鑒定與檢測優(yōu)秀公開課件

細菌的鑒定與檢測

細菌遺傳學與基因工程

醫(yī)學細菌學

微生物工程

細菌的鑒定與檢測1.活菌檢測2.免疫吸附分離法3.噬菌體檢驗第一節(jié)植物病原細菌檢疫檢驗技術abcde

24hpi36hpi72hpi96hpi132hpi水稻細菌性條斑病菌接種水稻葉片WheatbacterialblackChaffSelectivemedium在培養(yǎng)基中加入某種化學物質，使之抑制某些細菌生長，而有利于另一些細菌生長，從而將后者從混雜的標本中分離出來differentialmedium利用各種細菌分解糖類和蛋白質的能力及其代謝產物不同，在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物和指示劑，一般不加抑菌劑，觀察細菌在其中生長后對底物的作用如何，從而鑒別細菌。如常用的糖發(fā)酵管、三糖鐵培養(yǎng)基、伊紅-美藍瓊脂等。

分離鑒定進口玉米枯萎病菌的選擇性培養(yǎng)基黑色素培養(yǎng)基菌落中心黑色邊緣透明、圓形、表面光滑。這一特異性狀是其他選擇性培養(yǎng)基所沒有的，也是與其他細菌區(qū)分的重要標志。選用酵母浸膏的主要原因是它含有多種氨基酸、維生素和礦物質營養(yǎng)元素，對玉米枯萎菌生長有促進作用；甘油作碳源是合適的，因為它是很多細菌的不良碳源；牛膽酸鈉能夠抑制部分革蘭氏陽性和陰性細菌，對枯萎菌生長無害；利用枯萎菌耐鹽的特點，加大鹽的用量，抑制了部分不耐鹽的細菌；選用水溶黑色素作培養(yǎng)基成份，主要是使枯萎菌吸收黑色素，形成獨特的特異性狀，便于區(qū)分不同細菌。選擇性較高、菌落容易辨認、抑制真菌效果好、平板效率較高。Ironsulphiteagarforthermophilicanaerobedetection鐵亞硫酸鹽瓊脂對嗜熱厭氧菌檢測enterobacteriaenrichmentbrothmossel腸道菌增菌肉湯培養(yǎng)基selectivemediumfortheisolationofentericpathogensparticularlySalmonellaandShigellaspecies.腸道致病菌：沙門氏菌和志賀菌屬CulturemediaSelectiveisolationClostridiumperfringensTSCagar選擇性分離產氣莢膜梭菌Oxoid

Brilliance

E.coli/coliformSelectiveAgarnowallowsimprovedconfirmationofE.colidirectlyoncultureplateSalmonellaGrowingOnXLDAgar沙門氏菌2.免疫吸附分離法原理：結合血清學與平板分離技術，利用與抗原高度親和性的抗體，來捕獲目標細菌，樣本中其他細菌均被沖洗掉，再將目標細菌轉移或釋放到培養(yǎng)基上生長。方法：平皿免疫吸附評價測定法和免疫吸附稀釋培養(yǎng)法

細菌細胞表面具有蛋白質、脂多糖（LPS）和胞外多糖等抗原分子，利用多克隆抗血清可以鑒定細菌的種。雜交瘤技術的發(fā)展為單克隆抗體（MAbs）的制備提供了方向；該技術很快被用于制備病原細菌的單克隆抗體，進行病菌特異性和流行學研究。包括凝集檢驗（agglutinationassays）、ELISA、Westernblot、免疫熒光（immunofluorescence，IF）或免疫熒光菌落染色（immunofluorescencecolony-staining，IFC）以及側流方法（lateralflowdevices）在內的單克隆抗體和多克隆抗血清對多種形式的檢測應用是有效的。2.免疫吸附分離法凝集檢驗：人畜共患病之布氏桿菌凝集試驗：待測血清中抗布氏桿菌抗體與膠乳試劑相遇，發(fā)生抗原-抗體反應，出現(xiàn)肉眼可見的凝集反應。試劑：羊、牛、豬三型診斷菌液。操作方法：待檢血清（用生理鹽水作1∶25、1∶50、l∶100、1∶200、1∶400、l∶800倍稀釋）0.5ml，分別加診斷菌液0.5ml，混勻。37℃水浴16～20h觀察結果。標準：非流行區(qū)凝集效價一般大于1:80有診斷意義;流行區(qū)和牧民區(qū)凝集效價在1:160以上才有診斷意義

