M基因組的復(fù)制型非常像質(zhì)粒

M基因組的復(fù)制型非常像質(zhì)粒第1頁(yè)/共64頁(yè)LambdaDNAislinearinviruscossequenceis12nucleotidesandsinglestrandedThetwocossequencesarecomplementaryReplicatesbyrollingciricleinE.colitoproduceconcatemerscoslambdaDNAcosetcetccossequenceshybridiseinE.colitoformcirculargenome第2頁(yè)/共64頁(yè)第3頁(yè)/共64頁(yè)可以插入超過(guò)10Kb的外源DNA。該載體攜帶的lacZ’基因上有一個(gè)多克隆位點(diǎn)接頭，外源基因插入到多接頭上6個(gè)酶切位點(diǎn)中的任何一個(gè)，都會(huì)使該基因失活，從而使得噬菌斑是無(wú)色清澈的而不是藍(lán)色的。(2)λZAPII第4頁(yè)/共64頁(yè)第5頁(yè)/共64頁(yè)Spi重組子的篩選

第6頁(yè)/共64頁(yè)3.5基于M13噬菌體的載體第7頁(yè)/共64頁(yè)3.5.1M13——纖維狀噬菌體M13是纖維狀噬菌體的一個(gè)代表，在結(jié)構(gòu)上與λ噬菌體有著很大的不同。M13DNA分子比λDNA要小得多,僅有6407個(gè)核苷酸?；蚪M為環(huán)狀單鏈DNA。M13的衣殼僅僅是由3種不同的蛋白質(zhì)組裝而成，而λ噬菌體的頭尾結(jié)構(gòu)則包含15種不同的蛋白質(zhì)，而且M13的侵染周期相對(duì)λ來(lái)說(shuō)也要簡(jiǎn)單一些，并不需要將基因插入到宿主基因組中。第8頁(yè)/共64頁(yè)■M13filamentousphageGene9proteinGene6proteinGene3proteinGene8proteinCircularssDNADistalendProximalendGene7proteinGenome:SinglestrandedcircularDNAmolecule,covalentlyclosed,6407nucleotides10nonoverlappinggenesHousedinaflexibleproteincylinderM13噬菌體基因組可編碼3類蛋白質(zhì)，包括復(fù)制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ），形態(tài)發(fā)生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ），結(jié)構(gòu)蛋白（基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ）。所有結(jié)構(gòu)蛋白在形態(tài)發(fā)生之前都插入在宿主細(xì)胞的質(zhì)膜中。第9頁(yè)/共64頁(yè)M13DNA分子通過(guò)大腸桿菌的纖毛進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞第10頁(yè)/共64頁(yè)在宿主細(xì)胞內(nèi)，單鏈DNA分子作為模板生成一條互補(bǔ)鏈，形成正常的雙鏈DNA分子（replicationform,RF）。這個(gè)雙鏈DNA分子不會(huì)插入細(xì)菌基因組，但會(huì)持續(xù)復(fù)制直到細(xì)菌中的拷貝數(shù)超過(guò)100。當(dāng)細(xì)菌分裂時(shí)，每個(gè)子細(xì)胞都能得到一個(gè)或多個(gè)噬菌體基因組的拷貝，這些拷貝也能繼續(xù)復(fù)制，以保證每個(gè)細(xì)胞具有恒定的拷貝數(shù)。第11頁(yè)/共64頁(yè)RFDNA再以滾環(huán)方式進(jìn)行復(fù)制，形成完整的單鏈子代DNA，接著新合成的子代DNA被切下來(lái)，并進(jìn)一步環(huán)化形成單位長(zhǎng)度的M13基因組DNA。游離的M13基因組DNA被不斷包裝成為M13噬菌體顆粒，并釋放出來(lái)。每個(gè)被侵染細(xì)胞在經(jīng)過(guò)一代復(fù)制后，都能夠產(chǎn)生1000個(gè)新的噬菌體。第12頁(yè)/共64頁(yè)◆M13的侵染循環(huán)第13頁(yè)/共64頁(yè)一個(gè)正常的M13噬菌體的基因組是6.4Kb，緊密排列著10個(gè)基因，每一個(gè)基因?qū)κ删w的復(fù)制都是必須的?；蜷g有一長(zhǎng)為507bp的短序列，外源DNA片段必須從這里插入才不會(huì)損傷其他的基因，同時(shí)還必須保證該序列中的復(fù)制起點(diǎn)不被破壞。顯然，只有一個(gè)很小的空間可用于改造M13噬菌體。M13噬菌體DNA組織結(jié)構(gòu)第14頁(yè)/共64頁(yè)

