人全外顯子組序列捕獲及第二代測序

人全外顯子組序列捕獲及第二代測序概述外顯子組是指全部外顯子區(qū)域的集合，該區(qū)域包含合成蛋白質(zhì)所需要的重要信息，涵蓋了與個體表型相關(guān)的大部分功能性變異。外顯子組序列捕獲及第二代測序是一種新型的基因組分析技術(shù)：外顯子序列捕獲芯片（或溶液）可在同一張芯片上以高特異性和高覆蓋率捕獲研究者感興趣的目標(biāo)外顯子區(qū)域，后續(xù)利用Solexa/SOLiD/Roche454測序直接解析數(shù)據(jù)。與全基因組重測序相比，外顯子組測序只需針對外顯子區(qū)域的DNA即可，覆蓋度更深、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性更高，更加簡便、經(jīng)濟(jì)、高效?？捎糜趯ふ覐?fù)雜疾病（如：癌癥、糖尿病、肥胖癥等）的致病基因和易感基因等的研究。同時，基于大量的公共數(shù)據(jù)庫提供的外顯子數(shù)據(jù)，我們能夠結(jié)合現(xiàn)有資源更好地解釋我們的研究結(jié)果。目前，SBC提供的外顯子組序列捕獲芯片是NimbleGenSequeneeCapture2.1MHumanExomeArray及AgilentSureSelectTargetEnrichmentSystem（HumanExome）。技術(shù)路線以Nimblegen外顯子捕獲結(jié)合Solexa測序?yàn)槔右哉f明：基因組DNA首先被隨機(jī)打斷成500bp左右的片段，隨后在DNA片段兩端分別連接上接頭。經(jīng)過PCR庫檢合格后的DNA片段與NimbleGen2.1MHumanExomeArray芯片進(jìn)行雜交。去除未與芯片結(jié)合的背景DNA后，將經(jīng)過富集的外顯子區(qū)域的DNA片段洗脫下來。這些DNA片段又隨機(jī)連接成長DNA片段后，再次被隨機(jī)打斷并在其兩端加上測序接頭，經(jīng)過LM-PCR的線性擴(kuò)增，在經(jīng)qPCR質(zhì)量檢測合格后即可上機(jī)測序。外顯子組測序的實(shí)驗(yàn)流程示意圖()甌昭RemdsRawr&ads譽(yù)號外勵子迪押(1Exciserefer^n?過潮婦t?構(gòu)麻弓出比羽豹耀嘲'顯子爼庫列上Filterfid^ptcrandmap呻凸toexomerugian生物信息學(xué)分析流程圖研究內(nèi)容1．外顯子組捕獲與測序?qū)⒒蚪MDNA隨機(jī)打斷成片段，通過與人全外顯子捕獲芯片雜交富集外顯子區(qū)域，通過第二代測序技術(shù)對捕獲的序列進(jìn)行測序。2．基本數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計：對測序結(jié)果進(jìn)行圖像識別(Basecalling)，去除污染及接頭序列；統(tǒng)計結(jié)果包括：測定的序列(Reads)長度、Reads數(shù)量、數(shù)據(jù)產(chǎn)量。高級數(shù)據(jù)分析高級數(shù)據(jù)分析內(nèi)容包括：(1)Cleanreads序列與參考基因組序列比對；(2)目標(biāo)外顯子區(qū)域測序深度分析；(3)目標(biāo)外顯子區(qū)域一致序列組裝；

（4）目標(biāo)外顯子區(qū)域SNP檢測及在CCDS數(shù)據(jù)庫中的注釋；5）可變剪切、基因融合、外顯子融合分析。技術(shù)特點(diǎn)Sequence?吹21WSequence?吹21WHunydEj^in^Array■匚麵咖施匕臨J:VAgieriLStreScirctTjgErrichment帥sicnn碁衣昭丄:相關(guān)產(chǎn)品技術(shù)參數(shù)SureSelectHumanAllExon50MbKi（tNew）捕獲量：50Mb捕獲對象：1、 GENCODEproject中發(fā)現(xiàn)的外顯子（約12M）2、 NCBIConsensusCDSdatabase（CCDS,March2009）中的外顯子3、 SangerV13database中的miRNA4、 多于300條的humannon-codingRNAs（例如snoRNAs和scaRNAs）*AllExon50Mb試劑盒是Agilent與WellcomeTrustSangerInstitute、Gencodeconsortium合作開發(fā)的人全外顯子捕獲試劑盒。在前款產(chǎn)品（SureSelectHumanAllExonKit）的基礎(chǔ)上，加入了WTSanger實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的人外顯子（12Mb），合計為50Mb。這款產(chǎn)品是目前市面上覆蓋最全面的人全外顯子捕獲試劑盒。SureSelectHumanAllExonKit捕獲量：38Mb捕獲對象：1、NCBIConsensusCDSdatabase（CCDS）中的外顯子（約為人類基因組的1.22%）2、 SangerV13database中的miRNA3、多于300條的humannon-codingRNAs(例如snoRNAs和scaRNAs)SureSelectHumanAllExonPlusKit捕獲量：44Mb捕獲對象：在SureSelectHumanAllExonKit的基礎(chǔ)上加入6M可以自主選擇的捕獲區(qū)域（需要用e-Array設(shè)計）AllExonKit與AllExon50MbKi啲覆蓋范圍對比AllExonKitAllExon50MbE(rt謠計時蟄餐的數(shù)捉曄CtDSS@pt.200gGENCODEandsang?r(intfud@$CCDSandBroad-definedvZd)ntentaswell)CCDS(Sept.2009)93.76?&23.93%3Q.S2H65,5SK75,24HmilWA(mift&ase14)W.WW52.7S^GenBank-