ELISA：多數(shù)病原細菌MAbs的制備開始都是通過ELISA方法篩選的，然后再用其它免疫診斷檢測驗證(用于番茄潰瘍病菌（C.

michiganensissubsp.michiganensis

）和番茄細菌性斑點病菌（X.axonopodispv.vesicatoria）的檢測)ELISA1971年Engvall和Perlmann發(fā)表的酶聯(lián)免疫吸附劑測定enzymelinkedimmunosorbentassay原理：使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。免疫熒光（IF）抗體法：將熒光染料（異硫氫酸熒光黃或羅丹明）與抗體以化學方法接合，再與抗原反應，形成有熒光標記的抗體—抗原復合物，在熒光顯微鏡下，可觀察到黃綠色熒光。

IF在歐洲被廣泛用于種子和繁殖材料中病原細菌的檢測。

(荷蘭-馬鈴薯褐腐病的青枯菌（R.solanancearum）法國-馬鈴薯環(huán)腐棒形細菌（C.michiganensissubsp.sepedonicus）;番茄種子中的細菌性潰瘍病菌（C.michiganensissubsp.michiganensis）)免疫熒光（IF）抗體法直接法：用特異熒光抗體直接滴加于標本上，使之與抗原發(fā)生特異性結合。本法操作簡便，特異性高，非特異熒光染色因素少缺點是敏感度偏低，每檢查一種抗原需制備相應的特異熒光抗體。

免疫熒光（IF）抗體法補體結合法本法：是間接法的第一步抗原抗體反應時加入補體（多用豚鼠補體），再用熒光標記的抗補體抗體進行示蹤。本法敏感度高，且只需一種抗體。但易出現(xiàn)非特異性染色，加之補體不穩(wěn)定，每次需采新鮮血清，操作復雜，因此較少應用。

免疫熒光（IF）抗體法標記法：本法用fitc及羅丹明分別標記不同的抗體，而對同一標本作熒光染色。在有兩種相應抗原存在時，可同時見到橙紅和黃綠兩種熒光色澤。免疫磁性分離3.噬菌體檢驗原理：噬菌體侵染細菌，裂解寄主細胞。在液體培養(yǎng)時，會使渾濁的細菌懸浮液變清，在固體平板上培養(yǎng)，則出現(xiàn)許多邊緣整齊、透明光亮的噬菌斑。噬菌體具有?；?，利用此特點，可鑒別細菌的種類。非活菌檢測非活菌檢測的方法很多，下表是檢測病原細菌常用的一些方法，前9種血清學方法，均屬非活菌檢測。它們既能用于病原鑒定，又能直接用于病種或病株，甚至是無癥感染組織的檢測。常規(guī)PCRMullis等在1985年創(chuàng)立的PCR方法靈敏、準確、方便、快速，可在短時間內擴增出數(shù)百萬個特異DNA序列的拷貝。目前研究人員已在檢測種子帶菌方面應用PCR技術做了大量工作，設計得到了大量相關引物。例如，菜豆暈疫病（Pseudomonassyringaepv.phaseolicola），番茄細菌性潰瘍病（CMM）等。多種以PCR為基礎的分析方法，比如，以rDNA為模板的PCR：ITS-PCR、tRNA-PCR等都已經出現(xiàn)。免疫PCR（Immuno-PCR)1992由SanoT.等最早使用將血清學中抗原-抗體反應的特異性與PCR的強特異擴增能力結合起來，可以在短時間內精確的檢測某一病原物是否存在。原理是：用一段具體的DNA分子標記抗體，應用此抗體去檢測抗原，PCR擴增此段DNA分子，根據(jù)擴增產物存在與否判斷抗原是否存在。根據(jù)反應物的不同，目前可將免疫PCR分為單分析物免疫PCR、多分析物免疫PCR、單引物免疫PCR、和雙引物免疫PCR。免疫磁性分離-PCR