M13作為克隆載體的吸引力它的基因組小于10Kb，對(duì)一個(gè)潛在的載體來(lái)說(shuō)恰好處于一個(gè)令人滿意的范圍內(nèi)。M13基因組的復(fù)制型非常像質(zhì)粒，因此也能像質(zhì)粒一樣被處理。而且，M13基因組容易從大腸桿菌培養(yǎng)中獲得，也能夠通過(guò)轉(zhuǎn)染而重新引入。以M13為載體克隆基因，能夠得到單鏈形式的DNA。單鏈形式的克隆基因在一些技術(shù)中能夠發(fā)揮作用，在DNA測(cè)序和體外突變產(chǎn)生中尤為明顯。第15頁(yè)/共64頁(yè)3.5.2M13mp2克隆載體的開發(fā)構(gòu)建M13克隆載體的第一步，是把lacZ’基因?qū)氲绞删wM13的短序列中。這樣就產(chǎn)生了M13mp1，它在含有X-gal的瓊脂板上形成藍(lán)色的噬菌斑。第16頁(yè)/共64頁(yè)M13mp1的lacZ’基因上不含有任何限制性酶切位點(diǎn)，但在靠近基因起始位置的地方有一個(gè)GGATTC的序列。改變一個(gè)核苷酸就變成了GAATTC，這是EcoRI的識(shí)別位點(diǎn)。M13mp2的lacZ’基因的第6個(gè)密碼子編碼的是天冬酰氨而不是通常的天冬氨酸，但轉(zhuǎn)染了M13mp2的細(xì)胞產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶仍然有著正常的功能。第17頁(yè)/共64頁(yè)3.5.3M13mp7——對(duì)稱的克隆位點(diǎn)

第18頁(yè)/共64頁(yè)第19頁(yè)/共64頁(yè)由于攜帶對(duì)稱的克隆位點(diǎn)，用M13mp7載體有一個(gè)很大的好處，無(wú)論新的DNA是通過(guò)BamHI，SalI或PstI中的哪一個(gè)酶切位點(diǎn)插入載體，都可以用EcoRI從重組體中切除。第20頁(yè)/共64頁(yè)第21頁(yè)/共64頁(yè)第22頁(yè)/共64頁(yè)3.5.4M13mp8/9載體

越精巧的M13載體越有更復(fù)雜的多接頭被插入到lacZ’基因中。M13mp8是pUC8的對(duì)應(yīng)物。和pUC8一樣，它允許具有兩個(gè)不同粘性末端的DNA片段的插入。

第23頁(yè)/共64頁(yè)M13mp9是M13mp8的姐妹載體，它有一個(gè)與M13mp8相同的多接頭，但是方向相反，當(dāng)把一個(gè)DNA片段克隆到M13mp8后，可以用兩種限制性內(nèi)切酶把它再切下來(lái)，然后可以把它以相反的方向連接入M13mp9。這在DNA測(cè)序中很重要，因?yàn)楹塑账嵝蛄袕亩嘟宇^的一端一直讀進(jìn)插入的DNA片段。通常一次測(cè)序只能讀出約600個(gè)堿基，如果插入的DNA超過(guò)了這個(gè)長(zhǎng)度，就有一個(gè)末端的序列讀不出來(lái)。一種解決的辦法就是把DNA換個(gè)方向，再插入到姐妹載體中。第24頁(yè)/共64頁(yè)第25頁(yè)/共64頁(yè)第26頁(yè)/共64頁(yè)4.M13和質(zhì)粒的雜交載體－噬菌體質(zhì)粒

