感染性疾病分子診斷

病因內(nèi)因和外因兩大類(lèi)內(nèi)因主要指遺傳因素，如基因結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)狀況的改變，其中基因結(jié)構(gòu)的改變包括點(diǎn)突變、插入、缺失、重排、易位、基因結(jié)構(gòu)多態(tài)性變異、前病毒插入等；而基因表達(dá)狀況改變則包括轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)或表達(dá)量的異常。外因是指外在的環(huán)境因素，如生活方式、工作環(huán)境、精神狀況和各種感染性病原體的侵入等。當(dāng)前1頁(yè)，總共100頁(yè)。第十章感染性疾病的分子診斷分子診斷（moleculardiagnosis）是指通過(guò)檢測(cè)基因的結(jié)構(gòu)異?；蚱浔磉_(dá)異常，對(duì)人體的健康狀態(tài)和疾病作出診斷的方法。評(píng)估基因的存在和缺陷通常以DNA為材料，而評(píng)估基因的表達(dá)量則以基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的產(chǎn)物RNA/蛋白質(zhì)分析來(lái)評(píng)估個(gè)體的生理/病理狀態(tài)。當(dāng)前2頁(yè)，總共100頁(yè)。分子診斷技術(shù)主要包括核酸雜交聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）基因芯片技術(shù)當(dāng)前3頁(yè)，總共100頁(yè)。感染性疾病即由病原微生物引起的疾病的統(tǒng)稱(chēng)。外源性感染：指由外界致病病原體侵人人體后導(dǎo)致的感染，如傷寒、病毒性肝炎等多為外源性感染。

內(nèi)源性感染：指由人體自身的正常菌群，在人體免疫功能下降時(shí)引起的感染，因?yàn)檫@些細(xì)菌必須在一定條件下才能致病，所以又稱(chēng)為條件致病菌或機(jī)會(huì)致病菌，如腸道菌群中的大腸埃希菌、腸球菌等引起的感染多為內(nèi)源性感染。

當(dāng)前4頁(yè)，總共100頁(yè)。分子診斷對(duì)感染性疾病可用于以下幾個(gè)方面：

適用不易培養(yǎng)的；種屬鑒定；早期診斷；動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；流行病學(xué)調(diào)查；基因分型；耐藥檢測(cè)。當(dāng)前5頁(yè)，總共100頁(yè)。感染性病原體進(jìn)行分子診斷，取決于兩個(gè)條件：一是在該病原體核酸中有特異的核酸序列（感染性病原體本身含有一些保守序列，即使在不同的基因型這些保守序列的變異也很小，因此可以根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)探針或引物）；二是能夠根據(jù)特異的核酸序列設(shè)計(jì)和制備具有特定信號(hào)的探針或設(shè)計(jì)合成相應(yīng)PCR引物，多數(shù)感染性疾病的病原體都具備上述兩個(gè)條件。當(dāng)前6頁(yè)，總共100頁(yè)。診斷策略可以分為以下兩種：一般性檢出策略完整檢出策略當(dāng)前7頁(yè)，總共100頁(yè)。一般性檢出策略所提供的感染性病原體的信息量較少，幾乎不提供型別（包括變異株）和耐藥性方面的信息，因此，對(duì)于感染感染性疾病分子診斷一般性策略只是快速診斷是何種病原體的感染。當(dāng)前8頁(yè)，總共100頁(yè)。為了得到更多的疾病病原體信息，建議應(yīng)該采取完整策略按照診斷→分型→亞型→耐藥性檢測(cè)的思路，利用多種分子診斷手段對(duì)感染性病原體進(jìn)行分析。當(dāng)前9頁(yè)，總共100頁(yè)。第一節(jié)病毒的基因檢測(cè)

人類(lèi)許多感染性疾病由病毒引起，如肝炎、腦炎、脊髓灰質(zhì)炎、流行性感冒、狂犬病、艾滋病等。根據(jù)病毒的核酸成分，可將其分為脫氧核糖核酸（DNA）病毒和核糖核酸（RNA）病毒兩大類(lèi)。當(dāng)前10頁(yè)，總共100頁(yè)。一、乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）是引起病毒性肝炎的主要病原體之一，屬嗜肝DNA病毒科的原型病毒，病毒毒粒中含內(nèi)源性DNA聚合酶活性。嗜肝病毒科有獨(dú)特的復(fù)制方式，病毒合成以RNA中間體為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成DNA鏈，在某些方面，HBV與逆轉(zhuǎn)錄病毒有許多相似性。