（ImmunomagneticSeparationandPolymeraseChainReaction,IMS-PCR）是磁性微球（magneticmicrosphere，MMS）載體表面通過化學或物理方法連接上具有一定免疫活性的物質作為配體而研制成的。IMS-PCR的特點是對目的菌進行了二步檢測，一是血清的作用，二是是PCR的作用。在檢測西瓜細菌性果斑病的試驗中R.R.Walcott等證明了IMS-PCR的靈敏度比直接PCR高100倍，而且不受PCR抑制因子的影響。實時PCR實時熒光定量PCR（real-timefluorescentquantitativePCR）的出現(xiàn)，成為DNA或RNA檢測方法的又一突破性進步。它實現(xiàn)了PCR檢測從定性到定量的飛躍，運用由計算機控制的新型、便攜設備進行自動化操作，使檢測結果更加具有準確性、專一性和可重復性，已開始在醫(yī)學、生物學和諸多農業(yè)科研領域中廣泛使用。實時PCR儀器LightCyclerTM(RocheDiagnostics公司)RAPID（ruggedizeadvancedpathogenidentificationdevice，IdahoTechnologies公司）SmartCycler?TD（Cepheid公司）iCycleriQTM（Bio-Rad公司）MX4000TM（Stratagene公司）RotorGene（CorbettResearch公司）ABI7700和GeneAmp5700?（AppliedBiosystems公司）大多設備能真正做到在每個循環(huán)實時監(jiān)測熒光、收集數(shù)據(jù)。RAPID和SmartCycler?則是手提式設備。SmartCyclerTD的設計最為獨特，它含有16個由微處理器控制的I-CORE?（intelligentcooling-heatingopticalreaction）模塊，可以同時進行16個不同的PCR反應。ABI7700型TheportableSmartCyclerTD.RAPIDABI7900型GeneAmp5700LightCycler實時熒光定量PCR的特點

實時PCR與傳統(tǒng)PCR相比，有許多優(yōu)勢：1、不需Southern雜交鑒定PCR產物。2、全能性更強，減少了交叉污染的可能性。3、需要的勞動力較少。4、易于操作。5、自動提供引物選擇所需的數(shù)據(jù)。6、快速優(yōu)化反應條件。7、可以用于多重PCR。DrivetothefieldRemovediseasedtissuesampleDrivetothelabincubatetissuein50μLwaterfor20min.add1μLsampletoreactiontuberunPCRfor20min.togetresults實時PCR應用N.W.Schaad等使用手提式SmartCyclerSC系統(tǒng)（Cepheid,Sunnyvale,CA）對西瓜中的西瓜細菌性果斑病菌（Acidovoraxavenaesubsp.citrulli）、蠶豆中的菜豆假單胞菌（Pseudomonasphaseolicolapv.Phaseolicola）、馬鈴薯中的青枯菌（Ralstoniasolanacearum）進行了快速檢測。實時PCR應用對于馬鈴薯青枯病菌（Ralstoniasolanacearum）D.E.Stead等人發(fā)現(xiàn)用實時PCR技術在馬鈴薯組織中檢測青枯菌生理小種2h仍比較靈敏，針對不同小種或生理小種設計的特異引物/探針組合可以提高反應的專一性。實時PCR應用類似地，2000年，Weller等也在檢測馬鈴薯塊莖中的青枯菌時借助7700測序系統(tǒng)和TaqMan?系統(tǒng)，分別用種的16s探針和生理小種2的特異性探針，成功地檢測到了濃度為100CFU/ml的青枯菌純培養(yǎng)。M.T.Kingsley設計了0.554KbSCAR（sequencecharacterizedamplifiedregion）片段，該片段來自于柑橘黃單胞菌（Xanthomonascitri）3213菌株RAPD擴增子，鑒于它的唯一性，可將其作為熒光PCR擴增子的潛在來源。用TaqManTM對來自全球的36個X.c.菌株進行測定，均呈陽性。而其他12種異源DNA則呈陰性。N.W.Schaad等人首次將實時熒光PCR應用到皮爾斯葡萄葉燒病病菌（Xylellafastidiosa）的快速檢測當中，直接以不顯癥的樹藤作為樣本，克服了在發(fā)病初期不易發(fā)現(xiàn)和分離該菌的困難，并詳細介紹了該菌的特異探針、引物及反應條件的設計方法，具有較高的參考價值。第三節(jié)植物病害鑒定與檢測實例FireblightofpearStewart’sbacterialwiltofcornCitrusHuanglongbingCoconutLethalYellowing梨火疫病

