工業(yè)微生物菌種選育與保藏

關(guān)于工業(yè)微生物菌種選育與保藏第一頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

由于發(fā)酵工程本身的發(fā)展以及遺傳工程的介入，藻類(lèi)（alga）、病毒（virus）等也正在逐步地變?yōu)楣I(yè)生產(chǎn)用的生物。

盡管如此，目前人們對(duì)微生物的認(rèn)識(shí)還是十分不夠的。已經(jīng)初步研究的不超過(guò)自然界微生物總量的10%左右。

微生物的代謝產(chǎn)物據(jù)統(tǒng)計(jì)已超過(guò)一千三百多種，而大規(guī)模生產(chǎn)的不超過(guò)一百多種；

微生物酶有近千種，而在工業(yè)上利用的不過(guò)四五十種?？梢?jiàn)潛力是很大的。

在工業(yè)生產(chǎn)中常用的微生物主要有細(xì)菌、酵母菌、霉菌和放線菌。第二頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

工業(yè)生產(chǎn)常用的細(xì)菌有

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)

乳酸桿菌(Lactobacilluslactics)

醋酸桿菌(Acetobacter)

棒狀桿菌(Corynebacterium)

短桿菌(Brevibacterium)

用于生產(chǎn)：生產(chǎn)淀粉酶(amylase）蛋白酶（proteinase）乳酸(lacticacid)

醋酸(aceticacid)

氨基酸(aminoacid)

肌苷酸(inosinicacid)

細(xì)菌（bacteria）：屬于單細(xì)胞原核生物（

unicellularprokaryote），以典型的二分分裂(binary)方式繁殖。

細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，環(huán)狀染色體（chromosome）被復(fù)制，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等組分同時(shí)增加一倍，然后在細(xì)胞中部產(chǎn)生一橫段間隔，染色體被分開(kāi)，繼而間隔分裂形成兩個(gè)相同的子細(xì)胞。如間隔不完全分裂就形成鏈狀細(xì)胞。第三頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一第四頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一第五頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一酵母菌（yeast）

酵母菌為單細(xì)胞真核生物（

unicellular

eukaryote），在自然界中普遍存在，主要分布于含糖質(zhì)較多的的酸性環(huán)境中，如水果、蔬菜、花蜜（nectar）和植物葉子上，以及果園土壤中。石油酵母（petroleumyeast）較多地分布在油田周?chē)耐寥乐小?/p>

酵母菌大多為腐生，常以單個(gè)細(xì)胞存在，以發(fā)芽形式進(jìn)行繁殖。母細(xì)胞體積長(zhǎng)到一定程度時(shí)就開(kāi)始發(fā)芽。芽長(zhǎng)大的同時(shí)母細(xì)胞縮小，在母子細(xì)胞間形成隔膜，最后形成同樣大小的兩個(gè)細(xì)胞。如果子芽不與母細(xì)胞脫離就形成鏈狀細(xì)胞，稱(chēng)為假菌絲(pseudomycelium)。

工業(yè)上用的酵母菌有：啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、假絲酵母(Candida)、類(lèi)酵母(Saccharomycodes)等，用于釀酒(Brewing)、制造面包、制造低凝固點(diǎn)石油、生產(chǎn)脂肪酶（lipase），以及生產(chǎn)可食用、藥用和飼料用酵母菌體蛋白等。第六頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)示意圖第七頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

霉菌（mould）

霉菌不是一個(gè)分類(lèi)學(xué)上的名詞。凡生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀、網(wǎng)狀或絮狀菌絲的真菌(fungi)統(tǒng)稱(chēng)為霉菌。霉菌在自然界分布很廣，大量存在于土壤、空氣、水和生物體內(nèi)外等處。它喜歡偏酸性環(huán)境，大多數(shù)為好氧性(aerobiotic)，多腐生，少數(shù)寄生。霉菌的繁殖能力很強(qiáng)，它以無(wú)性孢子和有性孢子進(jìn)行繁殖，大多以無(wú)性孢子繁殖為主。第八頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

