第六章微生物的遺傳和變異

第六章微生物的遺傳和變異第一頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日微生物將其生長(zhǎng)發(fā)育所需要的營(yíng)養(yǎng)類型和環(huán)境條件，以及對(duì)這些營(yíng)養(yǎng)和外界環(huán)境條件產(chǎn)生的一定反應(yīng)，或出現(xiàn)的一定性狀傳給后代，并相對(duì)穩(wěn)定地一代一代傳下去，這就是微生物的遺傳。當(dāng)微生物從它適應(yīng)的環(huán)境遷移到不適應(yīng)的環(huán)境后，微生物改變自己對(duì)營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件的要求，在新的生活條件下產(chǎn)生適應(yīng)新環(huán)境的酶，從而適應(yīng)新環(huán)境并生長(zhǎng)良好，這是遺傳的變異。變異了的微生物不同于原來(lái)的微生物，稱變種。在工業(yè)廢水生物處理中，用含有某些污染物的工業(yè)廢水篩選、培養(yǎng)來(lái)自處理其他廢水的菌種，使它們適應(yīng)該種工業(yè)廢水，并產(chǎn)生高效降解其中污染物能力的方法叫馴化。第二頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日主要內(nèi)容三、基因重組四、突變體的檢測(cè)與篩選二、微生物的變異一、微生物的遺傳五、分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境工程與環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用第三頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)微生物的遺傳

第四頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

一、遺傳和變異的物質(zhì)基礎(chǔ)——DNA

親代生物如何將遺傳性狀傳給子代？

從分子遺傳學(xué)角度看，親代是通過(guò)脫氧核糖核酸（DNA）將決定各種遺傳性狀的遺傳信息傳給子代的。子代有了一定結(jié)構(gòu)的DNA，便產(chǎn)生一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，由一定結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)就可決定子代具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化性質(zhì)等的遺傳性狀。DNA是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，可通過(guò)格里菲斯經(jīng)典的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和大腸桿菌T2噬菌體感染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)得到證明。第五頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

格里菲斯經(jīng)典的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：SⅢ型死菌體內(nèi)有一種物質(zhì)引起RⅡ型活菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生SⅢ型菌。SⅢ型死菌體內(nèi)能引起轉(zhuǎn)化的物質(zhì)是什么？第六頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

大腸桿菌T2噬菌體感染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)：進(jìn)入大腸桿菌體內(nèi)的T2噬菌體DNA，利用大腸桿菌體內(nèi)的DNA、酶及核糖體復(fù)制大量T2噬菌體。第七頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日二、DNA的結(jié)構(gòu)與復(fù)制

（一）DNA的結(jié)構(gòu)DNA是高分子化合物，相對(duì)分子質(zhì)量最小的為2.3×104，最大的達(dá)1010。沃森和克里克在1953年提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)理論和模型，認(rèn)為DNA是兩條多核苷酸鏈彼此互補(bǔ)并排列方向相反的，以右手旋轉(zhuǎn)的方式圍繞同一根主軸而互相盤繞形成的，具有一定空間距離的雙螺旋結(jié)構(gòu)。第八頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日每條多核苷酸鏈上均有4種堿基：腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鳥嘌呤（G）及胞嘧啶（C）有序地排列。這4種堿基以氫鍵與另一條多核苷酸鏈的4種堿基彼此互補(bǔ)配對(duì)。由氫鍵連接的堿基組合，稱堿基配對(duì)。第九頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日1953年的沃森（左）和克里克在實(shí)驗(yàn)室里，他們兩人因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)了DNA的分子結(jié)構(gòu)，而在1962年與威爾金斯一起獲得諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。第十頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日繼20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)DNA的右旋雙股螺旋結(jié)構(gòu)后，科學(xué)家在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并合成由15~25個(gè)核苷酸組成的短鏈反義核酸，這些反義核酸可被綁到DNA中形成三股螺旋的DNA。DNA的電子顯微照片DNA的分子結(jié)構(gòu)1992年我國(guó)科學(xué)家首先發(fā)現(xiàn)三股螺旋的天然DNA?，F(xiàn)在，三股螺旋DNA的存在已被國(guó)際公認(rèn)。第十一頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

1、DNA的存在形式

真核生物的DNA和組蛋白等組成染色體，少的幾個(gè)，多的幾十或更多，染色體呈絲狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)所有染色體由核模包裹成一個(gè)細(xì)胞核。

