口腔粘膜細(xì)胞基因組制備

關(guān)于口腔粘膜細(xì)胞基因組制備第一頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern雜交（包括RFLP）及PCR分離基因等。是一般的基因工程實(shí)驗(yàn)中DNA操作的最初步驟。

一、基因組DNA的提取與純化目的：第二頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日核酸分離純化的總原則：

保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)完整排除其它分子的污染：細(xì)胞內(nèi)：蛋白質(zhì)、脂類、糖、RNA等提取過程中：有機(jī)熔劑、金屬離子、外源DNA

第三頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日細(xì)胞樣品的核酸提取的主要步驟破碎細(xì)胞去除細(xì)胞內(nèi)的其它分子：蛋白質(zhì)多糖脂類去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)第四頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日核酸提取注意事項(xiàng)減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解如過量酸堿減少物理因素對(duì)核酸的降解機(jī)械剪切力：強(qiáng)烈震蕩、滲透壓急劇改變、反復(fù)凍融高溫防止核酸的生物降解核酸酶的預(yù)防

第五頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日二、人基因組DNA的制備

實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x：從人口腔上皮細(xì)胞中提取純的基因組DNA掌握基因組DNA抽提的方法，理解核酸分離純化的基本原理第六頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日分離純化基因組DNA的常用方法：不同生物（植物、動(dòng)物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同，分離方法也有差異。主要根據(jù)不同細(xì)胞的特點(diǎn)而有區(qū)別，但原理相似，因此它們有共同的步驟：

裂解細(xì)胞：SDS裂解細(xì)胞，EDTA抑制核酸酶

除去蛋白質(zhì)：蛋白酶K水解蛋白質(zhì)，酚和氯仿/異戊醇抽提、分離蛋白質(zhì)；析出DNA：乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。第七頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日實(shí)驗(yàn)材料及試劑材料：人口腔上皮細(xì)胞試劑：抽提緩沖液：Tris-ClpH8.0，EDTA，NaCl，RNAase，SDS，蛋白酶K水飽和酚氯仿/異戊醇（V/V=24:1）75%乙醇、95%乙醇TE緩沖液：Tris，EDTA第八頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日主要試劑的功能抽提緩沖液：由SDS、EDTA、蛋白酶K組成SDS的作用是裂解細(xì)胞EDTA的作用是絡(luò)合掉鎂等二價(jià)金屬離子，防止DNA酶對(duì)DNA分子的降解作用。蛋白酶K的作用是水解蛋白質(zhì)。酚和氯仿/異戊醇：抽提分離蛋白質(zhì)乙醇：沉淀DNATE：溶解DNA第九頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日取材:用生理鹽水漱口后，口含生理鹽水10~15ml約2~3min，用15ml離心管（4000rpm

10min）收集細(xì)胞沉淀①

（離心機(jī)的使用，平衡）

加入0.5ml抽提緩沖液，重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管

（微量移液器的正確使用）混勻，65℃溫育30min

加入等體積的飽和酚(0.5ml)，充分顛倒混勻（不要震蕩?。㏄13實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)（一人一組）：

第十頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日12000rpm5min②，上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管

（高速離心機(jī)的使用與安全意識(shí)）

加入等體積氯仿/異戊醇，顛倒混勻12000rpm5min，上層水相轉(zhuǎn)移到新的EP管

加入2倍體積95%的乙醇，顛倒混勻12000rpm10min

③

第十一頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日第十二頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日棄上清，沉淀中加入75%乙醇

12000rpm2min

④

輕輕棄去上清，打開EP蓋，室溫靜置5~10min

加入30l0.1×TE溶液，充分混勻后檢測(cè)結(jié)果

第十三頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)微量移液器的正確使用離心機(jī)的正確使用上課紀(jì)律撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告的規(guī)范第十四頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其分析

定性分析：DNA瓊脂糖凝膠電泳PCR-SSCP多態(tài)性分析下次實(shí)驗(yàn)課進(jìn)行第十五頁，共十七頁，編輯于2023年，星期日常見問題：

1、提取的DNA不純：變性不充分；關(guān)鍵過程反應(yīng)時(shí)間過短；離心時(shí)間或速度不夠。2、提取的DNA成涂布狀：操作過程中用力過猛，動(dòng)作粗暴；操作系統(tǒng)有污染。