當(dāng)前11頁(yè)，總共100頁(yè)。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個(gè)嚴(yán)重的全球問(wèn)題,據(jù)估計(jì)全球大約有20億人曾經(jīng)感染乙肝病毒,慢性HBV感染者約315億~4億人,每年有50萬(wàn)~120萬(wàn)人死于HBV感染。我國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)區(qū),每年約有10%~20%的急性乙肝將轉(zhuǎn)成慢性肝炎,肝硬化甚至發(fā)展成肝癌,嚴(yán)重威脅著人們的健康,急性乙肝的慢性化及慢性肝炎癌變的發(fā)生機(jī)制是多年來(lái)肝病研究的重點(diǎn)。當(dāng)前12頁(yè)，總共100頁(yè)。HBV感染的病原學(xué)診斷免疫血清學(xué)檢測(cè)HBV的血清學(xué)標(biāo)志物分子生物學(xué)方法檢測(cè)免疫學(xué)方法測(cè)定病毒抗體是一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段,常用的方法是間接ELISA,目前我國(guó)HBV檢測(cè)采用的第三代ELISA試劑由多種病毒抗原組合匹配,具有較好的靈敏性和特異性,但其在病毒感染的窗口期不能檢測(cè)到抗體,這在很大程度上限制了ELISA檢測(cè)的準(zhǔn)確性,不能有效的控制病毒的傳播,因而,發(fā)展新的診斷HBV感染主要依賴(lài)分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病毒DNA的檢測(cè)。當(dāng)前13頁(yè)，總共100頁(yè)。當(dāng)前14頁(yè)，總共100頁(yè)。（一）病毒基因組結(jié)構(gòu)HBV是一種可感染人體、且具有獨(dú)立復(fù)制能力的雙鏈DNA病毒，具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：①不完全雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)；②利用重疊的開(kāi)放讀碼框架(ORF)可編碼多個(gè)蛋白質(zhì)；③所有調(diào)控序列均位于蛋白質(zhì)編碼區(qū)；④基因序列具有多變性。HBV基因組是已知可感染人類(lèi)又能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的雙鏈DNA病毒中最小和最高效的。

當(dāng)前15頁(yè)，總共100頁(yè)。HBV基因組具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，是一個(gè)長(zhǎng)約3.2kb的不完全雙鏈環(huán)狀DNA。雙鏈的長(zhǎng)度不對(duì)稱(chēng)，長(zhǎng)鏈(L)因與病毒mRNA互補(bǔ)，定為負(fù)鏈；短鏈(S)為正鏈，5’末端固定，3’末端位置不固定，S正鏈的長(zhǎng)度可為L(zhǎng)負(fù)鏈的50~100%，因而在病毒群體中出現(xiàn)不同長(zhǎng)度的正鏈與全長(zhǎng)的負(fù)鏈匹配，故僅有部分基因組長(zhǎng)度為雙鏈。HBV基因組L鏈上至少有4個(gè)ORF，分別稱(chēng)為S、C、P和X，編碼外膜蛋白、核殼蛋白、聚合酶和X蛋白。多個(gè)ORF重疊的結(jié)果使HBV本身3.2kb基因組序列的利用率高達(dá)150~200%。當(dāng)前16頁(yè)，總共100頁(yè)。當(dāng)前17頁(yè)，總共100頁(yè)。（二）分子診斷方法1．PCR

