基因組序列注釋功能基因組學(xué)

基因組序列注釋功能基因組學(xué)第1頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四為什么需要功能基因組學(xué)？雖然從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)可以揭示基因組中基因的數(shù)量和分布，并預(yù)測基因的種類和功能，但這僅僅是預(yù)測而已，并不能肯定其確切功能，而且有許多基因的功能還無法預(yù)測。從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)也無法知道各個(gè)基因參與了哪些生命過程，其表達(dá)是如何調(diào)控的，不同基因之間是如何互作的。總之，從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)無法了解基因的確切功能、表達(dá)調(diào)控以及相互作用。功能基因組學(xué)的產(chǎn)生正是為了研究這些內(nèi)容。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第2頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四功能基因組學(xué)是反向遺傳學(xué)傳統(tǒng)的遺傳學(xué)也稱為正向遺傳學(xué)，它是在已知基因功能的前提下，去尋找基因（序列）的，亦即“從功能到基因”。功能基因組學(xué)正好相反，它是在已知基因（序列）的前提下，去尋找基因功能的，亦即“從基因到功能”，所以也稱為反向遺傳學(xué)。第3頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四正向遺傳學(xué)的研究方法圖位克隆法：根據(jù)目標(biāo)基因在染色體上定位的結(jié)果，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行克隆，最后了解其核苷酸序列。轉(zhuǎn)座子（或T-DNA）標(biāo)簽法：利用轉(zhuǎn)座子（或T-DNA）插入引起的突變，克隆控制突變性狀的基因。第4頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四圖位克隆（PositionalCloning）

圖位克隆又稱基于圖譜的克?。╩ap-basedcloning）。首先是尋找與目標(biāo)基因緊密連鎖的標(biāo)記，然后通過染色體步行方法（chromosomewalking）建立局域物理圖，找到與目標(biāo)基因共分離的BAC克隆。進(jìn)一步通過亞克隆和遺傳互補(bǔ)試驗(yàn)（將野生型基因轉(zhuǎn)入突變體中），找到目標(biāo)基因。第5頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽/T-DNA標(biāo)簽

（TransposonTagging/T-DNATagging）

轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座插入是一個(gè)自發(fā)的過程，而T-DNA插入則是通過轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的。轉(zhuǎn)座子插入和T-DNA插入引起突變的頻率要比自然突變的頻率高。因此，在已知存在轉(zhuǎn)座子的群體或轉(zhuǎn)基因后代群體中發(fā)現(xiàn)的突變體，很可能是轉(zhuǎn)座子或T-DNA插入引起的。通過轉(zhuǎn)座子或T-DNA標(biāo)簽克隆基因的方法主要有以下三種：菌落原位雜交法（insituhybridization）反向PCR法（inversePCR,IPCR）質(zhì)粒拯救法（plasmidrescue）

COLLEGEOFLIFESCIENCE第6頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四菌落原位雜交法建立突變體基因組DNA克隆文庫，以轉(zhuǎn)座子序列為探針與菌落克隆雜交，陽性克隆即包含被轉(zhuǎn)座子插入的目標(biāo)基因。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第7頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四反向PCR法將突變體基因組DNA進(jìn)行限制酶切，然后用連接酶使之連成環(huán)狀。依據(jù)轉(zhuǎn)座子序列設(shè)計(jì)反向引物，進(jìn)行PCR，即可擴(kuò)增出目標(biāo)基因片段。為了提高特異性，可以采用巢式（nested）PCR方法。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第8頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四質(zhì)粒拯救法經(jīng)過改造的轉(zhuǎn)座子帶有質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)和選擇標(biāo)記基因，從而猶如一個(gè)載體。將突變體基因組DNA酶切并連接后，可以得到轉(zhuǎn)座子和目標(biāo)基因片段組成的環(huán)狀DNA。用它轉(zhuǎn)化大腸桿菌，目標(biāo)基因片段即被克隆出來。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第9頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四反向遺傳學(xué)的研究方法：針對(duì)特定基因消除或抑制基因的表達(dá)基因敲除（geneknockout）反義RNA（antisenseRNA）RNA干擾（RNAinterference）提高或改變基因的表達(dá)使目標(biāo)基因過量表達(dá)（overexpression）使目標(biāo)基因異位表達(dá)（ectopicexpression）

COLLEGEOFLIFESCIENCE第10頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四基因敲除在體外先將某個(gè)基因的內(nèi)部插入一個(gè)選擇標(biāo)記基因，使該基因失活。并將包含該失活基因的染色體片段組裝到載體上。導(dǎo)入細(xì)胞后，通過同源重組，失活基因會(huì)取代細(xì)胞中原來正常的基因，從而產(chǎn)生基因失活突變體。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第11頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四第12頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四第13頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四