生長(zhǎng)方式是菌絲末端的伸長(zhǎng)和頂端分支，彼此交錯(cuò)呈網(wǎng)狀。菌絲的長(zhǎng)度既受遺傳性的控制，又受環(huán)境的影響，其分支數(shù)量取決于環(huán)境條件。菌絲或呈分散生長(zhǎng)，或呈菌絲團(tuán)狀生長(zhǎng)。

工業(yè)上常用的霉菌有：

藻狀菌綱的根霉、毛霉、犁頭霉，子囊菌綱的紅曲霉，半知菌類(lèi)的曲霉、青霉等；

產(chǎn)品：酶制劑（enzymepreparation）、抗生素(antibiotic)、有機(jī)酸（organicacid）及甾體激素（steroidhormone）等。第九頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一例如1、青霉屬青霉素產(chǎn)生菌點(diǎn)青霉菌→→產(chǎn)黃青霉菌→→誘變提高產(chǎn)量青霉：延胡索酸葡萄糖酸2、頭孢霉菌產(chǎn)生頭孢菌素C3、、曲霉菌生產(chǎn)有機(jī)酸、甾體類(lèi)轉(zhuǎn)化第十頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

放線菌(Actinomycetes)

放線菌因菌落呈放線狀而得名。它是一個(gè)原核生物類(lèi)群，在自然界中分布很廣，尤其在含有機(jī)質(zhì)豐富的微堿性土壤中較廣。大多腐生，少數(shù)寄生。放線菌主要以無(wú)性孢子進(jìn)行繁殖，也可借菌絲片段進(jìn)行繁殖。后一種繁殖方式見(jiàn)于液體沉沒(méi)培養(yǎng)（submergedcultures）中。其生長(zhǎng)方式是菌絲末端伸長(zhǎng)和分支，彼此交錯(cuò)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，成為菌絲體。菌絲長(zhǎng)度即受遺傳性的控制，又與環(huán)境相關(guān)。

第十一頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

在液體沉沒(méi)培養(yǎng)中由于攪拌器（agitator）的剪應(yīng)力作用，常常形成短的分支旺盛的菌絲體，或呈分散生長(zhǎng)，或呈菌絲團(tuán)狀生長(zhǎng)。它的最大經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于能產(chǎn)生多種抗生素（antibiotics）。從微生物中發(fā)現(xiàn)的抗生素，有60%以上是放線菌產(chǎn)生的，如鏈霉素、紅霉素、金霉素、慶大霉素等。常用的放線菌主要來(lái)自以下幾個(gè)屬：鏈霉菌屬、小單孢菌屬和諾卡氏菌屬等。第十二頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一1、鏈霉菌屬，是產(chǎn)生抗生素最多的一個(gè)屬鏈霉素灰色鏈霉菌紅霉素紅色鏈霉菌四環(huán)素金色鏈霉菌

2、小單孢菌慶大霉素由絳紅小單孢菌和棘孢小單孢菌產(chǎn)生。第十三頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

其他生物：

A:擔(dān)子菌（Basidiomycetes

）：所謂的擔(dān)子菌就是人們通常所說(shuō)的菇類(lèi)(mushroom)生物。擔(dān)子菌資源的利用正愈來(lái)愈引起人們的重視，如多糖(polysaccharide)、抗癌(anticancer)藥物的開(kāi)發(fā)。近幾年來(lái)，日本、美國(guó)的一些科學(xué)家對(duì)香菇的抗癌作用進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)香菇中的“1，2-β-葡萄糖苷酶”及兩種糖類(lèi)物質(zhì)具有抗癌作用。

第十四頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

B：病毒(virus)

其特點(diǎn)如下：

1.