2.支鏈DNA技術(shù)3.核酸雜交4.基因芯片技術(shù)當(dāng)前18頁(yè)，總共100頁(yè)。逆向斑點(diǎn)雜交法原理就是將各種探針固定在基質(zhì)上,用以檢測(cè)受檢的各種標(biāo)記樣品中與探針互補(bǔ)的核酸物質(zhì)的變化。當(dāng)前19頁(yè)，總共100頁(yè)。FeO/Au納米顆粒探針?lè)ń陙?lái),通過(guò)納米表面結(jié)合寡核苷酸構(gòu)成納米顆?；蛱结?用于檢測(cè)靶脫氧核糖核酸。其原理是利用DNA堿基嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì)的特性設(shè)計(jì)的,主要應(yīng)用于分子的組裝。當(dāng)前20頁(yè)，總共100頁(yè)。聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法該法利用錯(cuò)配PCR的原理擴(kuò)增HBV前C區(qū)長(zhǎng)194bp,C啟動(dòng)子區(qū)長(zhǎng)184bp的基因片段,擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Bsu361,Bc1I酶切,瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)酶切圖譜多態(tài)性,建立檢測(cè)HBV前CA1896,BCPT1762/A1764雙變異的方法,當(dāng)前21頁(yè)，總共100頁(yè)。乙型肝炎病毒DNA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)HBV的病毒載量與感染狀態(tài)密切相關(guān),尋求快速、簡(jiǎn)便、靈敏、特異的定量手段是對(duì)HBV早期診斷、病程監(jiān)控及流行病學(xué)調(diào)查的需求。當(dāng)前22頁(yè)，總共100頁(yè)。（三）臨床意義1．HBV感染的早期診斷2.監(jiān)測(cè)治療效果3.判斷病情，指導(dǎo)制訂合理的治療方案HBVDNA定量檢測(cè)是判斷病毒復(fù)制情況的指標(biāo)。HBVDNA拷貝數(shù)越高，病毒復(fù)制越厲害，傳染性越強(qiáng)，肝臟病理?yè)p害程度越高，肝組織炎癥反應(yīng)越重。4.在乙型肝炎病毒耐藥檢測(cè)中的應(yīng)用當(dāng)前23頁(yè)，總共100頁(yè)。HBVDNA檢測(cè)是乙肝病毒抗病毒治療的有效監(jiān)測(cè)指標(biāo)。乙肝病毒藥物治療后,HBVDNA含量持續(xù)下降,然后持續(xù)在低水平,或低至方法學(xué)能檢出的含量(測(cè)定下限)以下,則說(shuō)明治療有效。觀測(cè)抗病毒藥物治療效果不能憑兩三次檢測(cè)結(jié)果來(lái)判斷,必須多次動(dòng)態(tài)觀察,每次檢測(cè)的間隔天數(shù)不宜太短,一般為兩周以上?？刹捎靡詸z測(cè)次數(shù)為橫坐標(biāo),HBVDNA量為縱坐標(biāo)作圖的方法來(lái)判斷血清HBVDNA量的變化趨勢(shì),進(jìn)而判斷抗病毒治療是否有效。血循環(huán)中HBVDNA濃度與HBsAg和HBeAg有一定的相關(guān),但其濃度間并不呈正線性相關(guān)。當(dāng)前24頁(yè)，總共100頁(yè)。拉米夫定作為新一代核苷類(lèi)高效抗乙肝病毒藥物，可迅速降低HBV-DNA的濃度，改善肝臟組織的病變，還可能阻止纖維化的進(jìn)程，終止肝硬化的發(fā)展，尤其是拉米夫定不受人種、病毒感染的模式、野生型或基因組前C區(qū)突變的影響。該藥與干擾素合用有協(xié)同作用。當(dāng)前25頁(yè)，總共100頁(yè)。長(zhǎng)期服用拉米夫定會(huì)引起HBV基因突變而造成耐藥，其中95%是由于HBV基因組P區(qū)中高度保守的YMDD功能區(qū)（Y酪氨酸—M甲硫氨酸—D天冬氨酸--D天冬氨酸）發(fā)生突變：第552位甲硫氨酸（M）被纈氨酸（V）或異亮氨酸（I）代替，突變后的HBV稱(chēng)為YVDD變異株和YIDD變異株。由于變異造成基因組核苷酸與DNA多聚酶的結(jié)合能力有降低，通常變異株的復(fù)制能力低于野生株。當(dāng)停止應(yīng)用拉米夫定治療后，野生株通常會(huì)替代變異株。當(dāng)前26頁(yè)，總共100頁(yè)。HBeAg陽(yáng)性的標(biāo)本,HBVDNA通常有較高的濃度,HBeAg陰性、抗HBe陽(yáng)性的標(biāo)本,HBVDNA濃度通常較低。當(dāng)HBV基因組前C區(qū)發(fā)生突變時(shí),則可出現(xiàn)HBeAg陰性而HBVDNA仍保持在較高的濃度。單獨(dú)抗HBc陽(yáng)性的血液HBVDNA濃度通常很低。當(dāng)前27頁(yè)，總共100頁(yè)。關(guān)于血液中HBVDNA濃度與患者傳染性之間的關(guān)系,如血清中HBVDNA濃度大于109拷貝/ml,則在日常生活密切接觸中即具有較強(qiáng)的傳染性。105~106拷貝/ml,則在日常生活密切接觸中的傳染性較小。小于105拷貝/ml,則日常生活密切接觸中幾乎沒(méi)有傳染危險(xiǎn)性。但不管HBVDNA的濃度為多少,哪怕是低于相應(yīng)PCR方法的下限,也均會(huì)引起輸血后的感染。當(dāng)前28頁(yè)，總共100頁(yè)?；蚍中头椒?一種在臨床上準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便地對(duì)乙型肝炎病毒進(jìn)行基本分型(BCD)的方法,該方法通過(guò)大量分析已分型的HBV基因組序列,尋找出HBV各基因型的型特異性鹼基的分布規(guī)律,設(shè)計(jì)型特異性的引物和探針,利用已知全序列HBV建立熒光PCR是目前最靈敏的檢測(cè)方法之一,檢測(cè)極限可達(dá)到100copise/ml的DNA濃度。當(dāng)前29頁(yè)，總共100頁(yè)。二、丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)屬黃病毒科。目前發(fā)現(xiàn)約90%的輸血后非甲非乙型肝炎和7080%的無(wú)輸血史的散發(fā)型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致。部分HCV感染者不出現(xiàn)臨床癥狀，但有50%會(huì)發(fā)展成為慢性，且易致肝硬化和肝癌。HCV主要通過(guò)輸血感染(是輸血后肝炎的主要致病因子)，也可由靜脈注射或母嬰和家庭內(nèi)接觸而獲得。當(dāng)前30頁(yè)，總共100頁(yè)。（一）病毒基因組結(jié)構(gòu) 丙型肝炎病毒呈球形顆粒，直徑約50nm，有一脂質(zhì)包膜。核心含單股正鏈RNA，長(zhǎng)9.4kb。整個(gè)基因組只有一個(gè)可讀框，位于基因組中央，編碼一條含有當(dāng)前31頁(yè)，總共100頁(yè)。RNA病毒中的RNA能自我復(fù)制，大部分RNA病毒是單鏈的，復(fù)制一般是先以自己為模板合成一條互補(bǔ)的單鏈，病毒原有的、起模板作用的鏈稱(chēng)為正鏈，新復(fù)制的RNA鏈稱(chēng)為負(fù)鏈。當(dāng)前32頁(yè)，總共100頁(yè)。當(dāng)前33頁(yè)，總共100頁(yè)。（二）分子診斷方法1．PCR2.核酸雜交3.bDNA技術(shù)4.基因芯片技術(shù)當(dāng)前34頁(yè)，總共100頁(yè)。1.定性檢測(cè)雖然抗HCV并不是保護(hù)性抗體，臨床上可以根據(jù)抗HCV來(lái)判斷是否感染，但由于患者免疫功能的差異，僅有部分患者出現(xiàn)抗HCV，且抗HCV尚會(huì)出現(xiàn)時(shí)陰時(shí)陽(yáng)的表現(xiàn)。采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)到HCVRNA的存在是HCV感染的確證標(biāo)志。檢測(cè)HCV-RNA可對(duì)丙型肝炎作早期診斷，解決了免疫學(xué)檢測(cè)的“窗口期”問(wèn)題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。在HCV的感染中，第一周內(nèi)就可以檢測(cè)出HCVRNA，當(dāng)前35頁(yè)，總共100頁(yè)。2.定量檢測(cè)可判斷HCV的傳染性及病毒復(fù)制情況，進(jìn)行病情評(píng)估、判斷病人預(yù)后。還可通過(guò)對(duì)HCVRNA拷貝數(shù)的監(jiān)測(cè)，評(píng)價(jià)干擾素和其他抗病毒藥物的療效。另外，人們注意到臨床分型與療效的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)如III型HCV患者對(duì)干擾素的療效更佳，此時(shí)也需要采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)HCV進(jìn)行病毒分型。當(dāng)前36頁(yè)，總共100頁(yè)。三、人類(lèi)免疫缺陷病毒人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV)，顧名思義它會(huì)造成人類(lèi)免疫系統(tǒng)的缺陷。1981年，人類(lèi)免疫缺陷病毒在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)。它是一種感染人類(lèi)免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒，屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種。至今無(wú)有效療法的致命性傳染病。該病毒破壞人體的免疫能力，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的失去抵抗力，而導(dǎo)致各種疾病及癌癥得以在人體內(nèi)生存，發(fā)展到最后，導(dǎo)致艾滋病(獲得性免疫缺陷綜合癥)。當(dāng)前37頁(yè)，總共100頁(yè)。人類(lèi)免疫缺陷病毒是艾滋病的病原體，自1983年首次分離出第一株HIV以來(lái)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3等3種。當(dāng)前38頁(yè)，總共100頁(yè)。在感染后會(huì)整合入宿主細(xì)胞的基因組中，而目前的抗病毒治療并不能將病毒根除。

