C細(xì)菌革蘭氏染色法

C細(xì)菌革蘭氏染色法第1頁/共11頁油鏡提高分辨率基本原理油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間是隔一層油質(zhì)。如香柏油的折射率n=1.52，與玻璃相同。光線通過不減低視野的照明度；主要能增加數(shù)值孔徑，提高顯微鏡的放大效能。分辨率=λ/2NAλ=光波波長（物鏡的數(shù)值孔徑值）NA=n×sinαα=鏡口角的半數(shù)可知n（介質(zhì)折射率）對提高顯微鏡的分辯力起著關(guān)鍵性的作用。第2頁/共11頁革蘭氏染色基本原理細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。草酸銨結(jié)晶紫初染成藍(lán)紫色，碘液媒染形成碘-結(jié)晶紫復(fù)合物，增強(qiáng)了染料在菌體中的滯留能力，兩種細(xì)菌的脫色效果不同，蕃紅復(fù)染。革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂質(zhì)含量低，肽聚糖本身并不結(jié)合染料，但其所具有的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)可以滯留碘-結(jié)晶紫復(fù)合物，現(xiàn)在一般認(rèn)為乙醇處理可以使肽聚糖網(wǎng)孔收縮而使碘-結(jié)晶紫復(fù)合物滯留在細(xì)胞壁，菌體保持原有的藍(lán)紫色。而革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖含量低，交聯(lián)度低，壁薄且脂質(zhì)含量高，乙醇處理時脂質(zhì)溶解，細(xì)胞壁通透性增加，原先滯留在細(xì)胞壁中的碘-結(jié)晶紫復(fù)合物容易被洗脫下來，菌體變?yōu)闊o色，用復(fù)染劑（如番紅）染色后又變?yōu)閺?fù)染劑顏色（紅）。第3頁/共11頁細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)圖第4頁/共11頁實驗用品菌種：大腸桿菌24h牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)物，枯草芽孢桿菌12h～18h牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)物。試劑：革蘭氏染液，草酸銨結(jié)晶紫染液，盧戈氏（Lugol）碘液，95%乙醇，番紅復(fù)染液等。儀器和其他用品：酒精燈，載玻片，顯微鏡，雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，接種環(huán)，試管架，鑷子，載玻片夾子，載玻片支架，濾紙，滴管和無菌生理鹽水等。第5頁/共11頁方法步驟A.初染B.水洗C.媒染D.水洗E.脫色F.水洗G.復(fù)染H.水洗I.吸干第6頁/共11頁獲得本實驗成功的關(guān)鍵選用活躍生長期菌種染色，老齡的革蘭氏陽性細(xì)菌會被染成紅色而造成假陰性。涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性。脫色是革蘭氏染色是否成功的關(guān)鍵，脫色不夠造成假陽性，脫色過度造成假陰性。第7頁/共11頁注意事項涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性；火焰固定不宜過熱（以玻片不燙手為宜）。加熱時使用載玻片夾子及試管夾，以免燙傷。顏色判斷以分散開的細(xì)菌顏色為準(zhǔn)。使用染料時注意避免沾到衣物上。使用乙醇脫色時勿靠近火焰。實驗后洗手。第8頁/共11頁實驗結(jié)果分別繪制菌體形態(tài)圖，并描述其特征。填表菌名菌體顏色細(xì)菌形態(tài)結(jié)果（G+,G-）第9頁/共11頁思考題現(xiàn)有一株未知桿菌，個體明顯大于大腸桿菌，請你鑒定該菌是革蘭氏陽性還是革蘭氏陰性，如何確定你染色結(jié)果的正確性？為什