形體微小，體積比細(xì)菌小的多。

2.沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，是一種獨(dú)特分子的生物，主要由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。

3.營(yíng)寄生生活，由于缺乏獨(dú)立代謝的酶體系，不能脫離寄主而自行生長(zhǎng)繁殖，有專(zhuān)一性。人類(lèi)免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）獲得性免疫缺陷綜合癥（acquiredimmunodeficiencysyndrome，

AIDS

）第十五頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一第十六頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

噬菌體（phage）是病毒的一種。

Ｑ：烈性噬菌體和溫和噬菌體概念與區(qū)別。噬菌體在寄主細(xì)胞中的生長(zhǎng)繁殖過(guò)程可分為吸附、浸入、增殖、成熟和釋放。第十七頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一C：藻類(lèi)（alga）：培養(yǎng)螺旋藻，按干重計(jì)算每公頃可收獲60噸，而種植大豆每公頃才可獲4噸；從蛋白質(zhì)產(chǎn)率來(lái)看，螺旋藻是大豆28倍。培養(yǎng)珊列藻，從蛋白質(zhì)產(chǎn)率計(jì)算，每公頃珊列藻所得蛋白質(zhì)是小麥的20-35倍。此外，還可通過(guò)藻類(lèi)將CO２轉(zhuǎn)變?yōu)槭?，培養(yǎng)單胞藻或其他藻類(lèi)而獲得的石油，可占細(xì)胞干重的5%-50%,合成的油與重油相同，加工后可轉(zhuǎn)變汽油、煤油、和其他產(chǎn)品。有的國(guó)家已建立培植單胞藻的農(nóng)場(chǎng)，每年每公頃地培植的單胞藻按5%干物質(zhì)為碳水化合物（石油）計(jì)算，可得60噸石油燃料。此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用，還可減輕因工業(yè)生產(chǎn)而大量排放CO２造成的溫室效應(yīng)。國(guó)外還有人從“藻類(lèi)農(nóng)場(chǎng)”獲取氫能的報(bào)道，大量培養(yǎng)藻類(lèi)，利用其光合放氫作用來(lái)取得氫能。第十八頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一藻類(lèi)工廠第十九頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

二、微生物工業(yè)對(duì)菌種的要求

目前，隨著微生物工業(yè)原料的轉(zhuǎn)換和新產(chǎn)品的不斷出現(xiàn)，勢(shì)必要求開(kāi)拓更多新品種。盡管微生物工業(yè)用的菌種多種多樣，但作為大規(guī)模生產(chǎn)，對(duì)菌種則有下列要求：

(1)廉價(jià)原料、生長(zhǎng)迅速、目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。(2)易于控制培養(yǎng)條件，酶活性高；發(fā)酵周期較短。(3)抗雜菌和噬菌體的能力強(qiáng)。(4)菌種純，不易變異和退化，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素，保證安全生產(chǎn)。

第二十頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

在篩選所需的菌種時(shí)應(yīng)考慮的一些重要的指標(biāo)：（1）菌種的營(yíng)養(yǎng)特征：（2）菌種的生長(zhǎng)溫度：（3）菌種對(duì)所采用的設(shè)備及生產(chǎn)過(guò)程的適應(yīng)性：（4）菌種的穩(wěn)定性：（5）產(chǎn)物的得率和產(chǎn)物的濃度：（6）產(chǎn)物容易回收：能滿足（3）~（6），則有希望成為效益較高的生產(chǎn)菌種。第二十一頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一第二節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯與保藏菌種退化是指經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間傳代保藏后，菌株的一個(gè)或多個(gè)生理性狀和形態(tài)特征逐漸減退或消失的現(xiàn)象。第二十二頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

一、微生物菌種衰退的原因

1.原因一是菌種保藏不妥;

二是菌種生長(zhǎng)的要求沒(méi)有得到滿足，或是遇到不利的條件，或是失去某些需要的條件；三是經(jīng)誘變獲得的新菌株發(fā)生回復(fù)突變，從而喪失新的特征的情況。連續(xù)傳代是菌種退化的直接原因，這是由于菌種經(jīng)常處于旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài)。衰退菌株的特點(diǎn)：個(gè)體或群體特征發(fā)生變化；生產(chǎn)能力降低；代謝能力降低；發(fā)酵周期延長(zhǎng)；抗不良環(huán)境能力降低。

第二十三頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

2防止菌種衰退的措施

菌種的分離:

因?yàn)樵诰N發(fā)生衰退的同時(shí)，并不是所有的菌體都衰退，其中未衰退的菌體往往是經(jīng)過(guò)環(huán)境條件考驗(yàn)的，具有更強(qiáng)的生產(chǎn)能力。因此，對(duì)于已衰退的菌株采用單細(xì)胞菌株分離的措施，即用稀釋平板法或用平板劃線法，以取得單細(xì)胞所長(zhǎng)成的菌落（colony），再通過(guò)菌落和菌體的特征分析和性能測(cè)定，就可獲得具有原來(lái)形狀的菌株，甚至性能更好的菌株（strain）。