COLLEGEOFLIFESCIENCE第14頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四反義RNA將目標(biāo)基因顛倒過來，使其編碼鏈變成模板鏈，而模板鏈變成編碼鏈，即成為該目標(biāo)基因的反義RNA基因。將反義基因轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞中，反義基因?qū)⑥D(zhuǎn)錄出反義RNA，而反義RNA會(huì)與目標(biāo)基因的mRNA結(jié)合，使之無法翻譯，從而達(dá)到抑制目標(biāo)基因表達(dá)的目的。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第15頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四RNA干擾（RNAi）RNA干擾是指dsRNA（雙鏈RNA）在細(xì)胞中可以誘發(fā)與之同源的mRNA降解，從而導(dǎo)致編碼該mRNA的基因沉默的現(xiàn)象。RNA干擾的最初證據(jù)來自1995年Guo和Kemphues對(duì)線蟲的研究。他們發(fā)現(xiàn)，將par-1基因的反義RNA和正義RNA注射進(jìn)線蟲體內(nèi)，都能引起該基因的沉默?；谠撗芯拷Y(jié)果，1998年AndyFire首次在線蟲中證明，dsRNA可以有效地、特異地抑制基因的表達(dá)。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第16頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四RNA干擾所需的酶Dicer：為RNaseIII家族的一個(gè)成員，可以產(chǎn)生雙鏈小型干擾RNA（siRNA，長度21~23bp）。該酶含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括一個(gè)解旋酶結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)相鄰的RNaseIII結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)dsRNA結(jié)合基元。RISC（RNA-inducedsilencingcomplex）：由RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，是一種核酸蛋白復(fù)合體。RdRP（RNA-directedRNApolymerase）：由RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第17頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四RNA干擾的基本過程Dicer與dsRNA結(jié)合，將dsRNA剪切成siRNA。siRNA與RISC結(jié)合，形成有活性的RISC復(fù)合體。有活性的RISC與目標(biāo)mRNA結(jié)合（siRNA單鏈與mRNA互補(bǔ)），將mRNA切斷。第18頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四RNA干擾的分子機(jī)制第19頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四dsRNA的來源用于RNA干擾的dsRNA既可以在體外合成，然后導(dǎo)入到受體細(xì)胞里，也可以人為地構(gòu)建一個(gè)基因（將目標(biāo)基因中某一段序列鏡像對(duì)接），將它導(dǎo)入到受體細(xì)胞，直接在受體細(xì)胞中合成dsRNA。該基因具有自互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，因而轉(zhuǎn)錄出來的RNA可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。5-AAGCTTATCCCGTGGTGGTATGAAAGGTTCCGCTATAGG-33-TTCGAATAGGGCACCACCATACTTTCCAAGGCGATATCC-55-AAGCTTATCCCGTGGTGGTATCCACCACGGGATAAGCTT-33-TTCGAATAGGGCACCACCATAGGTGGTGCCCTATTCGAA-5第20頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四過量表達(dá)和異位表達(dá)通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將完整的目標(biāo)基因（包括啟動(dòng)子區(qū)域）導(dǎo)入正常個(gè)體細(xì)胞中，使目標(biāo)基因的拷貝數(shù)增加，這樣可能會(huì)使目標(biāo)基因的表達(dá)量增加，超過了正常的需要（即過量表達(dá)），這會(huì)引起性狀的改變。由此可以推斷目標(biāo)基因的功能。如果轉(zhuǎn)基因中所用的啟動(dòng)子是組織特異的，而且其表達(dá)的部位與目標(biāo)基因正常表達(dá)的部位不同，則出現(xiàn)異位表達(dá)現(xiàn)象。異位表達(dá)可能使得某種（些）性狀在非正常的部位出現(xiàn)。據(jù)此也可推斷目標(biāo)基因的功能。使用組成型啟動(dòng)子會(huì)同時(shí)造成過量表達(dá)和異位表達(dá)。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第21頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四水稻OsMADS3基因過量和異位表達(dá)的表現(xiàn)使用組成型啟動(dòng)子讓來自水稻的OsMADS3基因在水稻中過量和異位表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在正常的小穗旁邊還長出一個(gè)不完全的小穗。由此可以推斷，該基因與水稻的小穗發(fā)育有關(guān)。第22頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四功能基因組學(xué)的研究方法：高通量建立大規(guī)模隨機(jī)插入突變體庫及基因機(jī)械篩選（genemachinescreening）分析基因表達(dá)譜（expressionprofile）轉(zhuǎn)錄組（transciptome）蛋白組（proteome