病毒基因變化多樣;廣泛存在于感染者的血液、精液、陰道分泌物、唾液、尿液、乳汁、腦脊液、有神經(jīng)癥狀的腦組織液，其中以血液、精液、陰道分泌物中濃度最高;對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較弱，對(duì)乙肝病毒有效的消毒方法對(duì)艾滋病病毒消毒也有效;感染者潛伏期長(zhǎng)、死亡率高;病毒基因都復(fù)雜。當(dāng)前39頁(yè)，總共100頁(yè)。體外生存人類(lèi)免疫缺陷病毒在人體外生存能力極差，不耐高溫，抵抗力較低，離開(kāi)人體不易生存，常溫下只可生存數(shù)小時(shí)至數(shù)天。HIV對(duì)熱敏感。在56℃條件下30分鐘即失去活性，但在室溫保存7天，仍保持活性。滅活方法當(dāng)前40頁(yè)，總共100頁(yè)。不加穩(wěn)定劑病毒在-70℃冰凍下失去活性，而35%山梨醇或50%胎牛血清在-70℃時(shí)冰凍3個(gè)月仍保持活性。對(duì)消毒劑和去污劑亦敏感，0.2%次氯酸鈉、0.1%漂白粉、70%乙醇、35%異丙醇、50%乙醚、0.3%H2O20.5%來(lái)蘇爾處理5分鐘能滅活病毒，1%NP-40和0.5%triton-X-100能滅活病毒而保留抗原性。對(duì)紫外線、γ射線有較強(qiáng)抵抗力。當(dāng)前41頁(yè)，總共100頁(yè)。國(guó)際衛(wèi)生組織推薦對(duì)艾滋病病毒滅活加熱100℃持續(xù)20分鐘，效果較理想。艾滋病病毒的消毒主要是針對(duì)被艾滋病病毒感染者和艾滋病病人的血液、體液污染的醫(yī)療用品、生活場(chǎng)所等。例如，輔料、紗布、衣物等。對(duì)艾滋病病毒的消毒可以根據(jù)消毒物品選擇適當(dāng)?shù)奈锢矸椒ɑ蚧瘜W(xué)方法。需要重復(fù)使用的物品可用煮沸或高壓蒸汽消毒。不宜煮沸的物品可用2%戊二醛、75%酒精等進(jìn)行消毒。當(dāng)前42頁(yè)，總共100頁(yè)。體液生存在室溫下，液體環(huán)境中的HIV可以存活15天，被HIV污染的物品至少在3天內(nèi)有傳染性。近年來(lái)，一些研究機(jī)構(gòu)證明，離體血液中HIV病毒的存活時(shí)間決定于離體血液中病毒的含量，病毒含量高的血液，在未干的情況下，即使在室溫中放置96小時(shí)，仍然具有活力。即使是針尖大小一滴血，如果遇到新鮮的淋巴細(xì)胞，艾滋病毒仍可在其中不斷復(fù)制，仍可以傳播。當(dāng)前43頁(yè)，總共100頁(yè)。病毒含量低的血液，經(jīng)過(guò)自然干涸2小時(shí)后，活力才喪失;而病毒含量高的血液，即使干涸2-4小時(shí)，一旦放入培養(yǎng)液中，遇到淋巴細(xì)胞，仍然可以進(jìn)入其中，繼續(xù)復(fù)制。所以，含有HIV的離體血液可以造成感染。盡管艾滋病毒見(jiàn)縫就鉆，這些病毒也有弱點(diǎn)，它們只能在血液和體液中活的細(xì)胞中生存，不能在空氣中、水中和食物中存活，離開(kāi)了這些血液和體液，這些病毒會(huì)很快死亡。當(dāng)前44頁(yè)，總共100頁(yè)。形態(tài)結(jié)構(gòu)人類(lèi)免疫缺陷病毒直徑約120納米，大致呈球形。病毒外膜是類(lèi)脂包膜，來(lái)自宿主細(xì)胞，并嵌有病毒的蛋白gp120與gp41;gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并與gp41通過(guò)非共價(jià)作用結(jié)合。向內(nèi)是由蛋白p17形成的球形基質(zhì)，以及蛋白p24形成的半錐形衣殼，衣殼在電鏡下呈高電子密度。衣殼內(nèi)含有病毒的RNA基因組、酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶)以及其他來(lái)自宿主細(xì)胞的成分(如tRNAlys3，作為逆轉(zhuǎn)錄的引物)。當(dāng)前45頁(yè)，總共100頁(yè)。當(dāng)前46頁(yè)，總共100頁(yè)。（一）病毒基因組結(jié)構(gòu) HIV屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科，該科病毒帶有以RNA為模板合成DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶。HIV顆粒的核心有兩個(gè)拷貝的單股正鏈RNA，兩個(gè)單體通過(guò)5’末端的氫鏈結(jié)合形成二聚體。每個(gè)RNA的長(zhǎng)度約為9.7kb。