Fireblightofpear1878年首先由Burrill描述，在紐約發(fā)生，后由Erwin命名，是第一個被確定的植物細菌病害。主要分布于北美洲于西北歐，中歐、地中海、東南歐及大洋州和亞洲也有分布。大約40多個國家。梨火疫病的地理分布寄主：

梨火疫病菌寄主范圍很廣，能為害梨、蘋果、山楂、木旬子、李等40多個屬220多種植物，大部分屬薔薇科危害性：

仁果類果樹的一種毀滅性病害。一棵多年生的梨和蘋果樹發(fā)病后可在幾星期內死亡。癥狀：侵害花、果實、枝條和葉片。花：侵染后變深褐色，枯萎。葉片：從葉緣沿葉脈擴展，先呈水浸狀，后黑褐色。嫩稍：先水浸狀，后褐色至黑色，向下彎曲，呈魚鉤狀。果實：病部褐色凹陷，擴展到全果，潮濕時病部生粘稠的細菌溢，初乳白色，后紅褐色。病枝：葉片凋萎，幼果僵化，但病葉病果不脫落，遠望似火燒狀，故稱火疫病。傷口：初期水浸狀，后下陷，呈潰瘍斑，病健交界處產生龜裂紋，韌皮部紅褐色，有黏液狀菌膿。嚴重時，病害從嫩稍很快擴展到枝條、主干，直至根部，全株死亡。Pearfireblight,

ErwiniaamylovoraAdvancedfireblightonfruit-notebacterialoozeonfruit.主要鑒定特征：梨火疫病最典型的癥狀是花、果實和葉片受火疫病菌侵害后，很快變黑褐色枯萎，猶如火燒一般，但仍掛在樹上不落，故此得名。目前國際上將其癥狀據(jù)受侵害的部位，分成５個階段。

（1）花枯萎：侵染開放的花引起花枯萎。一般發(fā)生于早春，病菌直接從花器侵入，初為水漬狀斑，花基部或花柄暗色，不久萎蔫。（2）潰瘍枯萎：是指前一季越冬潰瘍邊緣的病菌重新復活的結果。（3）枝枯萎：細菌直接侵入前1～3葉的枝尖，然后殺死整個枝條及支持枝。（4）病菌亦可直接從氣孔、水孔等自然孔口或蕾苞，或由風引起的傷口侵入葉片，初葉邊壞死，并向中脈、中柄、莖擴展，后變黑，通常有菌膿。（5）損傷枯萎和砧木枯萎：前者主要是由于晚霜、冰雹或大風損傷引起，如果實很容易引起果實枯萎。后者僅限于高感品種EMAL-26、EMLA-9和MARK-39砧木。通常是由感病的接穗在這些砧木上發(fā)病后引起，最終成潰瘍帶而殺死樹體。

病原菌：

學名：Erwiniaamylovora（Burrill）Winslow

異名：MicrococcusamylovorusBurrilBacillusamylovorus(Burrill)TrevisanBacteriumamylovorus(Burrill)Chester

分類地位：原核生物界(Procaryotes),薄壁菌門(Gracilicutes),腸桿菌科(Enterobacteriaceae)歐文氏菌屬(Erwinia)解淀粉歐文氏菌

形態(tài)特征：直桿菌，有莢膜，周生鞭毛，能運動，大小為0.9-1.8×0.6-1.5μm，多數(shù)單生，有時成雙或短時間內3-4個呈鏈狀。革蘭氏染色陰性。在蔗糖培養(yǎng)基上27℃下培養(yǎng)3d，菌落直徑3～4mm，白色至奶油色，半球形隆起，有黏性，表面光滑，邊緣整齊，中心絨環(huán)狀。