）代謝組（metabolome

）

COLLEGEOFLIFESCIENCE第23頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四突變體庫對(duì)于遺傳學(xué)研究的意義隨著一些物種全基因組測序的完成，以及數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的成百上千的ESTs序列，如何分析這些基因的功能、如何理解基因與基因之間在生物體內(nèi)的相互作用是一項(xiàng)重要的工作?；蚬δ艿念A(yù)測建立在與其他物種同源基因之間的比對(duì)，但許多基因的預(yù)測功能與他們實(shí)際的功能并不一致。還有許多的基因功能尚未歸類。突變體在研究基因的功能的過程中十分重要。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第24頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四突變體庫對(duì)于遺傳學(xué)研究的意義

COLLEGEOFLIFESCIENCE30％為原來已鑒定的基因；30％為同源分析鑒定的基因；10％為數(shù)據(jù)庫中存在同源序列，但功能未知，稱為孤兒家族；剩下30％在數(shù)據(jù)庫中無同源序列，其中7%很可能不是基因，23％看起來像基因，稱為單身孤兒。酵母基因組中基因的分類第25頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四產(chǎn)生突變體庫的方法

研究一個(gè)基因的功能，最可靠的方法是把一個(gè)基因的結(jié)構(gòu)破壞掉，然后研究破壞后的表現(xiàn)型。借助大量的突變體，將會(huì)加速人們對(duì)這個(gè)物種基因功能的研究。常見的方法是：1、插入突變2、缺失突變3、物理化學(xué)誘變

COLLEGEOFLIFESCIENCE第26頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四插入突變

插入突變作為研究基因組基因功能的有效手段，廣泛地應(yīng)用于植物、哺乳動(dòng)物的基因功能的研究。這個(gè)技術(shù)手段的優(yōu)勢在于，插入片段的序列已知，并且攜帶容易識(shí)別的報(bào)告基因。其中，常用的插入突變技術(shù)有T-DNA插入突變Ac/Ds

轉(zhuǎn)座子插入突變

COLLEGEOFLIFESCIENCE第27頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四T-DNA

T-DNA是農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中的一個(gè)片段。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?？梢詮闹参飩谇秩胫参锛?xì)胞，T-DNA可以整合到植物基因組中，并引起細(xì)胞瘋狂分裂，形成冠狀腫瘤。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第28頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四轉(zhuǎn)座子Ac/Ds系統(tǒng)Ac/Ds是目前植物中最常用的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。該系統(tǒng)來自玉米，但已經(jīng)通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將該系統(tǒng)導(dǎo)入其它植物（如水稻）中。Ac是自主型轉(zhuǎn)座子，而Ds是非自主型轉(zhuǎn)座子，需要Ac存在時(shí)才能發(fā)生轉(zhuǎn)座。因此，可以通過有性雜交的方法將Ac和Ds聚合在一個(gè)基因組中。當(dāng)發(fā)現(xiàn)某個(gè)Ds插入引起的突變體時(shí)，又可以通過有性雜交的方法使Ac和Ds分開，這樣就能穩(wěn)定地保存Ds插入突變體。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第29頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四建立隨機(jī)插入突變體庫及基因機(jī)械篩選為了高通量地研究基因的功能，應(yīng)該大規(guī)模地建立T-DNA或轉(zhuǎn)座子插入株系，然后對(duì)所有已知序列的基因進(jìn)行篩選，確定各個(gè)基因的插入突變體。采取基因機(jī)械篩選的策略，可以同時(shí)對(duì)許多基因進(jìn)行篩選，實(shí)現(xiàn)高通量的分析目標(biāo)。主要有以下三種方法：PCR檢測分子雜交檢測側(cè)鄰DNA測序

COLLEGEOFLIFESCIENCE第30頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四PCR檢測法根據(jù)目標(biāo)基因和T-DNA（或轉(zhuǎn)座子）的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，則僅當(dāng)T-DNA（或轉(zhuǎn)座子）插入到目標(biāo)基因中間時(shí)，才能得到PCR產(chǎn)物。因此，能得到PCR產(chǎn)物的株系即為該目標(biāo)基因的插入突變體。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第31頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四分子雜交檢測法對(duì)所有株系進(jìn)行反向PCR（IPCR），然后將各株系IPCR的產(chǎn)物按陣列形式固定在尼龍膜或玻璃片上，再以各個(gè)待測基因的序列為探針進(jìn)行雜交，有陽性雜交信號(hào)的點(diǎn)（株系）即為該基因的插入突變體。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第32頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四側(cè)鄰DNA測序法將所有株系的T-DNA（或轉(zhuǎn)座子）插入位點(diǎn)兩側(cè)的序列擴(kuò)增出來并測序，然后將這些序列儲(chǔ)存在一個(gè)基因敲除數(shù)據(jù)庫中。用生物信息學(xué)的方法將各個(gè)待測基因的序列與該數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較，即可獲知哪些株系發(fā)生了哪些基因的插入突變。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第33頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四分析基因表達(dá)譜（expressionprofile）

