rna干擾與腫瘤研究及治療

rna干擾與腫瘤研究及治療第1頁/共20頁一、背景介紹2023/3/182

RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是一種由短雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsDNA)所引起的序列特異性基因沉默,是真核生物體內(nèi)一種阻斷外源基因表達的自我防御體系,是dsDNA介導(dǎo)的,使與其互補的具有同源序列的單鏈RNA進行特異性降解的過程。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)最早是由Mello和Fire等1998年在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。RNAi作為一種簡單、高效的基因敲除工具，正在基因組學(xué)和疾病基因治療領(lǐng)域掀起一場革命，為腫瘤的基因治療提供了新思路，可能成為今后的腫瘤治療策略之一。第2頁/共20頁二、RNA干擾作用機制2023/3/183轉(zhuǎn)錄水平轉(zhuǎn)錄后水平翻譯水平RNA干擾的作用是在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平等多個不同層次上實現(xiàn)的。三個水平第3頁/共20頁轉(zhuǎn)錄后水平起始階段內(nèi)源或外源的dsRNA由核酸酶III(RNaseIII)-Dicer在細胞內(nèi)將dsRNA均勻切割成小干擾RNA(siRNA),長度約為21-23nt。其中5’端是磷酸端,3’端常帶有突出的非配對堿基(多數(shù)是UU)效應(yīng)階段SiRNA結(jié)合一個核糖核酶復(fù)合物,形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)，siRNA雙鏈解旋，正義鏈釋放,激活RISC,RISC識別靶mRNA,siRNA反義鏈與mRNA換位,在距siRNA3端12nt處切割靶mRNA,從而實現(xiàn)對mRNA的降解。擴增階段siRNA作為prime，特異性與靶mRNA結(jié)合,再次形成新的dsRNA，接著dsRNA再次被Dicer切割成siRNA,新形成的siRNA為實現(xiàn)數(shù)量擴增的目的,進入下一輪循環(huán),顯著抑制了對靶基因的表達。2023/3/184第4頁/共20頁2023/3/185第5頁/共20頁轉(zhuǎn)錄水平2023/3/186小分子干擾核糖核酸(siRNA)與互補DNA直接結(jié)合而發(fā)揮作用,激發(fā)同源DNA甲基化的加強,使目的基因轉(zhuǎn)錄受限,表達關(guān)閉,進而加強基因沉默。如果甲基化出現(xiàn)在啟動子區(qū)域,則轉(zhuǎn)錄不能進行,若甲基化出現(xiàn)在編碼區(qū),則轉(zhuǎn)錄進行,但在轉(zhuǎn)錄后水平上沉默。第6頁/共20頁翻譯水平2023/3/187翻譯水平上的RNAi是抑制相應(yīng)mRNA的翻譯,使相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達受阻,其中起重要作用的是小時序RNA(smalltemporalRNA,stRNA),它是由長度約70nt的RNA形成的莖環(huán)樣前體經(jīng)dicer酶作用后形成長約21~23nt的dsRNA,通過RISC結(jié)合在相應(yīng)mRNA的3'末端非翻譯區(qū)上,進而阻斷mRNA的翻譯。第7頁/共20頁三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用2023/3/188（一）RNA干擾在腫瘤研究中的應(yīng)用1.基因功能研究：由于RNA干擾能高效特異地阻斷基因表達，通過基因沉默機制作用于癌基因、抑癌基因表達，影響腫瘤生長，在體外培養(yǎng)細胞中研究靶基因的功能。因而成為研究基因功能很好的工具。例如：腫瘤易感基因篩查和鑒定，Williams等通過結(jié)合cDNA芯片技術(shù)和RNAi技術(shù)鑒定了多個結(jié)腸癌高度相關(guān)基因。第8頁/共20頁三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用2023/3/1892.腫瘤發(fā)生機制研究:設(shè)計多種小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）,可以產(chǎn)生多基因沉默的效果，用于細胞信號傳導(dǎo)通路的研究。Harvey等用RNAi技術(shù)抑制Brk蛋白表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞的增生受到抑制。同時還發(fā)現(xiàn)Brk的無激酶活性突變體，可以接合器的形式，通過非激酶依賴的機制，促進腫瘤細胞的生長。結(jié)果表明Brk可作為乳腺癌治療的新目標。第9頁/共20頁三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用2023/3/1810（二）RNA干擾在腫瘤治療中的應(yīng)用1.不同siRNA之間的增效作用由于腫瘤是一種多基因調(diào)控的疾病，采用RNA干擾技術(shù)對腫瘤相關(guān)基因進行多重抑制會產(chǎn)生更好的療效。邵榮光針對不同的腫瘤相關(guān)基因，設(shè)計合成了靶向bcl-2、cdk-2、mdm-2、H-ras、pkc-α的siRNA,這些siRNA各自都能抑制黑色素瘤細胞的增殖，其抑制率分別為68%、64%、72%、74%和53%。當5種siRNA聯(lián)合應(yīng)用時，能顯著提高復(fù)合siRNA對黑色素瘤細胞的抑制作用。第10頁/共20頁三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用2023/3/18112.SiRNA對靶分子藥物具的增效作用