生物學特性：兼性厭氧，過氧化物酶陽性，氧化酶陰性，好氣條件下利用葡萄糖產酸不產氣，厭氧條件產酸緩慢。明膠碟形液化緩慢。不產生硫化氫，不利用丙二酸鹽。葡萄糖酸鹽氧化和七葉苷水解不穩(wěn)定。氯化鈉濃度高于2％以上時生長延緩，至6％－7%時則完全抑制?？骨嗝顾?，對氯霉素、鏈霉素和土霉素敏感。細菌生長的溫度范圍6～37℃，最適溫度25～27.5℃，致死溫度45～50℃，10min，最適酸堿度為pH6.0。

梨火疫病菌以簡單的細胞分裂繁殖，一個細胞在條件適宜時，３天內在寄主植物組織中能達到109細胞，每個細胞都是一個侵染源，感染寄主而引起病害的發(fā)展。除蛋白酶外，病菌不產任何有助于侵入寄主的酶，主要是在環(huán)境條件適宜時，通過胞間組織侵入薄壁組織的病菌產生胞外多糖。

胞外多糖在病害發(fā)展過程中起重要的作用，其是菌膿的重要成份。

菌膿的理化性質隨濕度變化而變化，干時皺、硬，大時膨脹易被雨水擴散，中等濕度的菌膿粘易被昆蟲、風傳播。發(fā)病規(guī)律：

病菌在病株病疤邊緣組織處越冬，掛在樹上的病果也是越冬場所，如果冬季溫和，病菌還能在病株樹皮上度過，來年早春病菌在上年的潰瘍處迅速繁殖，遇到潮濕、溫和的天氣，從病部滲出大量乳白色粘稠狀的細菌分泌物，即為當年的初侵染源，通過昆蟲、雨滴、風、鳥類以及人的田間操作將病菌傳給健株。病菌亦通過傷口、自然孔口（氣孔、蜜腺、水孔）、花侵入寄主組織，有一定損傷的花、葉、幼果和茂盛的嫩枝最易感病。傳播途徑

近距離傳播：雨水是果園短距離傳播的主要因子，其次風亦是中短距離傳播的重要因子，往往在沿著盛行風的方向，病原菌被風攜帶到較遠距離。除次之外，昆蟲對病菌的傳播擴散起一定的作用。傳病昆蟲包括蜜蜂在內有77個屬的100多種昆蟲，其中密蜂的傳病距離約為200~400m。遠距離傳播：主要是感病寄主繁殖材料，包括種苗、接穗、砧木、水果、被污染的運輸工具、候鳥等。梨火疫病的遠距離傳播發(fā)生條件：

受傷的花朵、幼果和嫩稍最易受病菌侵染。經冰雹襲擊，病害蔓延更加迅速。較高氣溫（18～24℃）和較高的濕度（70％以上）有利于病菌侵染。檢驗方法：

1.產地檢驗：

2.癥狀觀察：梨火疫病的癥狀很典型，是鑒定的重要方法，但必須與其他癥狀相似的梨梢枯病區(qū)分開。梨梢枯病僅限于危害花器、葉片和嫩梢，不危害枝條和莖干，病部無細菌溢膿，葉片上最初為深褐色斑點，周圍有紅色暈圈，枯死的病葉不會長期掛在樹上3.分離培養(yǎng)

可采用選擇性培養(yǎng)基和鑒別性培養(yǎng)基進行。

MS培養(yǎng)基菌落為紅橙色，背景為蘭綠色。配方：瓊脂20g，甘露醇10g，L-天門冬酰胺3g，牛膽酸鈉2.5g，磷酸氫二鉀2.0g，煙酸0.5g，MgSO4·7H2O0.2g，次氮基三乙酸0.2g，硫酸十七烷基鈉0.1ml，0.5%溴麝香草酚蘭水溶液9ml，0.5%中性紅2.5ml，蒸餾水970ml，pH7.3滅菌后加1%放線菌酮5ml，1%硝酸銫水溶液1.75ml。