如果菌種已經(jīng)發(fā)生退化，產(chǎn)量下降，則要進(jìn)行分離復(fù)壯。第二十四頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

如對(duì)芽孢桿菌(Bacillus)，可先將菌液用沸水處理幾分鐘，再用平板進(jìn)行分離，從所剩下的孢子中挑選出最優(yōu)的菌體。如果遇到某些菌株即使進(jìn)行單細(xì)胞分離，仍不能達(dá)到復(fù)壯的效果，則可改變培養(yǎng)條件，達(dá)到復(fù)壯的目的。

如AT3.942棲土曲霉(Aspergillusterricola)的產(chǎn)孢子能力下降，可適當(dāng)提高培養(yǎng)溫度，恢復(fù)其能力。同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇一種有利于高產(chǎn)菌株而不利于低產(chǎn)菌株的培養(yǎng)條件。第二十五頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

其它防衰措施菌種的復(fù)壯提供良好的環(huán)境條件使用優(yōu)良的保存方法定期純化菌種第二十六頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、菌種的復(fù)壯通過(guò)分離達(dá)到復(fù)壯:菌落純/細(xì)胞純?cè)诃傊桨鍎澗€、涂布或與瓊脂培養(yǎng)基混合培養(yǎng)再分離，達(dá)到—菌落純

采用單細(xì)胞或單孢子分離法達(dá)到—細(xì)胞純通過(guò)寄主體達(dá)到復(fù)壯:

對(duì)于寄生性微生物的退化菌株,將菌株接種到寄主細(xì)胞進(jìn)行繁殖達(dá)到復(fù)壯。第二十七頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

三、菌種保藏（strainpreservation）

基本原理：根據(jù)菌種的生理、生化特點(diǎn)，人為地創(chuàng)造條件，使菌種的代謝活動(dòng)處于休眠狀態(tài)。

要求：維持菌種的存活和減少菌種的變異，盡量使菌種保持原來(lái)優(yōu)良的生產(chǎn)性能。保藏時(shí)首先選擇優(yōu)良純菌種，最好是它們的休眠體如孢子（

spore）、芽孢(gemma)等；其次是要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)有利于休眠的環(huán)境條件，如低溫、干燥、缺氧和缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，使菌體的代謝活動(dòng)處于最低狀態(tài)，延長(zhǎng)其保存期。第二十八頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

保存方法：

應(yīng)能較長(zhǎng)期地保存原有菌種的優(yōu)良性能，使菌種穩(wěn)定，同時(shí)也要考慮到方法本身的經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便。不同的菌種有不同的保存方法，以便長(zhǎng)期保藏。

酵母菌：定期移植斜面低溫保藏法。也可采用石蠟油封保藏法。

霉菌：斜面保藏法和沙土管保藏法。

細(xì)菌和放線菌：一般細(xì)菌以采用冷凍干燥保藏法為佳。放線菌可用沙土或冷凍保藏法保藏。短期可采用斜面保藏。

保藏應(yīng)注意的問(wèn)題：

菌體狀態(tài)：休眠體基質(zhì)：營(yíng)養(yǎng)貧乏操作過(guò)程：不應(yīng)對(duì)細(xì)胞造成傷害第二十九頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

工業(yè)生產(chǎn)中微生物育種的基本方法包括自然選育、誘變育種、抗性菌種選育、代謝控制育種及基因重組定向育種等。育種就是要改善菌種的特性，使之能提高產(chǎn)量、改進(jìn)質(zhì)量、降低成本、改進(jìn)工藝、方便管理及綜合利用等。

代謝控制育種主要有兩個(gè)方面：改變代謝通路的育種改變代謝自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的育種第三節(jié)菌種的選育第三十頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

一、自然選育

采樣增殖培養(yǎng)從自然界選育菌株純種分離性能鑒定從自發(fā)突變中選育菌株第三十一頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