原核微生物的DNA只與很少量的蛋白質(zhì)結(jié)合，沒(méi)有核模包圍，單純由一條DNA細(xì)絲構(gòu)成環(huán)狀的染色體，拉直時(shí)比細(xì)胞長(zhǎng)許多倍，它在細(xì)胞的中央，高度折疊形成具有空間結(jié)構(gòu)的一個(gè)核區(qū)。第十二頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

2、基因——遺傳因子基因是具有固定的起點(diǎn)和終點(diǎn)的核苷酸或密碼的線性序列。它是編碼多肽、tRNA或rRNA的多核苷酸序列，有編碼蛋白質(zhì)的基因和編碼tRNA或rRNA的基因，按功能可分為3種：

（1）結(jié)構(gòu)基因：編碼蛋白質(zhì)或酶的結(jié)構(gòu)，控制蛋白質(zhì)或酶的合成。

（2）操縱基因：操縱3個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。

（3）調(diào)節(jié)基因：它控制結(jié)構(gòu)基因。

基因控制遺傳性狀，但不等于遺傳性狀。核苷酸的結(jié)構(gòu)第十三頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

3、遺傳信息的傳遞

不同細(xì)胞中DNA貯存的特定遺傳信息是如何轉(zhuǎn)化為不同細(xì)胞，又如何傳遞給具有特定酶促作用的蛋白質(zhì)？

DNA的復(fù)制和遺傳信息傳遞的基本規(guī)則，稱為分子遺傳學(xué)的中心法則。不論細(xì)胞生物還是非細(xì)胞生物，貯存在DNA上的遺傳信息都通過(guò)DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，將遺傳信息傳給后代，并通過(guò)RNA的中間作用指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。第十四頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

（二）DNA復(fù)制：首先是DNA分子中的兩條多核苷酸鏈之間的氫鍵斷裂，彼此分開(kāi)成兩條單鏈。然后各自以原有的多核苷酸鏈為模板，根據(jù)堿基配對(duì)的原則吸收細(xì)胞中游離的核苷酸，按照原有鏈上的堿基排列順序，各自合成出一條新的互補(bǔ)的多核苷酸，新合成的一條多核苷酸鏈和原有的多核苷酸鏈又以氫鍵連接成新的雙螺旋結(jié)構(gòu)。DNA的半保留式的復(fù)制方式第十五頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日三、DNA的變性和復(fù)性

（一）DNA的變性：DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)由堿基對(duì)中堿基之間的氫鍵維持。當(dāng)天然雙鏈DNA受熱或在其他因素的作用下，兩條鏈之間的結(jié)合力被破壞而分開(kāi)成單鏈DNA，即稱為DNA變性。

（二）DNA的復(fù)性：變性DNA溶液經(jīng)適當(dāng)處理后重新形成天然DNA的過(guò)程叫復(fù)性，或叫退火。用高溫致使DNA變性后，再降低至自然溫度，變性的DNA會(huì)復(fù)制成天然雙鏈DNA。第十六頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日四、RNARNA和DNA很相似，不同的是以核糖代替脫氧核糖，以U代替T。因此，RNA中的堿基配對(duì)為：A－U、U－A、G－C、C－G4種。

mRNA稱為信使RNA，作為多聚核苷酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)，其上帶有指導(dǎo)氨基酸的信息密碼（三聯(lián)密碼子），它翻譯氨基酸，具傳遞遺傳性的功能。

tRNA稱為轉(zhuǎn)移RNA，其上有和mRNA互補(bǔ)的反密碼子，能識(shí)別氨基酸及識(shí)別mRNA上的密碼子，在tRNA－氨基酸合成酶的作用下傳遞氨基酸。

反義RNA起調(diào)節(jié)作用，決定mRNA翻譯合成速率。

rRNA和蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖體，它是合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所，由mRNA、tRNA、反義RNA和rRNA協(xié)作合成蛋白質(zhì)。第十七頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)脫氧核苷酸腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）脫氧核糖磷酸通常呈單鏈結(jié)構(gòu)核糖核苷酸腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）核糖磷酸DNA與RNA分子的比較第十八頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日五、遺傳密碼遺傳密碼是存在于mRNA上、由相鄰的3個(gè)核苷酸組成，代表一個(gè)氨基酸的核苷酸序列，即三聯(lián)密碼子。有64組密碼子，其中61組分別為20種氨基酸編碼，代表蛋白質(zhì)中的20種氨基酸，稱為有意義密碼子；AUG是起始密碼子。另外3組（UAA、UAG、UGA）稱為無(wú)意義密碼子，它們起終止蛋白質(zhì)合成的作用。第十九頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日六、微生物生長(zhǎng)與蛋白質(zhì)合成微生物生長(zhǎng)的主要活動(dòng)是蛋白質(zhì)的合成，同化的糖和消耗的能量有4/5~9/10直接或間接與蛋白質(zhì)合成有關(guān)。蛋白質(zhì)的合成在核糖體上進(jìn)行，與RNA的復(fù)制（合成）及DNA的復(fù)制（合成）有關(guān)。RNA的合成速率是控制生長(zhǎng)速率的關(guān)鍵因素。