CG培養(yǎng)基在29℃培養(yǎng)48小時后形成典型的火山口狀菌落。配方：水380ml，蔗糖160g，營養(yǎng)瓊脂12g，結晶紫0.8ml（1%乙醇溶液），0.1%放線菌酮20ml。TTC培養(yǎng)基：該培養(yǎng)基是Weise(1981)設計的四氮銼-福美聯(lián)培養(yǎng)基。梨火疫病菌在27℃培養(yǎng)2～3天后，可產生紅色肉疣狀菌落。配方：營養(yǎng)瓊脂37g，蔗糖100g，酵母粉5g，葡萄糖15g,水100ml，pH6.8～7.2。滅菌后加0.5%TTC10ml，福美聯(lián)85～250ml。CCT半選擇性培養(yǎng)基：Tshimaru和Kios于1984設計的。梨火疫病菌28℃培養(yǎng)48小時后，形成淡紫色透明菌落，中央顏色略深。配方：蔗糖10g；山梨醇10g；1%SDS30ml，0.1%結晶紫乙醇溶液2ml，營養(yǎng)瓊脂23g，蒸餾水970ml。滅菌后加入1%硝酸銫水溶液2ml和放線菌酮0.05g。Zeller改良高糖培養(yǎng)基：梨火疫病菌在此培養(yǎng)基上27℃培養(yǎng)2～3天后，菌落大小為3～7mm，橙紅色半球形，高度凸起，中心色深，有蛋黃狀中心環(huán)，表面光滑，邊緣整齊。配方：牛肉浸膏8g，蔗糖50g，放線菌酮50mg，0.5%溴百里酚蘭9ml，0.5%中性紅2.5ml，瓊脂20g，水1000ml，pH7.4。4.致病性實驗

梨火疫病菌致病性試驗可用梨片或梨嫩枝測定，亦可用煙草過敏反映檢查。NA上培養(yǎng)48小時的細菌配成108cells/ml的懸液，注入煙草葉片或接種于1cm厚梨片、或針刺接種于１丈長的枝條，28℃下培養(yǎng)，一般10~12小時后，煙草注射區(qū)出現(xiàn)白色壞死斑。1~3天后，梨片或枝條上出現(xiàn)白色菌膿，則可確診。5.血清學檢驗：免疫熒光、ELISA、ODD和凝集實驗6.分子生物學方法：核酸探針和PCR技術玉米細菌性枯萎病

Stewart’sbacterialwiltofcorn分布：1889年紐約首先報道，現(xiàn)已20多個國家。分布于美國、加拿大、墨西哥、越南、泰國、馬來西亞、前蘇聯(lián)、波蘭、瑞士、意大利、前南斯拉夫、羅馬尼亞、希臘、、哥斯達黎加、波多黎各、圭亞那、秘魯、巴西。寄主植物

主要是甜玉米，也侵染馬齒玉米、粉質玉米、硬粒玉米和爆裂玉米。危害：維管束病害、毀滅性病害。癥狀：整個生育期都可危害，以開花期癥狀最明顯。早期癥狀表現(xiàn)為植株矮化，萎蔫，雄穗退色早枯，葉片邊緣產生波紋狀不規(guī)則病斑。初期水浸狀，黃色，與葉脈平行，貫穿全葉，寬1～10mm，嚴重時病葉萎蔫死亡。生長后期，葉片產生許多小病斑，結合成大塊，火燒狀干枯死亡。髓部有空腔，導管被黃色黏液阻塞，萎蔫植株的下部切口有黃色細菌溢膿。果穗的菌膿可通過內層包葉的氣孔滲出，籽粒表面沾滿細菌菌膿，病籽粒變形、皺縮和變色。Necroticlesionsonmatureleaves;secondphaseofStewart'swiltdisease.病原菌：玉米細菌性枯萎病菌學名

Pantoeastewartii(Smith)Mertaertetal.