當(dāng)前47頁(yè)，總共100頁(yè)。兩端是長(zhǎng)末端重復(fù)序列(longterminalrepeats,LTR)，含順式調(diào)控序列，控制前病毒的表達(dá)。已證明在LTR有啟動(dòng)子和增強(qiáng)子并含負(fù)調(diào)控區(qū)。LTR之間的序列編碼了至少9個(gè)蛋白，可分為叁類(lèi):結(jié)構(gòu)蛋白、調(diào)控蛋白、輔助蛋白。1.gag基因能編碼約500個(gè)氨基酸組成的聚合前體蛋白，經(jīng)蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破壞。2.Pol基因編碼聚合酶前體蛋白，經(jīng)切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H，均為病毒增殖所必需。當(dāng)前48頁(yè)，總共100頁(yè)。3.env基因編碼約863個(gè)氨基酸的前體蛋白并糖基化成gp160，gp120和gp41。gp120含有中和抗原決定簇，已證明HIV中和抗原表位，在gp120V3環(huán)上，V3環(huán)區(qū)是囊膜蛋白的重要功能區(qū)，在病毒與細(xì)胞融合中起重要作用。gp120與跨膜蛋白gp41以非共價(jià)鍵相連。gp41與靶細(xì)胞融合，促使病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。實(shí)驗(yàn)表明gp41亦有較強(qiáng)抗原性，能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體反應(yīng)。當(dāng)前49頁(yè)，總共100頁(yè)。4.TaT基因編碼蛋白可與LTR結(jié)合，以增加病毒所有基因轉(zhuǎn)錄率，也能在轉(zhuǎn)錄后促進(jìn)病毒mRN

