中藥制劑分析新技術(shù)新方法詳解演示文稿

中藥制劑分析新技術(shù)新方法詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六（優(yōu)選）中藥制劑分析新技術(shù)新方法現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六高效毛細(xì)管電泳2中藥指紋圖譜3中藥化學(xué)指紋圖譜技術(shù)、中藥DNA指紋圖譜技術(shù)現(xiàn)代色譜技術(shù)1頂空氣相色譜法、超高效液相色譜、超臨界流體色譜提綱OUTLINE現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六§1現(xiàn)代色譜技術(shù)1、頂空氣相色譜法（液上氣相色譜法、頂空分析法）對(duì)樣品基質(zhì)上方的氣體成分進(jìn)行GC分析來(lái)測(cè)定這些組分在原樣品中的含量頂空氣相色譜的分類靜態(tài)頂空GC動(dòng)態(tài)頂空GC現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六1、頂空氣相色譜法主要特點(diǎn)：樣品前處理簡(jiǎn)單檢測(cè)限低可分析含量低、組成復(fù)雜的樣品適用于易揮發(fā)或易分解或無(wú)法直接進(jìn)樣分析的液體或固體樣品的分析§1現(xiàn)代色譜技術(shù)現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六頂空氣相色譜法應(yīng)用實(shí)例頂空固相微萃取-氣相色譜法測(cè)定魚(yú)腥草注射液中甲基正壬酮含量樣品制備：精密量取魚(yú)腥草注射液1ml，置頂空取樣瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)物溶液50μl，搖勻，密封，作為供試品溶液。色譜條件（略）頂空分析條件平衡溫度為50℃，平衡時(shí)間為10分鐘（快速攪拌下），閥、輸送管及定量管溫度為80℃，加壓為13.8kPa，加壓時(shí)間、充樣時(shí)間和壓力平衡時(shí)間均為0.15分鐘，定量管為1.0ml?！?現(xiàn)代色譜技術(shù)現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六§1現(xiàn)代色譜技術(shù)2、超高效液相色譜（UPLC，UltraPerformanceLiquidChromatography）主要特點(diǎn)固定相雙（三乙氧基硅）乙烷在硅膠中形成橋式乙基基團(tuán)顆粒粒度小，僅為1.7μm耐壓，顆粒度分布范圍很窄現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六§1現(xiàn)代色譜技術(shù)2、超高效液相色譜（UPLC，UltraPerformanceLiquidChromatography）主要特點(diǎn)檢測(cè)器響應(yīng)快樣品池—10mm的光程（與普通HPLC相同）而體積只有500nL（普通HPLC的20分之一）優(yōu)點(diǎn)更高的分析速度，更好分離效果和更高的靈敏度，速度、靈敏度及分離度，分別是HPLC的9倍、1.7倍及3倍現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六樣品的前處理分子印跡技術(shù)制備對(duì)特定目標(biāo)分子具有分子識(shí)別性能的分子印跡聚合物的技術(shù)。分子印跡聚合物兼?zhèn)淞松镒R(shí)別體系和化學(xué)識(shí)別體系的優(yōu)點(diǎn),具有抗惡劣環(huán)境、選擇性高、穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度高、制備簡(jiǎn)單等特點(diǎn),可選擇性識(shí)別富集復(fù)雜樣品中的目標(biāo)物。用于固相萃取、固相微萃取、膜萃取等樣品前處理技術(shù)?，F(xiàn)在是9頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六§1現(xiàn)代色譜技術(shù)3、超臨界流體色譜（SFC,supercriticalfluidchromatography）以超臨界流體（低黏度、高密度以及較高的擴(kuò)散系數(shù)）作為流動(dòng)相。對(duì)GC及HPLC的檢測(cè)器均可兼容使用適用于分析GC難以處理的高沸點(diǎn)、不揮發(fā)性樣品分離速度較HPLC，分離效果更好。應(yīng)用實(shí)例超臨界流體色譜法測(cè)定懷牛膝制劑中齊墩果酸的含量現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六§2高效毛細(xì)管電泳電泳:在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。1937年Tiselius(瑞典)利用自由溶液電泳將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白1981年Jorgenson和Luckas發(fā)展了高效毛細(xì)管電泳分離分析技術(shù)(使用75μm內(nèi)徑石英毛細(xì)管和采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓)，現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六§2高效毛細(xì)管電泳