異名

Erwiniastewartii(Smith)Dye；

PseudomonasstewartiiSmith;Apalnobacterstewartii(Smith)McCulloch;Bacillusstewartii(Smith)Holland;Bacteriumstewartii(Smith)Smith;Phytomonasstewartii(Smith)Bergyeetal;Pseudobacteriumstewartii(Smith)Hrasil’nikov,1949;Xanthomomasstewartii(Smith)Dowson

英文名

Stewart’sbacterialwiltofcorn

分類地位

原核生物界(Procaryoces)，薄壁菌門(Gracilicutes)，腸桿菌科(Enterobacteri-aceae)，泛菌屬(Pantoea)形態(tài)特征：好氣性短桿菌，兩端鈍圓，無鞭毛，有莢膜，G－，單生或雙生，0.4~0.8×0.9~2.2?。在牛肉膏培養(yǎng)基上形成黃色圓形菌落，全緣，表面扁平光滑，能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、木糖、甘油鶴甘露糖、醇等產酸，但不產生氣體。在肉湯培養(yǎng)液中生長微弱，形成灰色環(huán)和黃色沉淀物。細菌生長溫度最低溫度8～9℃，最適溫度30℃，最高溫度39℃，致死溫度53℃10min，適宜pH4.5～8.5，最適6.0～8.0。發(fā)病規(guī)律：初侵染來源——帶菌的種子和昆蟲。土壤和病原殘體不能越冬，昆蟲是病原細菌的傳播介體和重要的越冬場所。最重要的傳病昆蟲是玉米葉甲，它以成蟲帶菌越冬，細菌存在于消化道中。越冬后在早播玉米苗上取食，引起初侵染，并產卵發(fā)育成新一代成蟲，繼續(xù)向其它植株傳病。Cornfleabeetle(Chatocnemapulicaria)vectoroftheStewart'swiltbacterium(Pantoeastewartii).流行條件：發(fā)病與流行主要決定于冬季氣溫（12、1、2月）的高低，若平均氣溫總和在37℃以上，有利蟲媒越冬，帶菌昆蟲成活率高，有可能引起發(fā)病。低于32℃則很少流行。此外有利于發(fā)病的條件包括土壤氮肥水平偏高，鉀肥水平偏低，高溫高濕等。檢驗方法：產地檢驗：種植檢驗：種子長出的植株有明顯的癥狀。3.分離培養(yǎng)：采用伊凡諾夫選擇培養(yǎng)基，其成分如下：甘油30ml檸檬酸鐵銨10g磷酸氫二鉀2.5g,氯化鈉15g硫酸鎂0.1g,瓊脂17g氯化鈣0.1g,蒸餾水1000ml,pH7.0

為了抑制雜菌的污染,還可采用選擇性黑色素培養(yǎng)基,其成分如下:酵母浸膏1g甘油30ml制霉菌素200mg/ml牛膽酸鈉3g氯化鈉15g1%水溶性黑色素20ml瓊脂17g蒸餾水1000mlpH6.730℃下培養(yǎng)7d，對光觀察，菌落中心呈黑色，邊緣透明，菌落圓形，表面光滑，呈粘狀。將分離的細菌接種在玉米苗上，驗證是否發(fā)病。4.噬菌體檢驗法：用?；允删w，如ZP6、ZP82等檢驗。5.血清學檢驗：用酶聯(lián)免疫法等檢驗。檢疫和防治1.禁止從國外疫區(qū)進口玉米種子2.種子處理：（1）微波爐70℃處理10min，效果很好。（2）環(huán)氧乙烷熏蒸：（3）恒溫處理：50℃下處理4d，消滅種子內部細菌效果顯著，不影響發(fā)芽。（4）抗菌素溫浸法：3.防治傳播媒介昆蟲：4.種植抗病品種：柑橘黃龍病

CitrusYellowshoot,Huanglongbing分布：1939年在中國廣東發(fā)現(xiàn)該病，現(xiàn)已擴展到亞洲和非洲40多個國家和地區(qū)，中國主要發(fā)生在廣東、廣西、福建、臺灣、海南、云南、貴州、四川、浙江、湖南、江西等省。寄主：主要是柑橘屬、金柑屬和枳屬。草本植物有長春花。？？？？危害：是柑橘的毀滅性病害，感病的柑桔品種得病后可在3－5年內喪失結果能力，甚至枯死。癥狀：典型癥狀是在濃綠的樹冠中出現(xiàn)1－2條或多條的發(fā)黃枝梢，有兩種類型：一種是整張葉片均勻黃化，另一種是葉片呈黃綠相間的斑駁狀。共同特點是葉質硬化、無光澤，但在黃梢下部的老葉仍呈正常綠色。病果小，果皮光滑，畸形，無光澤，味酸，果皮著色時黃綠不均勻或在果蒂附近變橙紅色，而其余部份仍為青綠色的青果

