生物工程下游技術(shù)第十四章+電泳分離技術(shù)1課件

第十四章電泳分離技術(shù)前言1937年，瑞典科學(xué)家Tiselius設(shè)計了世界上第一臺電泳儀，建立了移界電泳法，并于1948年榮獲諾貝爾獎。70年以來，電泳技術(shù)圍繞制膠、電泳、染色三個技術(shù)環(huán)節(jié)，不斷改進(jìn)，以實現(xiàn)下列目標(biāo)：

1、提高分辨率及靈敏度。

2、簡化操作，縮短電泳時間。

3、擴(kuò)大應(yīng)用范圍。各類電泳技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個領(lǐng)域。電泳是指帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。電泳技術(shù)指利用電泳現(xiàn)象對混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。1.電泳技術(shù)的基本原理(2)影響泳動率u的因素

內(nèi)因：1.凈電荷

2.質(zhì)點大小

3.質(zhì)點形狀

外因：1.V(U/L)

2.緩沖液的pH(pH恒定)

3.離子強(qiáng)度[I]

最適:0.02-0.2

4.電滲：液體對固體支持物的相對移動(3)電泳類型

a.載體電泳

紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳、凝膠電泳。

凝膠電泳包括：瓊脂糖凝膠、淀粉凝膠、硅膠凝膠、聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠電泳包括：垂直板、盤狀、等電聚焦、梯度、免疫電泳

b.自由界面電泳

支持物為溶液，很少用。2.聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在加速劑

N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)和催化劑過硫酸銨(AP)或核黃素(C17H2O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)?！?/p>

丙烯酰胺單體聚合過程：聚合反應(yīng)交聯(lián)劑造成分枝端點自由基可再延續(xù)freeradicalBisBis聚合反應(yīng)交錯連結(jié)自由基形成光聚合：核黃素為催化劑(陽光,日光)，制大孔膠?；瘜W(xué)聚合：制小孔膠。

過硫酸銨(NH4)2S2O3

APS

(引發(fā)劑)

N,N,N,N’-四甲基乙二胺，TEMED(加速劑)2.1聚丙烯酰胺凝膠電泳原理三種物理效應(yīng)

⑴樣品濃縮效應(yīng)

⑵分子篩效應(yīng)⑶電荷效應(yīng)三種物理效率使樣品分離效果好，分辨率高①凝膠孔徑不連續(xù)性

單體濃度

交聯(lián)度

大孔膠:T=3%C=2.0%

小孔膠:T=7%C=2.5%凝膠網(wǎng)孔大小:

聚合鏈長度:由Acr濃度交聯(lián)程度:由Acr與Bis相對比例

Bis的濃度低,孔徑大,可在聚合前調(diào)節(jié)單體與Bis的濃度比

如:AcrBisT(%)

小孔28.0g0.735g7%

大孔10.0g2.5g2.5%凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)。

分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%) 蛋白質(zhì)<104

20-30 1-4×104

15-201-5×104-1×105 10-15 1×105

5-10 >5×105

2-5 核酸(RNA) <104 15–20 104–105

5-10 105-2×106 2-2.6③pH的不連續(xù)性

pH

大孔(濃縮)膠6.7

小孔(分離)膠8.9

緩沖液8.3

A為電泳前3層凝膠排列順序，3層膠中均有快離子、慢離子

B顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。

C顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個區(qū)帶。

電泳過程示意圖不連續(xù)系統(tǒng)濃縮效應(yīng)示意圖連續(xù)膠的制膠過程與點樣過程玻璃板

(前,后)樣本梳間隔條間隔條濃縮膠分離膠不連續(xù)膠的制膠過程與點樣過程玻璃板(前,后)樣本梳間隔條間隔條■

電泳凝膠系統(tǒng)的組成：1電泳系統(tǒng)pH膠體濃度緩沖液上層(負(fù)極)緩沖液2樣品溶液3濃縮膠

6.9

4分離膠

膠體

5下層(正極)緩沖液Tris-HClTris-HClTris-glycine

Tris-glycine

Tris-glycine

8.3

8.3

8.3

8.3

5%

7.5~20%

-

-

-

●

不連續(xù)膠有聚焦樣品的作用變性膠與非變性膠：變性膠：膠電脈在蛋白質(zhì)變性的狀態(tài)下進(jìn)行，主要指SDS變性條件下進(jìn)行。非變性膠：電泳在蛋白質(zhì)保持天然狀態(tài)下進(jìn)行，不加變性劑。■