各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為：

ν+=ν電滲流+ν+ef陽(yáng)離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致ν-=ν電滲流-ν-ef陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流相反ν0=ν電滲流中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致

可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子的分離分離原理電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。

現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六§2高效毛細(xì)管電泳儀器裝置電壓：0～30KV。分離柱不涂敷任何固定液，紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器可檢測(cè)到：10-19～10-21mol/L現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六§2高效毛細(xì)管電泳主要特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)高分辨率：理論塔板數(shù)高達(dá)數(shù)百萬(wàn)塊，甚至數(shù)千萬(wàn)塊。高靈敏度：可檢測(cè)出低至10-21mol/L濃度的物質(zhì)。高分析速度：可在3分鐘內(nèi)分離30種陰離子；1.7分鐘分離19種陽(yáng)離子;4分鐘可分離10種蛋白質(zhì).試樣用量少：僅需幾nL（10-9L）的試樣儀器簡(jiǎn)單，操作成本低：分析一個(gè)試樣僅需幾毫升流動(dòng)液現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六§2高效毛細(xì)管電泳常見(jiàn)的毛細(xì)管電泳模式毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(MECC)（膠束作為假固定相的電動(dòng)色譜）毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)（凝膠作為支持物，起分子篩的作用）毛細(xì)管等電聚焦電泳(CIEF)（用于蛋白質(zhì)、多肽等兩性物質(zhì)的分離）毛細(xì)管等速電泳(CITP)現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六§2高效毛細(xì)管電泳應(yīng)用離子分析藥物分析手性化合物分析氨基酸分析核酸分析及DNA測(cè)序HPCE在中藥制劑分析中的應(yīng)用生物堿的測(cè)定、動(dòng)物類藥材的鑒別、指紋圖譜現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定心舒口服液中腺苷、蘆丁和阿魏酸的含量對(duì)照品溶液（略）供試品溶液的配制取心舒口服液10mL，加熱濃縮至約1mL，加60%甲醇定容10mL，冰箱放置過(guò)夜，經(jīng)0.45mm濾膜濾過(guò)備用。電泳條件以熔融石英毛細(xì)管(50mm×66.5cm，有效分離長(zhǎng)度58cm)為分離通道，以105mmol/L硼砂液為運(yùn)行緩沖液，壓力進(jìn)樣50mpa，6s，毛細(xì)管柱溫度為20℃，運(yùn)行電壓為0～30min:24kV，30～60min:28kV，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，毛細(xì)管柱使用前以0.1mol/L氫氧化鈉溶液、注射用水和運(yùn)行緩沖液依次沖洗5,5,8min，每次電泳后以運(yùn)行緩沖液沖洗8min。在此條件下，同時(shí)測(cè)定腺苷、蘆丁和阿魏酸的含量?，F(xiàn)在是17頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六§3中藥指紋圖譜從整體上評(píng)價(jià)中藥的內(nèi)在質(zhì)量中藥（化學(xué)）指紋圖譜法現(xiàn)代光譜（紅外光譜，紫外光譜）色譜（氣相色譜、薄層色譜、高效液相色譜、毛細(xì)管電泳）其它（X光衍射）現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六§3中藥指紋圖譜中藥DNA指紋圖譜法——DNA分子遺傳標(biāo)記DNA分子：遺傳信息的直接載體，物種鑒別更為準(zhǔn)確可靠90年代，PCR(PolymoraseChainReaction)技術(shù)，快速而靈敏地檢測(cè)。近年來(lái)，基于PCR的RFLP、RAPD、SSR、AFLP等檢測(cè)DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)（DNA指紋技術(shù)）。應(yīng)用：在藥材鑒定方面現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六廣義的分子標(biāo)記（molecularmarker）是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。常用的是狹義的分子標(biāo)記概念，即DNA分子標(biāo)記。DNA分子標(biāo)記主要分為以下三類限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）：是發(fā)展最早的分子標(biāo)記技術(shù)，以分子雜交為核心技術(shù)。DNA序列測(cè)定現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六基于PCR的分子標(biāo)記：根據(jù)引物的選擇可分為隨機(jī)引物擴(kuò)增和特定序列位點(diǎn)擴(kuò)增。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）。隨機(jī)引物擴(kuò)增PCR（ArbitraryPrimer-PCR,AP-PCR）現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六2、DNA擴(kuò)增產(chǎn)物指紋分析（DNAamplificationfingerprinting,DAF）:與RAPD技術(shù)不同的是引物濃度更高，長(zhǎng)度更短（5～8個(gè)bp），只有2個(gè)溫度循環(huán)（在RAPD中是3個(gè)溫度循環(huán)），一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳。3、特征擴(kuò)增區(qū)段測(cè)序（Sequence-characterizedamplifiedregions，SCAR）：先做RAPD分析，然后克隆目標(biāo)RAPD片段進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)RAPD片段兩末端的序列設(shè)計(jì)特定引物（一般比RAPD引物長(zhǎng)，24bp），再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可把與原RAPD片段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒定出來(lái)，可重復(fù)性高?，F(xiàn)在是22頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六RFLP技術(shù)及其應(yīng)用

RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性內(nèi)切酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性)是70年代發(fā)展起來(lái)的DNA片段分析技術(shù)。該技術(shù)不僅在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)的許多領(lǐng)域都有了成功的應(yīng)用，而且在中藥材品種基源及其地理品系、栽培品系的質(zhì)量評(píng)價(jià)方面也有許多應(yīng)用?，F(xiàn)在是23頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六基本原理

生物在進(jìn)化過(guò)程中，由于種種原因引起基因突變和DNA分子結(jié)構(gòu)重排，造成了分子內(nèi)核苷酸排列順序的改變，當(dāng)這種改變涉及到限制性酶切位點(diǎn)時(shí)，酶切后產(chǎn)生的DNA片段長(zhǎng)度將發(fā)生變化，限制性片段的長(zhǎng)度在不同個(gè)體間呈多態(tài)性現(xiàn)象，即稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,簡(jiǎn)稱RFLP)現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六RestrictionFragmentLengthPolymorphism(RFLP)EnzymescutDNAatspecificsequencesRestrictionsitesareoftenpalindromes:6-cutterGAATTC 4-cutterTCGACTTAAG AGCT現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六DNA多態(tài)性根據(jù)其產(chǎn)生的兩種基本方式堿基對(duì)突變類型(基因點(diǎn)突變),即限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上發(fā)生了單個(gè)堿基替換(轉(zhuǎn)換或顛換)，使原有切點(diǎn)消失或產(chǎn)生新的切點(diǎn)。結(jié)構(gòu)重排型，這是由DNA內(nèi)部發(fā)生較大的順序變化所引起的?，F(xiàn)在是27頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六RFLP與鐮狀細(xì)胞貧血現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六基本實(shí)驗(yàn)步驟靶DNA的準(zhǔn)備核酸探針的標(biāo)記雜交顯示現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六RFLP的優(yōu)點(diǎn)及局限性

優(yōu)點(diǎn)：(1)普遍存在(2)穩(wěn)定性(3)共顯性(4)探針與限制酶的組合數(shù)量無(wú)限局限性：（1）用RFLP僅能檢測(cè)出影響到限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的突變（2）步驟多，工作量大，而且接觸的放射性污染也多（3）RFLP分析技術(shù)要求DNA無(wú)顯著降解，因此只適用于新鮮的材料，難適用于干燥藥材的鑒別（4）限制性內(nèi)切酶價(jià)格較貴

現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六RFLP用于親緣關(guān)系分析“Ladder”現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六RFLP在中藥材鑒別中的應(yīng)用

（一）近緣種的鑒別如：海馬的PCR-RFLP分析

（二）藥用植物親緣關(guān)系的研究如：羽扇豆屬植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及與生物堿分布的關(guān)系