二、誘變育種

按照生產(chǎn)的要求，根據(jù)生物的遺傳和變異的理論，用人工的方法造成菌種變異，再經(jīng)過(guò)篩選、而達(dá)到菌種誘變選育的目的。

誘變育種一般采用物理、化學(xué)誘變劑使微生物DNA的堿基排列發(fā)生變化，以使排列錯(cuò)誤的DNA模板形成異常的遺轉(zhuǎn)信息，造成某些蛋白結(jié)構(gòu)變異，而使細(xì)胞功能發(fā)生改變。

第三十二頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一原種（出發(fā)菌株）純化斜面培養(yǎng)完全培養(yǎng)基同步培養(yǎng)離心洗滌玻璃珠震蕩分散過(guò)濾單細(xì)胞或孢子懸浮液

活菌計(jì)數(shù)誘變處理誘變處理預(yù)備實(shí)驗(yàn)

處理液活菌計(jì)數(shù)平板分離

形態(tài)變異并計(jì)算其變異率斜面培養(yǎng)

初篩、復(fù)篩自然分離和再?gòu)?fù)篩

保藏及擴(kuò)大試驗(yàn)誘變育種第三十三頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

出發(fā)菌株的選擇誘變劑的選擇誘變操作及培養(yǎng)突變株的篩選突變高產(chǎn)基因的表現(xiàn)形態(tài)突變高產(chǎn)突變耐藥性突變營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變第三十四頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一出發(fā)菌株（parentstrain）選擇應(yīng)考慮的問(wèn)題出發(fā)菌株的穩(wěn)定性：選用具備優(yōu)良特性的菌株：挑選對(duì)誘變劑敏感的菌株：注意菌株的生理狀態(tài)及生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間：

野生菌株自發(fā)突變后獲得的高產(chǎn)菌株已經(jīng)誘變過(guò)的菌株出發(fā)菌株第三十五頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一考慮試驗(yàn)菌株的遺傳背景：各種誘變劑有不同的作用機(jī)制，一種誘變劑的作用常主要集中在DNA的某些特異部位上，多次反復(fù)用一種誘變因子易出現(xiàn)“飽和”或恢復(fù)突變現(xiàn)象，因此誘變時(shí)常采用多種不同的誘變因子或復(fù)合誘變因子。誘變劑的選擇菌懸液的制備

單細(xì)胞懸浮液：106個(gè)/mL

孢子懸浮液：108個(gè)/mL誘變：預(yù)實(shí)驗(yàn)確定適宜的誘變條件篩選：選擇合適的篩選方法第三十六頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一紫外線誘變紫外線是應(yīng)用最廣、研究最多、最經(jīng)濟(jì)、誘變效果較理想的誘變劑，

紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長(zhǎng)為2537A．燈與處理物的距離為15～30cm，照射時(shí)間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在70～80%為宜。第三十七頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一被照射的菌懸液細(xì)胞數(shù)，細(xì)菌為106個(gè)/ml左右，霉菌孢子和酵母細(xì)胞為106～107個(gè)/ml。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，要求照射液不要太深，約0.5～1.0cm厚，同時(shí)要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使照射均勻。由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時(shí)和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。第三十八頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

操作步驟

1．將細(xì)菌培養(yǎng)液以3000r／min離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無(wú)菌生理鹽水再離心洗滌。