表皮生長因子受體（EGFR）抑制劑埃羅替尼（erlotinib）被批準在臨床上應(yīng)用，但大多數(shù)晚期肺癌患者不應(yīng)答,早期肺癌患者總是發(fā)展為耐藥性,占一半的復(fù)發(fā)患者T790M-EGFR基因發(fā)生了突變。研究證明，領(lǐng)用RNA干擾技術(shù)敲除肝細胞生長因子受體（MET）和表皮生長因子受體（EGFR），能顯著的促進埃羅替尼耐藥的H1975細胞凋亡。第11頁/共20頁三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用2023/3/18123.siRNA對DNA損傷劑的增效作用5-FU(5-氟尿嘧啶)或羥基喜樹堿為兩種常用的抗腫瘤藥物，研究證明，Bcl-2/Bcl-xlsiRNA轉(zhuǎn)染細胞對5-FU(5-氟尿嘧啶)或羥基喜樹堿表現(xiàn)出更高的敏感性，提示Bcl-2/Bcl-xlsiRNA介導(dǎo)的基因沉默結(jié)合化療藥物可能是潛在的人肝癌治療策略。第12頁/共20頁三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用2023/3/18134.siRNA對放療的增敏作用MDM2蛋白被證明在輻射應(yīng)答和腫瘤放射敏感性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用,是一個有吸引力的臨床藥物靶標,利用RNA干擾技術(shù)抑制MDM2可以加強腫瘤對放射治療的敏感性。第13頁/共20頁三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用2023/3/18145.抗腫瘤新藥研發(fā)

利用RNAi特異性地抑制癌細胞內(nèi)的內(nèi)源性致癌基因的表達,而不影響正常細胞的基因表達,在研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號通路以及表型變化可以發(fā)揮極大的作用,從而可以進一步為腫瘤的早期診斷和后期治療找尋新的靶點。siRNA從發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在的短十幾年時間內(nèi),很多研究工作者、生物技術(shù)公司和制藥公司己經(jīng)開始廣泛利用siRNA藥物治療腫瘤。2008年,美國CalandoPharmaceuticals公司祀向核糖核苷酸還原酶M2亞基(M2subunitofribonucleotidereductase,RRM2)取得了突破性的進展,申請的治療實體腫瘤的siRNA藥物CALAA-01被美國H)A批準進入臨床試驗I期,成為最早siRNA藥物治療癌癥的首例臨床試驗。

第14頁/共20頁三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用2023/3/18152009年7月,德國著名制藥公司SilenceTherapeutics公司開展了治療實體腫瘤的靶向蛋白激酶PKN-3基因RNA干擾藥物Atu027的I期臨床試驗,2011年,該公司報道了其進展,資料顯示,24名患者經(jīng)過Atu027多次治療后,有9名患者病情穩(wěn)定,6名患者的較好療效表現(xiàn)在研究終點(治療3個月),另外3名患者還在接受治療,目前的結(jié)果還比較令人滿意。

2010年12月,加拿大Tekmira制藥公司宣布開始siRNA藥物TKM-080301(靶向腫瘤細胞高表達的polo樣激酶I(polo-likekinaseI,Plkl))的I期臨床試驗。目前臨床前研究證明TKM-080301能特異性地殺死腫瘤細胞,而對正常細胞無明顯毒副作用,對肝癌以及肝外腫瘤都有很好的抗腫瘤效果。

第15頁/共20頁三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用2023/3/1816（三）RNA干擾技術(shù)在腫瘤治療方面的優(yōu)勢

與基因替代、反義核苷酸治療、細胞因子基因治療方法相比，RNAi技術(shù)有著無可比擬的優(yōu)勢。1.RNAi基因抑制效果確切：微量的siRNA即可使其編碼致病基因產(chǎn)物的含量下降90%以上。因此，注入少量的siRNA足以產(chǎn)生強大的干擾效應(yīng)，減少了傳統(tǒng)基因治療方法大劑量用藥帶來的毒副作用及免疫效應(yīng)。第16頁/共20頁三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用2023/3/18172.RNAi抑制具有嚴格的序列特異性，將一段與基因同源的siRNA注入細胞，它可以特異性地干擾相應(yīng)基因的表達，其他基因即使與靶基因同屬于一個基因家族也不會受到干擾。因此，RNAi干擾治療的針對性很強，副作用小。3.腫瘤是多基因、多因素疾病，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制腫瘤的生長，，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計針對這一區(qū)段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以剔除多個基因，也可以同時注射多種dsRNA而將多個序列不相關(guān)的基因同時剔除，而且抑制效果互補干擾。第17頁/共20頁四、問題及展望2023/3/1818（一）RNA干擾技術(shù)在腫瘤治療方面要克服的問題理論上只有在siRNA和靶mRNA特異性結(jié)合才會沉默靶基因表達。脫靶效應(yīng)在疾病治療上存在潛在的危險。由拖把效應(yīng)產(chǎn)生的意外的基因調(diào)控成為RNAi技術(shù)治療的一個主要障礙。一些研宄工作者發(fā)現(xiàn),由于siRNA的特殊結(jié)構(gòu)、序列以及藥物釋放方式,會引起人體強烈的先天免疫反應(yīng),刺激干擾素和炎癥細胞因子等化學(xué)物質(zhì)的釋放。由于siRNA本身穩(wěn)定性差,穿透細胞膜的能力差,無靶向功能,在生理環(huán)境中極不穩(wěn)定,易被血清中的酶迅速降解,被肝臟和腎臟清除,因此如何siRNA體內(nèi)給藥以及開發(fā)siRNA輸送體系是siRNA療法的最大挑戰(zhàn)。免疫刺激系統(tǒng)給藥脫靶效應(yīng)第18頁/共20頁四、問題及展望2023/3/1819（二）