蛋白質(zhì)合成的過(guò)程有以下幾個(gè)步驟：

1、DNA復(fù)制首先，決定某種蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的相應(yīng)一段DNA鏈進(jìn)行自我復(fù)制。其復(fù)制過(guò)程與前述的DNA復(fù)制相同。第二十頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

2、DNA轉(zhuǎn)錄DNA的轉(zhuǎn)錄實(shí)際是RNA的合成。轉(zhuǎn)錄是由DNA指導(dǎo)，在RNA聚合酶催化作用下的RNA的合成過(guò)程，此過(guò)程需要ATP、GTP、CTP和UTP參與。

（1）原核微生物的DNA轉(zhuǎn)錄：首先是雙鏈DNA解旋、解鏈，兩鏈分開(kāi)，由σ因子協(xié)助，RNA聚合酶的核心酶識(shí)別基因轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)并與DNA區(qū)域結(jié)合成啟動(dòng)因子。然后以它其中一條單鏈為模板遵循堿基配對(duì)的原則轉(zhuǎn)錄出一條mRNA。mRNA合成一旦開(kāi)始，σ因子就從核心酶解離下來(lái)。新轉(zhuǎn)錄的mRNA鏈的核苷酸堿基的序列與模板DNA鏈的核苷酸堿基序列互補(bǔ)。

（2）真核微生物的DNA轉(zhuǎn)錄：它有3種RNA聚合酶參與合成。在核基質(zhì)中的RNA聚合酶Ⅱ與染色質(zhì)結(jié)合催化mRNA的合成；RNA聚合酶Ⅰ和RNA聚合酶Ⅲ分別催化rRNA和tRNA的合成。第二十一頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

3、tRNA翻譯DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA后，mRNA鏈上的核苷酸堿基序列需要被翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列，還要被轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體上，才能合成具有不同生理特性的功能蛋白。tRNA是起翻譯和轉(zhuǎn)運(yùn)作用的。

4、蛋白質(zhì)合成通過(guò)tRNA兩端的識(shí)別作用，把特定氨基酸轉(zhuǎn)送到核糖體上，使不同的氨基酸按照mRNA上的堿基序列連接起來(lái)，在多肽合成酶的作用下合成多肽鏈，多肽鏈通過(guò)高度折疊成特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，最終合成具有不同生理特性的功能蛋白。第二十二頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日七、微生物的細(xì)胞分裂隨DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成而使兩者成倍增加后的一個(gè)有秩序的過(guò)程，即為微生物細(xì)胞的分裂。微生物將成倍增加的核物質(zhì)和蛋白質(zhì)均等地分為二等份，然后分配給兩個(gè)子細(xì)胞，在細(xì)胞的中部合成橫膈膜并逐漸內(nèi)陷，最終將兩個(gè)子細(xì)胞分開(kāi)，細(xì)胞分裂完成。第二十三頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)微生物的變異

第二十四頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日一、變異的實(shí)質(zhì)——基因突變

由于某種因素引起微生物DNA鏈上的A－T堿基對(duì)發(fā)生錯(cuò)差，成了G－T對(duì)，它的性狀沒(méi)有在當(dāng)代表現(xiàn)。當(dāng)DNA再一次復(fù)制時(shí)本應(yīng)A－T配對(duì)，卻成G－C配對(duì)，就成了與正常體不同的突變體。

基因突變即微生物的DNA被某種因素引起堿基的缺失、置換或插入，改變了基因內(nèi)部原有的堿基排列順序，從而引起其后代表現(xiàn)型的改變。當(dāng)后代突然表現(xiàn)和親代顯然不同的、能遺傳的性狀時(shí)，就稱為突變。第二十五頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日二、突變的類型

（一）自發(fā)突變自發(fā)突變是指某種微生物在自然條件下，沒(méi)有人工參與而發(fā)生的基因突變。

1、多因素低劑量的誘變效應(yīng)：不少自發(fā)突變是由于一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素長(zhǎng)期作用的綜合效應(yīng)。

