原理和方法

掌握利用紫外法、單向免疫擴(kuò)散法等測定IgG含量的方法掌握SDS電泳法鑒定蛋白質(zhì)純度及測定分子量方法掌握層析、透析、膜分離、電泳等生化分離鑒定技術(shù)的應(yīng)用及操作1.3實(shí)驗(yàn)要求掌握的技術(shù)柱層析分離技術(shù)SephadexG-25分子篩層析DEAE-Cellulose離子交換層析

蛋白質(zhì)提取技術(shù)硫酸銨鹽析、透析、膜分離技術(shù)等蛋白質(zhì)含量測定消光系數(shù)法、FOLin酚法測定IgG蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)分子量、純度、活性測定SDS電泳法檢測、單向免疫擴(kuò)散法豬脾臟DNA提取及含量鑒定實(shí)驗(yàn)二、2.1內(nèi)容提要

為了研究DNA分子在生命代謝中的作用，常常需要從不同的生物材料中提取DNA.由于DNA分子在生物體內(nèi)的分布及含量不同，要選擇適當(dāng)?shù)牟牧咸崛NA。動(dòng)植物中，小牛胸腺、動(dòng)物肝臟、魚類精子，植物種子的胚中都含有豐富的DNA。微生物中，谷氨酸菌體含7%－10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大腸肝菌含9%－10%。從各種材料中提取DNA方法不同，分離提取的難易程度也不同。對(duì)于低等生物。如從病毒中提取DNA比較容易，多數(shù)病毒DNA分子量較小，提取時(shí)易保持其結(jié)構(gòu)完整性。從細(xì)菌及高等動(dòng)植物中提取DNA難度大一些。細(xì)菌DNA分子量較大，一般達(dá)2×10道爾頓。因此易被機(jī)械張力剪斷。細(xì)菌DNA，除核DNA外，還有質(zhì)粒DNA等。小牛胸腺

肝臟

魚類精子種子胚胎谷氨酸菌體（7%~10%）面包酵母（4%）

啤酒酵母（6%）

大腸肝菌（9%~10%）來源動(dòng)物

植物

微生物2.1.1

DNA的基本功能生物遺傳信息復(fù)制的模板和基因轉(zhuǎn)錄的模板；

是生命遺傳繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動(dòng)的基礎(chǔ)；

作為DNA分子中的某一區(qū)段，有復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等主要功能稱為基因。核酸（Nucleicacid）是以核苷酸為基本組成生物大分子。天然存在的核酸有兩類，一類為脫氧核糖核酸Deoxyribonucleicacid，DNA)，另一類為核糖核酸(Ribonucleicacid，RNA)。DNA存在于細(xì)胞核和線粒體中，攜帶遺傳信息。RNA存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，參與細(xì)胞內(nèi)DNA遺傳信息的表達(dá)。2.1.2核酸的結(jié)構(gòu)與功能

天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取DNA時(shí)，先把DNP抽提出來，再把P除去，再除去細(xì)胞中的糖，RNA及無機(jī)離子等，從中分離DNA。2.1.3DNA存在形式2.1.4核酸的理化性質(zhì)

RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。酸性溶液中，DNA、RNA易水解，中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取DNA時(shí)，先把DNP抽提出來，再把P除去，再除去細(xì)胞中的糖，RNA及無機(jī)離子等，從中分離DNA。DNP和RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響而不同。DNP在低濃度鹽溶液中，幾乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化鈉溶解度最低，僅為在水中溶解度的1%，隨著鹽濃度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化鈉中的溶解度很大，比純水高2倍。RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在0.14mol/L氯化鈉中溶解度較大。因此，在提取時(shí)，常用此法分離這兩種核蛋白。2.1.5

細(xì)胞的破碎細(xì)菌有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，首先要破碎細(xì)胞。方法有三種：①機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；②化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞；③酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，都可使細(xì)胞壁破碎。由于高等動(dòng)物DNA主要存在于細(xì)胞核與線粒體中，所以提取時(shí)