葉：老葉斑駁，新葉缺素狀；果：“紅鼻果”、“青果”病原Candidatus

Liberibacterasiaticus（亞洲種）、Candidatus

Liberibacterafricanus（非洲種）、Candidatus

Liberibacteramericanus（美洲種）分類地位：原核生物界(Procaryoces)，薄壁菌門(Gracilicutes)，韌皮部桿菌屬Liberobacter英文名稱：CitrusHuanglongbing；CitrusYellowshoot；Citrusgreening未能在人工培養(yǎng)基上分離獲得純培養(yǎng)，在電鏡下為橢圓形或短桿狀的細菌，大小為30－600×500－1400m，細胞壁厚度為25－30m。革蘭氏染色陰性，對四環(huán)素及青霉素敏感。根據(jù)其對熱的反應和傳病木虱的不同，分為兩個株系：在亞洲，其發(fā)病的最適溫度為27－32℃，傳播介體為亞洲木虱（Diaphorinacitri），病原為柑桔黃龍病原亞洲株系（L.asiaticum）；在非洲，其發(fā)病的最適溫度為20－24℃,傳播介體為非洲木虱（Triozaaryteae）病原為柑橘黃龍病非洲株系（L.africanum）?？梢酝ㄟ^嫁接及菟絲子傳播，但不能通過汁液和土壤傳播。傳播：遠距離傳播主要是來自病區(qū)調運的苗木、接穗；大田主要依靠柑橘木虱進行傳播，在亞洲是亞洲木虱，在非洲是非洲木虱。發(fā)生條件：亞洲多發(fā)生在熱帶亞熱帶地區(qū)，喜高溫；在非洲多在冷涼氣候下發(fā)生，30℃以上高溫病害受抑制。檢驗與檢測：1.產地檢驗：每年10～12月癥狀表現(xiàn)最明顯2.生物學診斷：鑒別寄主法3.電鏡檢查：4.熒光顯微鏡檢查：黃色熒光5.化學診斷：染色法6.血清學檢測：7.分子生物學方法檢疫與防治：1、實行檢疫

禁止病區(qū)苗木及一切帶病材料進入新區(qū)和無病區(qū)，新開辟的果園要種植無病苗。2、建立無病苗圃對優(yōu)良單株進行脫毒并經鑒定證明不帶菌；在網室內建立種質圃；在隔離地方或在網室內建立無病母本園；在隔離地方或在網室內建立無病苗圃。3、挖除病株

4、防治柑桔木虱

。5.加強栽培管理查文獻，列出huanglongbing的檢測方法要求：列出參考文獻,例如：1.RealtimePCR（目的基因為……）Author1,Author2,Author3.Titletitletitletitletitle.Jounal,year,vol,page.2……課程作業(yè)椰子致死黃化病

CoconutLethalYellowing名稱來源于NutmanandRoberts(1955)。他們首次用致死黃化（lethalyellowing）命名在加勒比海、牙買加西部地區(qū)發(fā)生的一種椰子致死黃化型的毀滅性病害。該病害在加勒比海地區(qū)至少已有100年的歷史，在西非也有50年的歷史。目前分布在拉丁美洲開曼群島、巴哈馬群島、古巴、多半尼加、海地，非洲和西印度群島，亞洲的印度尼西亞、辛都、馬來西亞、美國佛羅里達洲南部地區(qū)等地也有報道。

寄主范圍：

除為害椰子樹(CocosnuciferaL.)外，還可以為害油棕、棗椰子、扇棕、馬尼拉棕、海棕等30多種棕櫚科植物。大部分椰子品種抗病性差，在棕櫚科的15個主要類群中，至少有7個是感病的。感病寄主屬包括：Allagoptera，桄榔屬Arenga，Arikuryroba，Boraxxus，魚尾屬Caryota，散尾屬Chrysalidocarpus，椰子屬Cocos，Corypha，Dictyosperma，Gaussia，Hyophorbe，Latania，薄葵屬Livistona