2、互變異構(gòu)效應(yīng)：通常DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中總是以A－T和G－C堿基配對(duì)的形式出現(xiàn)。偶爾T不以酮基形式出現(xiàn)，而以烯醇式出現(xiàn)，C以亞氨基形式出現(xiàn)，在DNA復(fù)制時(shí)出現(xiàn)與之前不同的堿基對(duì)G－T和A－C。第二十六頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

（二）誘發(fā)突變誘發(fā)突變是利用物理或化學(xué)的因素處理微生物群體，促使少數(shù)個(gè)體細(xì)胞的DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在基因內(nèi)部堿基配對(duì)發(fā)生錯(cuò)差，引起微生物的遺傳性狀發(fā)生突變。發(fā)能提高突變率的因素都稱誘發(fā)因素或誘變劑。

1、物理誘變：利用物理因素引起基因突變的稱物理誘變。紫外輻射對(duì)DNA的破壞和DNA的修復(fù)第二十七頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日2、化學(xué)誘變：利用化學(xué)物質(zhì)對(duì)微生物進(jìn)行誘變，引起基因突變或真核生物染色體畸變的，稱為化學(xué)誘變。3、復(fù)合處理及其協(xié)同效應(yīng)：誘變劑的復(fù)合處理常有一定的協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)誘變效果。其突變率普遍比單獨(dú)處理的高。（1）兩種或多種誘變劑先后使用；（2）同一種誘變劑重復(fù)使用；（3）兩種或多種誘變劑同時(shí)使用。

4、定向培育和馴化：定向培育是人為用某一種特定環(huán)境條件長(zhǎng)期處理某一微生物群體，同時(shí)不斷將它們進(jìn)行移種傳代，以達(dá)到累積和選擇合適的自發(fā)突變體的一種古老的育種方法。由于自發(fā)突變的變異頻率較低，變異程度較輕，故變異過(guò)程均比誘變育種和雜交育種慢得多。

如今，環(huán)境工程仍主要采用定向培育的方法培育菌種。第二十八頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)基因重組

第二十九頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日兩個(gè)不同性狀個(gè)體細(xì)胞的DNA融合，使基因重新組合，從而發(fā)生遺傳變異，產(chǎn)生新品種，此過(guò)程稱為基因重組。一、雜交雜交是通過(guò)雙親細(xì)胞的融合，使整套染色體的基因重組；或者是通過(guò)雙親細(xì)胞的溝通，使部分染色體基因重組。二、轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞直接吸收來(lái)自供體細(xì)胞的DNA片段（來(lái)自研碎物），并把它整合到自己的基因組里，從而獲得了供體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化第三十頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日三、轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)溫和噬菌體的媒介作用，把供體細(xì)胞內(nèi)特定的基因（DNA片段）攜帶至受體細(xì)胞中，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)分普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。第三十一頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)突變體的檢測(cè)與篩選

第三十二頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日一、突變體的檢測(cè)

（一）直接檢測(cè)表現(xiàn)型：直接檢測(cè)表現(xiàn)型通過(guò)觀察菌落就可實(shí)現(xiàn)，是最簡(jiǎn)便易行的方法。影印平板法也是直觀的，但較復(fù)雜。

（二）間接檢測(cè)法：高溫菌、低溫菌、嗜酸菌、嗜堿菌及營(yíng)養(yǎng)缺陷型的微生物要通過(guò)控制培養(yǎng)條件而獲得。第三十三頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日二、突變體的篩選篩選突變體的有效技術(shù)是創(chuàng)造一種只允許突變體生長(zhǎng)，抑制原養(yǎng)型菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基或生長(zhǎng)環(huán)境條件。

例如：處理某種高溫工業(yè)廢水，要想獲得能有效處理該種高溫工業(yè)廢水的菌種，就必須預(yù)先篩選培養(yǎng)高溫菌?？梢杂猛耆囵B(yǎng)基和致死溫度處理細(xì)菌，誘導(dǎo)其變異，待溫度降到常溫后放置一段時(shí)間，再用完全培養(yǎng)基分別在常溫和高溫條件下培養(yǎng)，若有菌落生長(zhǎng)，就將它接種到含有處理目的物的培養(yǎng)基上，在高溫條件下擴(kuò)大培養(yǎng)，如此反復(fù)培養(yǎng)、篩選，可以獲得處理該種工業(yè)廢水的菌種。第三十四頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日第五節(jié)分子遺傳學(xué)新技術(shù)在環(huán)境