A的翻譯。5.Rev基因產(chǎn)物是一種順式激活因子，能對(duì)env和gag中順式作用抑制序(Cis-Actingrepressionsequance,Crs)去抑制作用，增強(qiáng)gag和env基因的表達(dá)，以合成相應(yīng)的病毒結(jié)構(gòu)蛋白。當(dāng)前50頁(yè)，總共100頁(yè)。.Nef基因編碼蛋白P27對(duì)HIV基因的表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用，以推遲病毒復(fù)制。該蛋白作用于HIvcDNA的LTR，抑制整合的病毒轉(zhuǎn)錄。可能是HIV在體內(nèi)維持持續(xù)感集體所必需。7.Vif基因?qū)IV并非必不可少，但可能影響游離HIV感染性、病毒體的產(chǎn)生和體內(nèi)傳播。8.VPU基因?yàn)镠IV-1所特有，對(duì)HIV的有效復(fù)制及病毒體的裝配與成熟不可少。當(dāng)前51頁(yè)，總共100頁(yè)。9.Vpr基因編碼蛋白是一種弱的轉(zhuǎn)錄激活物，在體內(nèi)繁殖周期中起一定作用。HIV-2基因結(jié)構(gòu)與HIV-1有差別:它不含VPU基因，但有一功能不明VPX基因。核酸雜交法檢查HIV-1與HIV-2的核苷酸序列，僅40%相同。env基因表達(dá)產(chǎn)物激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的抗體無(wú)交叉反應(yīng)。當(dāng)前52頁(yè)，總共100頁(yè)。自1985年,美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)使用第一代酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑以來(lái),HIV的診斷得到了快速發(fā)展,現(xiàn)已從以前的單純HIV抗體檢測(cè),發(fā)展到現(xiàn)在的抗原、核酸、CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、基因芯片技術(shù)等方法,大大縮短了檢出窗口期,提高了檢出率。當(dāng)前53頁(yè)，總共100頁(yè)。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)HIV的核酸已經(jīng)成為HIV實(shí)驗(yàn)室診斷的重要發(fā)展方向。核酸檢測(cè)技術(shù)主要用于被高度懷疑有原發(fā)感染,且經(jīng)抗體檢測(cè)之后抗體檢測(cè)陰性或不確定時(shí);有高危行為或暴露史,特別是伴有相應(yīng)臨床表現(xiàn)時(shí),早期診斷主要用于個(gè)體檢測(cè)、血液篩查、HIV陽(yáng)性產(chǎn)婦的嬰兒診斷。當(dāng)前54頁(yè)，總共100頁(yè)。原位雜交技術(shù)應(yīng)用特定的標(biāo)記探針以分子雜交法直接檢測(cè)樣品中的HIV病毒靶核酸,初期為放射性標(biāo)記,現(xiàn)在多以酶標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記。當(dāng)前55頁(yè)，總共100頁(yè)。HIV核酸定性檢測(cè)最常用的技術(shù)是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)能在HIV感染1~14d的患者血漿中檢測(cè)到HIVRNA,可用于急性感染患者、抗體檢測(cè)不確定等情況的輔助診斷或用于血液篩查,使HIV感染窗口期縮短至2周以?xún)?nèi)。當(dāng)前56頁(yè)，總共100頁(yè)。尤其在HIV陽(yáng)性母親產(chǎn)下的嬰兒是否感染HIV的診斷中有著非常重要的意義,前病毒DNAPCR檢測(cè)法對(duì)出生48h內(nèi)的嬰兒檢測(cè)敏感性為38%,出生2周的嬰兒檢測(cè)敏感性達(dá)93%。當(dāng)前57頁(yè)，總共100頁(yè)。HIV核酸定量檢測(cè)目前HIV核酸定量檢測(cè)技術(shù)主要有RT-PCR、分支DNA信號(hào)擴(kuò)大系統(tǒng)(bDNA)、核酸序列依賴(lài)的擴(kuò)增系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增系統(tǒng)(TMA)。當(dāng)前58頁(yè)，總共100頁(yè)?；蛐酒瑱z測(cè)技術(shù)該技術(shù)起始于20世紀(jì)90年代,通過(guò)對(duì)HIV基因組分析,將病毒的高度保守序列作為鑒定指標(biāo),將這些特定的寡核苷酸片段作為探針,有規(guī)律地排列于固相支持物上,然后與待測(cè)的標(biāo)記樣品的基因進(jìn)行雜交,經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行分析得出結(jié)果,后來(lái)應(yīng)用到HIV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

當(dāng)前59頁(yè)，總共100頁(yè)。HIV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)正朝著早期、快速、敏感、準(zhǔn)確、自動(dòng)化方向發(fā)展,相信不久的將來(lái),一些新的技術(shù)會(huì)逐步應(yīng)用到這一領(lǐng)域,使HIV的診斷和治療技術(shù)又上一個(gè)新的臺(tái)階。當(dāng)前60頁(yè)，總共100頁(yè)。臨床意義：早期診斷嬰兒診斷療效評(píng)價(jià)了解疫情當(dāng)前61頁(yè)，總共100頁(yè)。第二節(jié)病原菌的基因檢測(cè) 細(xì)菌廣泛分布于自然界。在人的體表和與外界相通的口腔、鼻咽腔、腸道、泌尿生殖道等存在著不同種類(lèi)和數(shù)量的細(xì)菌。人體免疫功能正常時(shí)，某些寄居在正常人體的細(xì)菌對(duì)人無(wú)害，屬于正常菌群。正常菌群與人體之間的平衡受某些條件的破壞可導(dǎo)致疾病，此時(shí)這些細(xì)菌為條件致病菌。另一些細(xì)菌因其本身所具有的毒性及侵襲力，一旦進(jìn)入人體將會(huì)造成人體的感染，統(tǒng)稱(chēng)為病原菌。