M13可以產(chǎn)生單鏈DNA，這使得它非常有用，但它有一個(gè)很大的缺點(diǎn)。當(dāng)用M13作載體時(shí)，它可以容納DNA片段的大小十分有限。為了解決這一問(wèn)題，人們把M13基因組的一部分和質(zhì)粒DNA結(jié)合在一起，構(gòu)成一種新型的載體，叫做噬菌體質(zhì)粒（phagemids）。

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pEMBL8載體它是通過(guò)把M13基因組中一個(gè)1300bp的片段導(dǎo)入pUC8中而構(gòu)建的。M13在形成被分泌的噬菌體顆粒前有一種酶使雙鏈DNA變成單鏈DNA，而被導(dǎo)入的那一段M13DNA則含有這種酶識(shí)別的信號(hào)序列。盡管這段序列已經(jīng)從M13噬菌體基因組中被分離出來(lái)，但它的功能還在。所以，pEMBL8也可以轉(zhuǎn)化為單鏈DNA。第28頁(yè)/共64頁(yè)第29頁(yè)/共64頁(yè)用作pEMBL8克隆實(shí)驗(yàn)的宿主大腸桿菌細(xì)胞必須隨后被正常的M13噬菌體感染，而在這里正常的M13噬菌體作為輔助噬菌體，提供必要的復(fù)制酶和蛋白質(zhì)外殼。pEMBL8是從pUC8發(fā)展來(lái)的，同樣也有插入多接頭的lacZ’基因，重組體可以通過(guò)在含有X-gal培養(yǎng)基上的噬菌斑而被鑒定出來(lái)。我們可以用pEMBL8產(chǎn)生達(dá)到10Kb的單鏈DNA片段，這極大地?cái)U(kuò)展了M13克隆系統(tǒng)的使用范圍。

第30頁(yè)/共64頁(yè)1.具有較小分子量的共價(jià)、閉合、環(huán)形的基因組DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于進(jìn)行分離與操作；2.編碼一個(gè)ampr基因作為選擇記號(hào)，因此只有攜帶pUC118或pUC119噬菌粒載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，才能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，便于轉(zhuǎn)化子的選擇；3.拷貝數(shù)含量高，每個(gè)寄主可高達(dá)500個(gè)，所以只要用少量的大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物，便可制備出大量的載體DNA；4.存在著一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)，因此許多種不同類型的外源DNA片段，不經(jīng)修飾便可直接插入到載體分子上；8.在pUC118和pUC119這兩個(gè)載體中，多克隆位點(diǎn)區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當(dāng)中的一個(gè)可轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈DNA，另一個(gè)則可轉(zhuǎn)錄出負(fù)鏈DNA；5.陽(yáng)性重組子可以用藍(lán)白斑進(jìn)行篩選；lacZ基因是置于lac啟動(dòng)子的控制之下，這樣插入的外源基因便會(huì)以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)；6.含有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，在沒(méi)有輔助噬菌體的情況下，克隆的外源基因可以像質(zhì)粒一樣按常規(guī)的方式，復(fù)制形成大量的雙鏈DNA分子；7.帶有一個(gè)M13噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)，在有輔助噬菌體感染的寄主細(xì)胞中，可以合成出單DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養(yǎng)基中；9.可以直接對(duì)克隆的DNA片斷進(jìn)行核苷酸的序列測(cè)定，免去了從質(zhì)粒載體到噬菌體的這一繁瑣的亞克隆步驟。第31頁(yè)/共64頁(yè)pUC118和pUC1191.具有較小分子量的共價(jià)、閉合、環(huán)形的基因組DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于進(jìn)行分離與操作；

2.編碼一個(gè)ampr基因作為選擇記號(hào)，因此只有攜帶pUC118或pUC119噬菌粒載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，才能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，便于轉(zhuǎn)化子的選擇；

3.拷貝數(shù)含量高，每個(gè)寄主可高達(dá)500個(gè)，所以只要用少量的大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物，便可制備出大量的載體DNA；