—轉(zhuǎn)錄組分析（transcriptome）轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）是指在某一特定條件下單個(gè)或一組細(xì)胞所具有的mRNA的總和。對(duì)轉(zhuǎn)錄組的分析，就是檢測各種mRNA的表達(dá)水平，由此可以反映各種基因的表達(dá)調(diào)控，推斷其可能的功能和作用網(wǎng)絡(luò)。對(duì)轉(zhuǎn)錄組的分析主要有以下兩種方法：SAGE（SerialAnalysisofGeneExpression）Microarray（微陣列）/DNAchip（DNA芯片）

COLLEGEOFLIFESCIENCE第34頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四SAGE分析

SAGE:能同時(shí)分析大量的轉(zhuǎn)錄本

三項(xiàng)原則：取短片段的序列（10-14bp），必須包括能區(qū)分一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的足夠的信息。短片段的序列之間能夠相互連接形成長的序列分子，這樣的分子能夠被克隆與測序。某特異序列被觀察到的時(shí)間量(標(biāo)簽出現(xiàn)的頻率)代表某個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)豐度。技術(shù)關(guān)鍵：用一種特殊的限制性內(nèi)切酶，能夠切取特定的標(biāo)簽長度。如:BsmF1

COLLEGEOFLIFESCIENCE第35頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四SAGE從特定組織中提取mRNA，通過反轉(zhuǎn)錄成為cDNA。通過限制酶切從每條cDNA上得到一條長10-15bp的片段，稱為SAGE標(biāo)簽。將來自各種cDNA上的標(biāo)簽連接成許多串聯(lián)復(fù)合體，并將其克隆。對(duì)這些克隆進(jìn)行測序，然后統(tǒng)計(jì)各種標(biāo)簽的數(shù)量。這樣就能了解各種mRNA的相對(duì)豐度。

COLLEGEOFLIFESCIENCE第36頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四SAGE實(shí)驗(yàn)計(jì)算機(jī)軟件的用途選擇具有合適相間距離的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)在繁浩的基因序列數(shù)據(jù)中提煉“標(biāo)簽”將標(biāo)簽的序列信息儲(chǔ)藏在數(shù)據(jù)庫之中在計(jì)算機(jī)中模擬“標(biāo)簽”序列與基因組序列的相匹配

COLLEGEOFLIFESCIENCE第37頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四DNA芯片

（Microarry）-什么是Microarry技術(shù)？一種非常有效的基因表達(dá)研究技術(shù)，可以同時(shí)檢測多達(dá)10萬個(gè)基因的表達(dá)狀況。特別是用于了解在一種組織中各類mRNA的豐度。它的特點(diǎn)是：平行性高通量大范圍、大規(guī)模基因組水平上的

COLLEGEOFLIFESCIENCE第38頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四DNA芯片（DNAMicroarry）-概況？原則上是在玻璃片、尼龍膜或其他材料上點(diǎn)上一系列的DNA片段，然后與不同的轉(zhuǎn)錄本探針進(jìn)行雜交。這些有序排列的“點(diǎn)”可以是細(xì)菌克隆、純化后的質(zhì)粒DNA、插入片段、或者是核苷酸片斷。點(diǎn)樣的密度可以達(dá)到每片10萬個(gè)多種高技術(shù)的有機(jī)組合

COLLEGEOFLIFESCIENCE第39頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四DNA芯片（DNAMicroarry）-尼龍膜上點(diǎn)樣用放射性物質(zhì)標(biāo)記探針，這是一種經(jīng)濟(jì)的方法

COLLEGEOFLIFESCIENCE第40頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四DNA芯片（DNAMicroarry）-幾種常見的技術(shù)高速的機(jī)器手在玻璃芯片上點(diǎn)樣，通常是點(diǎn)經(jīng)過PCR擴(kuò)增的cDNAs，所謂芯片的“印制”依賴高速機(jī)器手，點(diǎn)長片段的核苷酸（70merAgilent技術(shù)）用所謂的照相平板印刷法，直接在芯片上合成25mer的多低聚核苷酸(AffymetrixGeneChips)用“鋁鏡”技術(shù)在芯片上直接合成25-70mers的低聚核苷酸(NimbleGeneChips技術(shù))

COLLEGEOFLIFESCIENCE第41頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四DNA芯片的分析過程

COLLEGEOFLIFESCIENCE第42頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四DNA芯片的分析過程

COLLEGEOFLIFESCIENCE第43頁，共50頁，2023年，2月20日，星期四DNA芯片的分析過程

COLLEGEOFLIFESCIENCE第44頁，共50頁，2023年，2月20日，星期