當(dāng)前62頁(yè)，總共100頁(yè)。病原菌的診斷方法有直接涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)等，但由于細(xì)菌培養(yǎng)周期較長(zhǎng)等種種原因，尚不能令人滿(mǎn)意。分子診斷技術(shù)的應(yīng)用將使細(xì)菌感染的診斷出現(xiàn)一個(gè)質(zhì)的飛躍，同時(shí)可將分子診斷技術(shù)用于細(xì)菌分型、耐藥性的檢測(cè)中。當(dāng)前63頁(yè)，總共100頁(yè)。一、淋球菌淋球菌(gonococcus)又名淋病耐瑟氏菌(neisseriagonorrhoeae,NG)，是淋病的病原菌。當(dāng)前64頁(yè)，總共100頁(yè)。（一）細(xì)菌基因組結(jié)構(gòu)淋球菌染色體可編碼約5000個(gè)基因，僅為大腸埃希菌基因組的1/3，其G+C含量為52%。（二）分子診斷方法1.PCR2.LCR可采用連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ligasechainreaction,LCR)檢測(cè)淋球菌DNA。當(dāng)前65頁(yè)，總共100頁(yè)。（三）臨床意義1.對(duì)分離培養(yǎng)的菌株進(jìn)行鑒定和進(jìn)一步分析。2.用于抗生素治療的療效觀察及監(jiān)控。3.提高臨床標(biāo)本檢測(cè)的陽(yáng)性率和準(zhǔn)確性。4.對(duì)淋球菌菌株進(jìn)行分子流行病學(xué)分析。5.對(duì)疑為淋球菌引起的疾病的診斷和鑒別診斷具有決定性作用。當(dāng)前66頁(yè)，總共100頁(yè)。結(jié)核分枝桿菌

結(jié)核分枝桿菌1882年由RobertKoch發(fā)現(xiàn)，對(duì)人致病的主要是人型結(jié)核分枝桿菌，引起結(jié)核病。伴隨艾滋病的流行、免疫抑制劑的應(yīng)用等，結(jié)核病發(fā)病率逐年上升，免疫低下個(gè)體特別是HIV感染者更易于感染結(jié)核分枝桿菌。盡管存在有效短程化學(xué)療法和卡介苗接種等方法防治，TB仍然是威脅人類(lèi)生命最嚴(yán)重的感染性病原。1993年，WHO宣布結(jié)核病是一個(gè)全球性危機(jī)。當(dāng)前67頁(yè)，總共100頁(yè)。目前臨床上常用的結(jié)核病診斷方法有細(xì)菌學(xué)涂片抗酸染色、活檢病理診斷和體液或組織培養(yǎng)。細(xì)菌學(xué)涂片和活檢病理抗酸染色找到抗酸桿菌可以確診結(jié)核，但是陽(yáng)性率很低，而且不能區(qū)別結(jié)核桿菌和不典型結(jié)核桿菌。另外麻風(fēng)桿菌也可以表現(xiàn)為抗酸染色陽(yáng)性。體液或活檢組織的分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性可明確診斷結(jié)核及菌型，但是培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，且陽(yáng)性率非常低。雖然新的培養(yǎng)法BACTEC法顯著縮短了培養(yǎng)、菌型鑒定結(jié)果的報(bào)告時(shí)間，但由于該法使用放射性底物而使它的應(yīng)用受到了限制。并且有些類(lèi)型分枝桿菌不能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。當(dāng)前68頁(yè)，總共100頁(yè)。結(jié)核病的歷史當(dāng)前69頁(yè)，總共100頁(yè)。態(tài)生兩靨之愁嬌襲一身之病當(dāng)前70頁(yè)，總共100頁(yè)。結(jié)核病2006年全世界流行分布情況當(dāng)前71頁(yè)，總共100頁(yè)。1882年3月24日，羅伯特.科赫（RobertKoch）宣布發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌-----世界防治結(jié)核病日結(jié)核桿菌當(dāng)前72頁(yè)，總共100頁(yè)。結(jié)核桿菌結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)生物學(xué)主要特點(diǎn)：1.結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中含有大量脂質(zhì)2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽腫3.抗酸染色陽(yáng)性當(dāng)前73頁(yè)，總共100頁(yè)。抵抗力

四怕乙醇濕熱紫外線抗結(jié)核藥物

四不怕干燥酸堿堿性染料青霉素等抗生素致病：致病物質(zhì)

脂質(zhì)①索狀因子②磷脂③硫酸腦苷脂(sulfatide)④蠟質(zhì)D蛋白質(zhì)多糖當(dāng)前74頁(yè)，總共100頁(yè)。

感染方式

呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入機(jī)體

所致疾病

疾病種類(lèi)多樣化以肺結(jié)核為主當(dāng)前75頁(yè)，總共100頁(yè)。1、直接涂片鏡檢傳統(tǒng)的微生物檢查當(dāng)前76頁(yè)，總共100頁(yè)。2、濃縮集菌傳統(tǒng)的微生物檢查當(dāng)前77頁(yè)，總共100頁(yè)。3、分離培養(yǎng)傳統(tǒng)的微生物檢查當(dāng)前78頁(yè)，總共100頁(yè)。分子生物學(xué)快速診斷基因結(jié)構(gòu)分子診斷臨床意義當(dāng)前79頁(yè)，總共100頁(yè)。TBH37Rv株的基因組為環(huán)形DNA。0點(diǎn)表示復(fù)制起始點(diǎn)。最外層代表穩(wěn)定的RNA基因和直接重復(fù)區(qū)第二層示線性編碼序列第三層描述了重復(fù)DNA第四環(huán)標(biāo)出了PPE家族的位置第五個(gè)環(huán)標(biāo)出了PE家族的位置第六個(gè)環(huán)標(biāo)出了PGRSs序列的位置最中心的直方圖表示了G+C含量基因結(jié)構(gòu)當(dāng)前80頁(yè)，總共100頁(yè)。

