實驗五金黃色葡萄球菌檢測概述課件

實驗五乳制品中金黃色葡萄球菌檢測生物學特性

---菌體形態(tài)及培養(yǎng)特征革蘭氏陽性球菌，直徑為0.8-1.0微米，鏡檢時呈單個、成對、四聯(lián)或不規(guī)則的簇群；無芽孢，不運動；兼性厭氧菌，在好氧條件下生長最好；可在15%氯化鈉和40%膽汁中生長生物學特性

---菌體形態(tài)及培養(yǎng)特征大多數(shù)菌株能生長在6.5-46℃之間（最適溫度30-37℃）能在pH4.2-9.3之間生長（最適pH為7.0-7.5）；大多數(shù)菌株產(chǎn)生類胡羅卜素，使細胞團呈現(xiàn)出深橙色到淺黃色，色素的產(chǎn)生取決于生長的條件，而且在單個菌株中可能也有變化致病性金黃色葡萄球菌為條件致病菌，菌株致病力的強弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶：

a.溶血素：外毒素，分α、β、γ、δ四種，能損傷血小板，破壞溶酶體，引起肌體局部缺血和壞死；

b.殺白細胞素：可破壞人的白細胞和巨噬細胞；

c.血漿凝固酶：當金黃色葡萄球菌侵入人體時，該酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，阻礙吞噬細胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化與此酶有關；

d.脫氧核糖核酸酶：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的脫氧核糖核酸酶能耐受高溫，可用來作為依據(jù)鑒定金黃色葡萄球菌；

e.腸毒素：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素，分為A、B、C、D、E五種。致病性葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌腸毒素所引起的疾病，可引發(fā)不同程度的急性胃腸炎癥狀，惡心、嘔吐最為突出而且普遍，腹痛、腹瀉次之。當金黃色葡萄球菌污染了含淀粉及水分較多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在溫度條件適宜時，經(jīng)8-10小時即可相當數(shù)量的腸毒素。分布在自然界中廣泛存在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到。作為人和動物的常見病原菌，其主要存在于人和動物的鼻腔、咽喉、頭發(fā)上，50%以上健康人的皮膚上都有金黃色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的機會很多。傳播媒介為被該菌污染的食品，主要為淀粉類(如剩飯、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及魚、肉、蛋類等。被污染的食物在室溫20℃-22℃放置5小時以上時，病菌大量繁殖，并產(chǎn)生腸毒素。流行病學金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛(wèi)生問題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占整個細菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占45%，我國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。流行病學腸毒素形成條件：存放溫度，在37°C內(nèi)，溫度越高，產(chǎn)毒時間越短；存放地點，通風不良氧分壓低易形成腸毒素；食物種類，含蛋白質(zhì)豐富，水分多，同時含一定量淀粉的食物，腸毒素易生成。耐受力幾乎所有的消毒試劑以及熱加工過程對金黃色葡萄球菌都有嚴重的破壞作用腸毒素可耐受100℃30分鐘不被破壞。對于加工過的食品或食品加工設備而言，此菌或其腸毒素的存在通常作為衛(wèi)生條件差的一種指標。污染的控制防止金黃色葡萄球菌污染食品

防止金黃色葡萄球菌對奶及其制品的污染：如牛奶廠要定期檢查奶牛的乳房，不能擠用患化膿性乳腺炎的牛奶；奶擠出后，要迅速冷至-10℃以下，以防毒素生成、細菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶為原料，注意低溫保存。污染的控制防止金黃色葡萄球菌污染食品

對肉制品加工廠，患局部化膿感染的禽、畜尸體應除去病變部位，經(jīng)高溫或其他適當方式處理后進行加工生產(chǎn)。污染的控制防止金黃色葡萄球菌腸毒素的生成

應在低溫和通風良好的條件下貯藏食物，以防腸毒素形成；在氣溫高的春夏季，食物置冷藏或通風陰涼地方也不應超過6小時，并且食用前要徹底加熱。檢測步驟

---分離血平板：金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生溶血素，因此在血平板上產(chǎn)生明顯的溶血環(huán)。血平板上其典型菌落呈金黃色，有時也為白色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，有溶血圈。檢測步驟