2．將菌懸液放入一已滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)用手搖動(dòng)，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過(guò)濾，單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細(xì)胞液含細(xì)胞數(shù)可達(dá)108個(gè)／ml左右，作為待處理菌懸液。第三十九頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一3．取2～4m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無(wú)菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應(yīng)先開(kāi)紫外線10min，讓紫外燈預(yù)熱，然后開(kāi)啟皿蓋正式在攪拌下照射10～50s。操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行，或用黑紙包住，避免白熾光。第四十頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一4．取未照射的制備菌液和照射菌液各0.5ml進(jìn)行稀釋分離，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。5．取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶?jī)?nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120r／min振蕩培養(yǎng)4～6h。6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。7．挑取菌落進(jìn)行篩選。第四十一頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一氮芥的誘變作用:常用其鹽酸鹽，為白色粉末，在碳酸氫鈉存在的情況下，呈游離狀態(tài)，再與微生物細(xì)胞作用，引起誘變?？捎酶拾彼峤舛?。使用方法：1配制活化劑和解毒劑，高壓滅菌備用，活化劑：取碳酸氫鈉68g溶于10ml蒸餾水中即可；解毒劑：碳酸氫鈉136mg,甘氨酸120mg,溶解于200ml水中。第四十二頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一2氮芥鹽酸鹽溶液的配制：所有用品滅菌、烘干，取約10mg氮芥鹽酸鹽放入一小瓶，加入蒸餾水2ml，加蓋橡皮塞即可。3吸取1ml孢子懸液（200萬(wàn)孢子/ml）加入一滅菌小瓶，加入0.6ml緩沖液，再加入0.4ml氮芥溶液，加蓋橡皮塞，搖勻，此時(shí)氮芥作用濃度1mg/ml.4加氮芥溶液30s后計(jì)時(shí)，到時(shí)間后，取0.1ml作用液加入9.9ml解毒液中，使停止作用。第四十三頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一亞硝基胍誘變曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或NTG)對(duì)真核或原核微生物都有強(qiáng)烈的誘變作用。其精確的作用機(jī)制尚不很清楚，據(jù)認(rèn)為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強(qiáng)。第四十四頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一(二)操作步驟1．單孢子懸液制備取斜面，加入6ml0.1mol／LpH6.o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過(guò)帶濾紙漏斗過(guò)濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達(dá)l06個(gè)／ml，此為待處理孢子懸液。2．MNNG溶液的制備用分析天平稱(chēng)取2mg，加入2ml0.1mol／LpH6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。第四十五頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一3．誘變處理吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子懸液中，30℃振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-4兩個(gè)稀釋度分離培養(yǎng)，30℃3天后計(jì)數(shù)。4．死亡率計(jì)算將未處理的孢子液1ml加入1ml磷酸緩沖液中，同上逐級(jí)稀釋分離，30℃下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計(jì)算出死亡率。5．挑取菌落進(jìn)行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選第四十六頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

隨機(jī)篩選方法：菌種經(jīng)誘變處理后,進(jìn)行平板分離,隨機(jī)挑選單菌落,從中篩選高產(chǎn)菌株。為了提高篩選效率，發(fā)展了一些快速篩選方法（包括搖瓶篩選法，瓊脂塊篩選法等），并歸納出篩選高產(chǎn)菌的培養(yǎng)基選擇準(zhǔn)則:

1、制備一系列含有各種類(lèi)型營(yíng)養(yǎng)成分（生長(zhǎng)限制因素）培養(yǎng)基；

2、避免使用容易同化的碳源或氮源，（引起分解代謝物阻遏）；

3、加入緩沖液以減少pH的變化；

4、確定含有所需的輔助因子。。第四十七頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一

生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌（對(duì)應(yīng)于營(yíng)養(yǎng)缺陷型）的篩選：通過(guò)觀察分離菌能否促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotroph）的生長(zhǎng)，便可檢出生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌。

抗反饋突變株（抗結(jié)構(gòu)類(lèi)似物）的篩選：結(jié)構(gòu)類(lèi)似物具有和代謝產(chǎn)物相似的反饋調(diào)節(jié)作用，但又不同于代謝物，不具有正常的生理功能，對(duì)細(xì)胞代謝又阻礙作用。由于突破了原有的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，這些突變株就可以產(chǎn)生大量的該種代謝物。理性化篩選第四十八頁(yè)，共五十五頁(yè)，編輯于2023年，星期一高通量篩選（highthroughputscreening):將許多模型固定在各自不同的載體上，用機(jī)器人加樣，培養(yǎng)后用計(jì)算機(jī)記錄結(jié)果，并進(jìn)行分析，使篩選從繁重的勞動(dòng)中解脫出來(lái)，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模篩選。細(xì)胞模型：觀察待測(cè)樣品對(duì)細(xì)胞的作用，只能反映藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)等過(guò)程的綜合作用，不能反映作用的途徑和靶點(diǎn)。包括各種正常細(xì)胞和病理細(xì)胞。