現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六RAPD技術(shù)及其應(yīng)用

RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)技術(shù)是1990年由杜邦公司W(wǎng)illiams和Welsh兩個(gè)研究小組同時(shí)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)DNA多態(tài)檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)高效、靈敏、簡(jiǎn)便、快速，一經(jīng)出現(xiàn)就被普遍用于物種種屬分類、親緣關(guān)系分析、物種起源鑒定、目的基因篩選、農(nóng)作物育種等研究領(lǐng)域。近年，RAPD技術(shù)又進(jìn)入了中藥材的鑒別研究領(lǐng)域，并得到廣泛應(yīng)用，已成為目前用于中藥材鑒定報(bào)道最多的分子遺傳標(biāo)記技術(shù)?，F(xiàn)在是34頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六RAPD技術(shù)基本原理RAPD的核心技術(shù)是PCR反應(yīng)，但又不同于經(jīng)典的PCR。它是以任意序列的寡核苷酸為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Williams稱之為RAPD，引物通常為10個(gè)堿基；Welsh稱之為AP-PCR(ArbitraryPrimerPCR)，引物為20～30個(gè)堿基。對(duì)于任一引物，如在一定范圍內(nèi)模板DNA上有與之互補(bǔ)的反向重復(fù)序列時(shí)，就可擴(kuò)增出此范圍的DNA片段?，F(xiàn)在是35頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六RAPD:randomlyamplifiedpolymorphicDNA現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六基本實(shí)驗(yàn)步驟

模板DNA的制備PCR擴(kuò)增，通常RAPD擴(kuò)增條件為：93℃預(yù)變性200s，開(kāi)始如下循環(huán)：94℃變性lmin，36℃退火1min，72℃延伸2min；經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min，循環(huán)結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物置于4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物20μl反應(yīng)產(chǎn)物走凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色檢測(cè)擴(kuò)增的情況RAPD圖譜的數(shù)據(jù)處理現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六RAPD分析的優(yōu)越性和不足優(yōu)越性：(1)無(wú)需預(yù)知被研究的生物基因組核苷酸順序，也無(wú)需專門設(shè)計(jì)RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的引物，引物隨機(jī)合成或是任意選定的,長(zhǎng)度一般為9-10個(gè)寡核苷酸；(2)擴(kuò)增沒(méi)有特異性；(3)退火溫度較低，一般為36℃，這能保證短核苷酸引物與模板的穩(wěn)定配對(duì)，同時(shí)也允許了適當(dāng)?shù)腻e(cuò)誤配對(duì)，以擴(kuò)大引物在基因組DNA中配對(duì)的隨機(jī)性。(4)簡(jiǎn)便易行，省力省時(shí)。（5）檢測(cè)靈敏方便；（6）所需樣品DNA量極少，僅為10ng,為RFLP的1/l000～l/2000。（7）能自動(dòng)化。現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六不足：（1）重復(fù)性不高。RAPD在擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)使用的是低溫復(fù)性(通常為36℃),特異性不高,引物與模板間有較高的錯(cuò)配率,結(jié)果容易受到多種因素的影響,不同的實(shí)驗(yàn)室這間有時(shí)不能重復(fù)；（2）對(duì)模板DNA質(zhì)量要求高，操作要求嚴(yán)格，檢驗(yàn)成本相對(duì)較高；（3）由于存在共遷移，分子量相同的片段可能不是同源的；另外一條帶中可能含有不同的擴(kuò)增產(chǎn)物；（4）RAPD標(biāo)記難以區(qū)分開(kāi)雜合子和純合子基因型，不能有效的鑒定出雜合子?，F(xiàn)在是39頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六RAPD分析在中藥研究中的應(yīng)用

道地藥材的評(píng)價(jià)

例：當(dāng)歸藥材道地性的RAPD分析野生與栽培種及不同農(nóng)家品種親緣關(guān)系分析例：人參及山參RAPD指紋動(dòng)物藥的鑒定

例：蛇類藥材分子遺傳標(biāo)記鑒別的研究現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六AFLP技術(shù)及其應(yīng)用

擴(kuò)增酶切片段多態(tài)性(AmplifiedRestrictionFragmentPolymorphism)是一種基于PCR的DNA指紋技術(shù)，AFLP是近幾年來(lái)繼RFLP、RAPD之后發(fā)展最快的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。被譽(yù)為新一代的分子標(biāo)記技術(shù)，近年來(lái)已得到廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)在是41頁(yè)\一共有47頁(yè)\編輯于星期六AFLP基本原理

AFLP的基本原理是對(duì)基因組DNA限制性酶切片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。先將基因組DNA用限制性