4.存在著一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)，因此許多種不同類型的外源DNA片段，不經(jīng)修飾便可直接插入到載體分子上；第32頁(yè)/共64頁(yè)5.陽(yáng)性重組子可以用藍(lán)白斑進(jìn)行篩選；lacZ基因是置于lac啟動(dòng)子的控制之下，這樣插入的外源基因便會(huì)以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)；6.含有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，在沒(méi)有輔助噬菌體的情況下，克隆的外源基因可以像質(zhì)粒一樣按常規(guī)的方式，復(fù)制形成大量的雙鏈DNA分子7.帶有一個(gè)M13噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)，在有輔助噬菌體感染的寄主細(xì)胞中，可以合成出單DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養(yǎng)基中；第33頁(yè)/共64頁(yè)8.在pUC118和pUC119這兩個(gè)載體中，多克隆位點(diǎn)區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當(dāng)中的一個(gè)可轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈DNA，另一個(gè)則可轉(zhuǎn)錄出負(fù)鏈DNA；9.可以直接對(duì)克隆的DNA片斷進(jìn)行核苷酸的序列測(cè)定，免去了從質(zhì)粒載體到噬菌體的這一繁瑣的亞克隆步驟。第34頁(yè)/共64頁(yè)pBluescript噬菌粒載體3.編碼有一個(gè)胺芐青霉素抗性基因，供作轉(zhuǎn)化子標(biāo)記；4.含有l(wèi)acZ基因，可用Xgal-IPTG顯色反應(yīng)法篩選噬菌粒載體。1.在多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)，有一對(duì)T3和T7噬菌體的啟動(dòng)子，可以定向指導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)；2.同時(shí)具有一個(gè)單鏈?zhǔn)删wM13或f1的復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)來(lái)自ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，在不同的情況下，可以采取不同的復(fù)制形式，分別合成單鏈或雙鏈的DNA；第35頁(yè)/共64頁(yè)5粘端質(zhì)粒

粘端質(zhì)粒(cosmids,柯斯質(zhì)粒)是噬菌體DNA和大腸桿菌質(zhì)粒兩者的雜交體。設(shè)計(jì)粘端質(zhì)粒的想法來(lái)源于這樣一個(gè)事實(shí)：把噬菌體DNA包裝進(jìn)頭部的酶僅僅識(shí)別cos位點(diǎn)。在體外包裝系統(tǒng)中，任何長(zhǎng)度在37Kb和52Kb之間的DNA分子，只要兩端含有cos位點(diǎn)，就能夠包裝進(jìn)噬菌體的頭部。構(gòu)建cosmids是為了克服把大片段DNA導(dǎo)入到大腸桿菌細(xì)胞中的技術(shù)難題。