---分離BP平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、維生素和痕量礦物元素丙酮酸鈉是一種生長促進劑亞碲酸鹽對除金黃色葡萄球外的其他能分解卵黃的菌株有毒性，并使菌落產(chǎn)生黑色卵黃提供營養(yǎng)和有利于觀察卵磷脂環(huán)甘氨酸和氯化鋰對金黃色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。檢測步驟

---分離在BP平板上其典型菌落為：圓形，光滑突起，濕潤，直徑2-3mm，顏色呈灰色到黑玉色，邊緣常為淡色（米黃色或灰白色略帶灰色或黃色的白色），周圍為一混濁帶，在其外緣常有一透明圈。用接種針接觸菌落似有黃油樹膠的粘稠感。偶然會遇到不分解脂肪菌株，除無混濁帶及透明圈外，其他外觀基本相同。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落，其黑色常較典型菌落淡些，且外觀可能粗燥，質(zhì)地較干燥。一、實驗目的要求了解食品的質(zhì)量與金黃色葡萄球菌檢驗的意義。掌握金黃色葡萄球菌的生物學特性。掌握金黃色葡萄球菌檢驗的生化試驗的操作方法和結(jié)果的判斷。掌握食品中金黃色葡萄球菌檢驗的方法和技術。二、原理葡萄球菌在自然界分布極廣，空氣、土壤、水、飼料、食品(剩飯、糕點、牛奶、肉品等)以及人和動物的體表粘膜等處均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。金黃色葡萄球菌是葡萄球菌屬一個種?？梢鹌つw組織炎癥，還能產(chǎn)生腸毒素。如果在食品中大量生長繁殖，產(chǎn)生毒素，人誤食了含有毒素的食品，就會發(fā)生食物中毒，故食品中存在金黃色葡萄球菌對人的健康是一種潛在危險，檢查食品中金黃色葡萄球菌及數(shù)量具有實際意義。金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固酶，使血漿凝固，多數(shù)致病菌株能產(chǎn)生溶血毒素，使血瓊脂平板菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)，在試管中出現(xiàn)溶血反應。這些是鑒定致病性金黃色葡萄球菌的重要指標。三、試劑和儀器（一）最先準備的器材規(guī)格名稱 數(shù)量 用途1、500ml三角瓶 1個 7.5%氯化鈉肉湯2、500ml三角瓶 1個 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯3、250ml三角瓶 4個 制血培養(yǎng)基等4、10×100mm試管 6支 血漿凝固酶試驗5、1ml移液管 2支6、10ml移液管 2支7、直徑為90mm平皿12套 制血平板、B-P平板8、250ml量筒 1支（二）應滅菌的其它器材剪刀1把 不銹鋼湯匙1把稱量紙適量A.110%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯A.1.1成分胰酪胨（或胰蛋白胨）17.0g植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3.0g氯化鈉100.0g磷酸氫二鉀2.5g丙酮酸鈉10.0g葡萄糖2.5g蒸餾水1000mLpH7.3±0.2A.1.2制法將上述成分混合，加熱，輕輕攪拌并溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，每瓶225mL，121℃高壓滅菌15min。A.27.5%氯化鈉肉湯

A.2.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化鈉75g蒸餾水1000mLpH7.4A.2.2制法將上述成分加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，每瓶225mL，121℃高壓滅菌15min。四、實驗內(nèi)容

（一）、增菌培養(yǎng)法樣品處理→→選擇性增菌→→選擇性平板分離→→血漿凝固酶試驗鑒別→→結(jié)果報告第一天樣品處理和增菌培養(yǎng)（一）、樣品處理固體或半固體食品：以無菌操作稱取25g樣品，放入裝有225mL滅菌生理鹽水的滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min均質(zhì)1～2min，制成1:10樣品勻液。