工程與環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用第三十五頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日一、遺傳工程在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用（一）質(zhì)粒育種簡(jiǎn)介在原核微生物中除有染色體外，還含有另一種較小的、攜帶少量遺傳基因的環(huán)狀DNA分子，稱為質(zhì)粒，也叫染色體外DNA。它們?cè)诩?xì)胞分裂過(guò)程中能復(fù)制，將遺傳性狀傳給后代。有的質(zhì)粒獨(dú)立存在于細(xì)胞質(zhì)中，也有的和染色體結(jié)合，稱為附加體。根據(jù)質(zhì)粒的這些遺傳性狀，可利用質(zhì)粒培育優(yōu)良菌種。質(zhì)粒在基因工程中常被用作基因轉(zhuǎn)移的運(yùn)載工具——載體。第三十六頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日第三十七頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

1、F因子：制育因子，性因子，約2%核染色體，94.5kb，編碼的基因約1/3與接合有關(guān)。

2、R因子：抗藥性因子，其基因編碼的物質(zhì)對(duì)抗生素有抗性。3、Ti因子：誘癌質(zhì)粒，可同植物細(xì)胞中的核染色體整合，破壞控制細(xì)胞分裂的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，從而使其變成癌細(xì)胞。

4、Col因子：大腸桿菌素因子，即使大腸桿菌分泌大腸桿菌素。

5、巨大質(zhì)粒：分子量200~300×106Da，比一般質(zhì)粒大幾十到幾百倍，上面有固氮基因。

6、降解性質(zhì)粒：可以編碼許多降解性酶類，使細(xì)菌降解特殊物質(zhì)。第三十八頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

（二）質(zhì)粒育種舉例

質(zhì)粒育種是將兩種或多種微生物通過(guò)細(xì)胞結(jié)合或融合技術(shù)，使供體菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到受體菌體內(nèi)，使受體菌保留自身功能質(zhì)粒，同時(shí)獲得供體菌的功能質(zhì)粒。即培育出具有兩種功能質(zhì)粒的新品種。

1、多功能超級(jí)細(xì)菌的構(gòu)建

2、解烷抗汞質(zhì)粒菌的構(gòu)建

3、脫色工程菌的構(gòu)建

4、Q5T工程菌第三十九頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日二、基因工程技術(shù)在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用

基因工程是指在基因水平上的遺傳工程，又叫基因剪接或核酸體外重組。

基因工程是用人工方法把所需要的某一供體生物的DNA提取出來(lái)，在離體的條件下用限制性內(nèi)切酶將離體DNA切割成帶有目的基因的DNA片段，每一片段平均長(zhǎng)度有幾千個(gè)核苷酸，用DNA連接酶把它和質(zhì)粒的DNA分子在體外連接成重組DNA分子，然后將重組體導(dǎo)入某一受體細(xì)胞中，以便外來(lái)的遺傳物質(zhì)在其中進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增和表達(dá)，再進(jìn)行重組體克隆的篩選和鑒定；最后對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離提純，從而獲得新品種。第四十頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日基因工程操作分5步：

（1）先從供體細(xì)胞中選擇獲取帶有目的基因的DNA片段；

（2）將目的DNA的片段和質(zhì)粒在體外重組；

（3）將重組體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；

（4）重組體克隆的篩選與鑒定；

（5）外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離與提純。第四十一頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日三、PCR技術(shù)在環(huán)境工程中的應(yīng)用PCR即為DNA聚合酶鏈反應(yīng)，是DNA不需通過(guò)克隆而在體外擴(kuò)增，短時(shí)間內(nèi)合成大量DNA片段的技術(shù)。

（一）PCR技術(shù)基本原理：PCR技術(shù)是一種具有選擇性的體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法。PCR全過(guò)程的實(shí)質(zhì)是在適當(dāng)條件下進(jìn)行PCR循環(huán)（熱變性－復(fù)性－延伸）的多次重復(fù)。第四十二頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

（二）PCR技術(shù)的操作方法

1、儀器

（1）PCR儀：全自動(dòng)帶有微型處理機(jī)。（2）DNA的凝膠電泳儀。PCR儀第四十三頁(yè)，共四十七頁(yè)，2022年，8月28日

2、試劑

（1）引物：根據(jù)待擴(kuò)增的不同DNA，進(jìn)行設(shè)計(jì)與合成。

（2）TaqDNA聚合酶：嗜熱細(xì)菌的酶，能耐受高溫93~100℃。

（3）5mmol/LdNTP貯備液：將4種dNTPs的鈉鹽各100mg合并，加3mL滅菌去離子水溶解，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝：每份300μL，-20℃保存。

（4）10×PCR緩沖