SDS在蛋白質(zhì)表面均勻敷上

一層負(fù)電：SDSboiling變性蛋白質(zhì)成一線狀分子原態(tài)蛋白質(zhì)並且均勻帶上一層負(fù)電荷非極性尾部極性頭部圖1聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

(1)樣品膠pH6.7(2)濃縮膠pH6.7

(3)分離膠pH8.9(4)電極緩沖液pH8.3

架膜加蓋接導(dǎo)線，開機(jī)3.醋酸纖維素薄膜電泳分離血清清蛋白電泳儀器實驗操作：

浸泡

將醋酸纖維素薄膜在緩沖溶液中浸泡20min，取出識別光面和麻面。

點樣

用鑷子將薄膜置于濾紙上，吸收多余的液體，用鉛筆在薄膜麻面一端2cm處畫一細(xì)線，利用載玻片一側(cè)蘸取樣品，于細(xì)線處點樣。

電泳

將薄膜麻面朝下，平懸于電泳槽支架的濾紙橋上，點樣一端靠近負(fù)極；通電后先使U=80V，待10min后，使U=120V電泳40min。

染色

將薄膜取出后，置于氨基黑10B染色劑重染色10min。

漂洗

將薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至無蛋白區(qū)無藍(lán)黑色。4.等電聚焦(IsoelectrofocusingIEForEF)原理

Pr為兩性電解質(zhì)，不同Pr其aa的數(shù)量、種類及占比例不同，因此pI不同，pI范圍窄且凈電荷為零，因此依pI分離Pr。

EF是在凝膠中加兩性載體電解質(zhì)，通直流電后，可形成從陽極到陰極逐步增加的pH梯度(連續(xù)的、穩(wěn)定的、線性的pH)。原理（續(xù)）

當(dāng)Pr在電場中遷移到它的PI時，由于凈電荷為零，不再移動。如擴(kuò)散，附近的凝膠會使其荷電，陽、陰極會重新吸引它回到pI位置。因此Pr只能在pI位置被濃縮成窄、穩(wěn)定的帶。稱這種濃縮效應(yīng)為聚焦。只要凝膠中的pH梯度范圍足夠窄。便可將pI相近的Pr分開，EF是電泳技術(shù)中分辨率最高的技術(shù)。方法（EF的關(guān)鍵）

⑴載體兩性電解質(zhì)CA分辨率0.01pH

⑵固相pH梯度

以具弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物CH2＝CH─CO─NH─RR=─COOHR=─4級氨基

R為弱酸or弱堿,形成緩沖體系體系分辨率達(dá)0.001pH

pH梯度范圍最窄可為0.01pH/cm

CAIEF是兩性分子,在凝膠聚合時形成兩性分子；在電場中,CA遷移到自己的pI而形成pH梯度.5.電泳技術(shù)問題及對策1).低離子溶液中,不同電荷的蛋白質(zhì)分子間會發(fā)生相互靜電作用,增加溶液離子強(qiáng)度可減少這種作用,但會提高電泳時的電流,使產(chǎn)熱更多,溫度升高又促進(jìn)蛋白質(zhì)的擴(kuò)散,使區(qū)帶變寬,分辨率下降.因此電泳緩沖液的離子強(qiáng)度必須控制適當(dāng)。0.02-0.2M的離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度低,速度快,發(fā)熱低,有電滲離子強(qiáng)度高,速度慢,發(fā)熱大電泳技術(shù)問題及對策2).蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷主要取決于電泳緩沖液的pH值,應(yīng)仔細(xì)調(diào)整和控制電泳緩沖液的pH值,使各組分分子的凈電荷數(shù)差異加大.但極端pH下蛋白質(zhì)會變性失活,因此一般控制在pH4.5～9.5之間;電泳技術(shù)問題及對策3).緩沖液的種類,濃度和其他電解質(zhì)濃度影響蛋白質(zhì)所帶電荷的極性和數(shù)量,同時還影響蛋白質(zhì)分子間的相互作用,因此必須根據(jù)分離溶質(zhì)的不同選擇合適的緩沖系統(tǒng);電泳技術(shù)問題及對策4).表面活性劑(SDS等)強(qiáng)烈破壞蛋白質(zhì)分子間的非共價作用,使蛋白質(zhì)分子為表面溶劑分子所包圍,阻止了蛋白質(zhì)之間的相互作用,同時也消除了不同蛋白質(zhì)固有的電荷差異;電泳技術(shù)問題及對策5).控制電泳介質(zhì)的有效