液體食品:：用滅菌吸管吸取25mL樣品，放入裝有225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖制成1:10樣品勻液。（二）、增菌培養(yǎng)接種操作：吸取5mL稀釋液接入7.5%NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中。37°C培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)：放于36±1℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)果：在NaCl肉湯中呈混濁生長，胰蛋白胨肉湯中有時液體澄清，菌量多時呈混濁生長。第二天接種選擇性平板進行分離培養(yǎng)（一）、接種選擇性平板取增菌液1環(huán)，劃線接種于血平板或B－P平板。（二）、培養(yǎng)放于36±1℃培養(yǎng)24h。第三天觀察分離結(jié)果、鏡檢、做血漿凝固酶試驗（一）、觀察分離結(jié)果結(jié)果：金黃色葡萄球菌，在血平板上呈：金黃或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周圍有溶血圈；在Baird-Parker平板上：菌落為圓形，直徑2-3mm，顏色灰或黑色，周圍有一渾濁帶，在其外層有一透明圈。（二）、革蘭氏染色、鏡檢操作：革蘭氏染色→鏡檢結(jié)果：金黃色葡萄球菌，革蘭氏陽性，顯微鏡下呈葡萄狀排列無芽胞，直徑0.5-1μm。（三）、結(jié)果報告：綜合形態(tài)特征，血平板情況以及血漿凝固酶試驗結(jié)果，判別檢樣有否金黃色葡萄球菌作出報告。金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實驗取肉湯培養(yǎng)物0.5mL同0.5mL凝固酶試驗兔血漿于試管內(nèi)充分混合,置36±1℃培養(yǎng),定時觀察是否有凝塊形成,至少觀察6h,以內(nèi)容物完全凝固,使試管倒置或傾斜時不流動者為陽性。1支加入金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌懸液0.5ml作陽性對照，另1支加入營養(yǎng)肉湯或0.9％無菌氯化鈉溶液0.5ml作陰性對照。

陽性和陰性對照血漿凝固酶試驗(1)取潔凈玻片一張，于兩端各加兔血漿一滴。(2)用接種環(huán)取金黃色葡萄球菌苔一環(huán)，在玻片一端兔血漿中研磨混勻，接種環(huán)滅菌后再取白色葡萄球菌苔一環(huán)，在另一端兔血漿中研磨均勻。(3)觀察兔血漿有無凝集現(xiàn)象。四.檢驗和控制

1．金黃色葡萄球菌的檢驗

樣品處理：無菌取25g或25mL食品樣品，放入225mL滅菌生理鹽水中均質(zhì)，制成10-1稀釋液。

增菌培養(yǎng)：將10-1稀釋液接入7.5%NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中，37°C培養(yǎng)24小時。

分離培養(yǎng)：將上述稀釋液或培養(yǎng)液分別劃線血平板和Baird-Parker平板，置37°C培養(yǎng)24-48小時。金黃色葡萄球菌在血平板上呈金黃或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周圍有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落為圓形，直徑2-3mm，顏色灰或黑色，周圍有一渾濁帶。

染色觀察：從平板上挑取可疑性菌落進行革蘭氏染色，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性，顯微鏡下呈葡萄狀排列無芽胞、莢膜，直徑0.5-1μm。

血漿凝固酶試驗：吸取0.5mL兔血漿與0.5mL金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯24小時培養(yǎng)物充分混勻，置36±1°C培養(yǎng)，每隔半小時觀察一次，連續(xù)觀察6小時，出現(xiàn)凝固，即將小試管傾斜或倒置時，內(nèi)容物不流動，判為陽性。同時做陰陽性對照。

耐熱核酸酶試驗：將24小時肉湯培養(yǎng)物沸水浴處理15min，用接種環(huán)劃線刺種于甲苯胺蘭-DNA平板，36±1°C培養(yǎng)24小時，在刺種線周圍出現(xiàn)淡粉色者為陽性。本試驗金黃色葡萄球菌為陽性。

血漿凝固酶試驗：吸取0.5mL兔血漿與0.5mL金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯24小時培養(yǎng)物充分混勻，置36±1°C培養(yǎng)，每隔半小時觀察一次，連續(xù)觀察6小時，出現(xiàn)凝固，即將小試管傾斜或倒置時，內(nèi)容物不流動，判為陽性。同時做陰陽性對照。耐熱核酸酶試驗：將24小時肉湯培養(yǎng)物沸水浴處理15min，用接種環(huán)劃線刺種于甲苯胺蘭-DNA平板，36±1°C培養(yǎng)24小時，在刺種線周圍出現(xiàn)淡粉色者為陽性。本試驗金黃色葡萄球菌為陽性。問題與討論：1.血漿與血清的區(qū)別是什么？為何凝固酶試驗需要用血漿而不是血清？2.葡萄球菌產(chǎn)生的凝固酶有幾種？實驗室檢測血漿凝固酶的試驗方法有幾種？每種方法測定的物質(zhì)有何不同？哪種方法最好？3.血漿中的抗