可采用PCR、FQ-PCR、競(jìng)爭(zhēng)性PCR、免疫雜交PCR等方法檢測(cè)標(biāo)本中的TBDNA。PCR擴(kuò)增所選靶序列主要有65000抗原基因、MPB蛋白基因、tRNA基因、TBIS110插入序列、染色體DNA的重復(fù)序列等。擴(kuò)增產(chǎn)物可用核酸雜交法進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物的特異性。PCR分子診斷當(dāng)前81頁(yè)，總共100頁(yè)。

應(yīng)用PCR方法檢測(cè)結(jié)核桿菌的首要條件是設(shè)計(jì)一對(duì)特異性DNA引物.

另外幾個(gè)關(guān)鍵因素是:①DNA提取②TaqDNA聚合酶的活性③PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法具體步驟分子診斷當(dāng)前82頁(yè)，總共100頁(yè)。技術(shù)步驟123TBDNA的提取引物的設(shè)計(jì)產(chǎn)物的檢測(cè)當(dāng)前83頁(yè)，總共100頁(yè)。現(xiàn)在主要的細(xì)菌裂解方法是:①蛋白酶K加表面活性劑法;②蛋白變性劑加表面活性劑煮沸法;③反復(fù)凍融法;④超聲波法;⑤溶菌酶加表面活性劑法.DNA的提取方法主要有酚提取法和玻璃棒纏繞法一、結(jié)核桿菌DNA的提取技術(shù)步驟當(dāng)前84頁(yè)，總共100頁(yè)。根據(jù)不同型結(jié)核桿菌的序列，目前常在下列幾種序列內(nèi)進(jìn)行引物設(shè)計(jì).常用的引物有：1、IS6110插入序列：僅見(jiàn)于MTBC.這種插入序列在基因組中的拷貝數(shù)為1--20個(gè)，選擇插入序列作為擴(kuò)增的靶序列，可以得到較高的敏感性和特異性.尤其是IS6110，是目前進(jìn)行臨床PCR檢測(cè)的首選區(qū)段.2、16SrRNA序列3、DNA重復(fù)序列二、引物的設(shè)計(jì)技術(shù)步驟當(dāng)前85頁(yè)，總共100頁(yè)。三、PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法通常PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法是經(jīng)瓊脂糖電泳后，用溴化乙錠染色，然后在紫外燈下觀察或進(jìn)一步采用標(biāo)記的DNA探針雜交.為了進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度，現(xiàn)多在引物和探針的標(biāo)記上進(jìn)行改進(jìn).由于放射性標(biāo)記物的危害性，現(xiàn)多采用非放射性標(biāo)記，如生物素、熒光素、酶及化學(xué)發(fā)光劑.Wilson等在巢式PCR的內(nèi)側(cè)引物上分別摻入生物素和地高辛配基，這樣PCR產(chǎn)物兩端就分別帶有生物素和地高辛配基.技術(shù)步驟當(dāng)前86頁(yè)，總共100頁(yè)。多重耐藥性結(jié)核病的產(chǎn)生原因。什么是耐多藥結(jié)核?。靠菇Y(jié)核藥物分為一線藥物（如：異煙肼、利福平、吡嗪酰胺等）和二線藥物（如：注射用類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、口服抑菌類(lèi)等）。當(dāng)前87頁(yè)，總共100頁(yè)。結(jié)核桿菌的分子耐藥機(jī)理

異煙肼(INH)異煙肼通過(guò)抑制結(jié)核桿菌分枝菌酸的合成，造成細(xì)胞壁破損而殺菌。INH的耐藥性與一個(gè)或多個(gè)基因的多種突變有關(guān)。這些基因包括編碼觸酶-過(guò)氧化物酶的KatG基因，編碼enoyl-ACP還原酶的inhA基因和編碼烷基-氫過(guò)氧化物還原酶的ahpC基因。當(dāng)前88頁(yè)，總共100頁(yè)。利福平(rifampin，RFP)利福平為一種廣譜抗菌藥物，它可與DNA依賴(lài)的RNA聚合酶的β亞單位結(jié)合，從而抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄。在RFP耐藥結(jié)核桿菌rpoB基因中央附近69bp的高變區(qū)域內(nèi)，存在35種以上不同的錯(cuò)義突變，其中絲氨酸531→亮氨酸(ser531→Leu)和組氨酸526→酷氨酸(His526→Tyr)的兩種突變最常見(jiàn)，約占總突變65%以上。13%rpoB基因突變的RFP高度耐藥株仍對(duì)利福布丁(rifabutin)敏感，提示可采用利福布丁治療某些RF