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粘端質(zhì)?；旧纤闶且粋€(gè)攜帶cos位點(diǎn)的質(zhì)粒。cos位點(diǎn)用于把重組DNA裝入噬菌體的頭部。因?yàn)樗鄙賻缀跛械摩耸删w基因組，不能產(chǎn)生噬菌斑，因此需要其他的篩選標(biāo)記，如氨芐青霉素抗性標(biāo)記，也要有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)。第37頁(yè)/共64頁(yè)第38頁(yè)/共64頁(yè)第39頁(yè)/共64頁(yè)粘粒具有來(lái)自ColE1的復(fù)制起點(diǎn)，可以在大腸桿菌進(jìn)行復(fù)制，具有AmpR作為選擇標(biāo)記，利用體外包裝系統(tǒng)選擇攜帶外源DNA插入片段的重組體，并侵染宿主細(xì)胞。外源DNA片段與粘粒載體的連接類似于外源DNA片段和置換型載體的連接。連接產(chǎn)物是由45Kb的外源DNA片段和5Kb粘粒載體構(gòu)成的連環(huán)體。對(duì)連環(huán)體進(jìn)行體外包裝形成病毒顆粒，并用于侵染大腸桿菌細(xì)胞。連環(huán)體的包裝僅僅起到篩選重組體，并把50Kb的DNA分子轉(zhuǎn)到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。50Kb的片段的轉(zhuǎn)化效率非常低，而噬菌體的侵染效率非常高。第40頁(yè)/共64頁(yè)采用粘端質(zhì)粒的克隆實(shí)驗(yàn)按照如下步驟進(jìn)行。從單酶切位點(diǎn)切開質(zhì)粒，加入新的DNA片段，這些片段通常是不完全酶切的產(chǎn)物，完全酶切后產(chǎn)生的片段對(duì)于粘端質(zhì)粒來(lái)說(shuō)太小了。然后，進(jìn)行連接反應(yīng)，形成重組體。如果插入的DNA大小合適，體外包裝系統(tǒng)從cos位點(diǎn)切開連環(huán)體，把重組后的粘端質(zhì)粒包裝進(jìn)成熟的噬菌體顆粒。用這樣的λ噬菌體去感染大腸桿菌，但不會(huì)產(chǎn)生噬菌斑。把感染后的大腸桿菌培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基上，只有那些有抗生素抗性的菌落才能生長(zhǎng)。所有的菌落都是重組體，因?yàn)槟切](méi)有重組的線性粘端質(zhì)粒太小，根本不可能包裝進(jìn)噬菌體的頭部。第41頁(yè)/共64頁(yè)Ifwecouldjustfillthecapsidwithabigplasmidhavingcosends(necessaryforpackaging)thenwewouldhaveabout42kbpoffreespaceinsteadofonly23kbp(asinlambdaFIX).Infact,thatkindofcloningvectorhasbeenmadealready,anditiscalleda"cosmid"(wherethe"cos"indicatesthatithaslambdacosends).Here'sanexampleofacommercialvectorbasedoncosmidtechnology:第42頁(yè)/共64頁(yè)Asequencemarked“ori”forDNAreplicationinbacteria;Amprforampicillinselectioninbacteria;AsequencemarkedMCSthatisapolylinkercontaininguniquerestrictionsitesandtwophageRNApolymerasepromoters(T7andT3)inopposingdirections.Twocossequences,separatedbyanXba1site;AnoriginofDNAreplicationfromSV40(permitsreplicationandcopynumberamplificationinmanyeukaryoticcells,inthepresenceofSV40Tantigenprotein);NeorforselectionineukaryoticcellswiththeneomycinantibioticanalogG418.第43頁(yè)/共64頁(yè)ThemaximumamountofDNAthatcanbeinsertedintoSuperCosIdependsonthepackaginglimitoflamba(52kbp)andthepre-existingsizeofthevector(7.6kbp).HowmuchspacedoesSuperCosIhaveforforeignDNA?

52kbp-7.6kbp=44.4kbp

第44頁(yè)/共64頁(yè)6其他高容量載體

基于λ噬菌體的載體的主要用途是克隆DNA大片段。做個(gè)比較，M13載體可以插入不超過(guò)3Kb的DNA片段，大多數(shù)質(zhì)粒的容量不超過(guò)8Kb，對(duì)于像λEMBL4那樣的置換載體能夠達(dá)到20Kb，對(duì)某些粘端質(zhì)粒而言是40Kb。第45頁(yè)/共64頁(yè)

這樣可以克隆如此巨大的DNA片段的能力，使得人們可以建立基因組文庫(kù)。一個(gè)基因組文庫(kù)就是一套覆蓋某個(gè)生物體所有DNA的重組體克隆群。例如，一個(gè)大腸桿菌的基因組文庫(kù)，包含所有的大腸桿菌基因，據(jù)此，我們可以抽提出任何我們所感興趣的基因加以研究?；蚪M文庫(kù)可以保存很多年，也可以很容易地在研究組織間傳播。第46頁(yè)/共64頁(yè)

由于人類和其他哺乳動(dòng)物的基因組很大，因此需要構(gòu)建新的容量更大的載體。人類已經(jīng)開發(fā)出一系列這樣的載體，并且很快應(yīng)用到基因組物理圖譜的構(gòu)建工作。第47頁(yè)/共64頁(yè)Bacterialartificialchromosome(BAC)vectors

以大腸桿菌為宿主的克隆載體多屬于多拷貝復(fù)制子。這類載體的優(yōu)點(diǎn)是在宿主細(xì)胞中有較多的拷貝數(shù)，因此可以獲得更多的克隆片段。但是，這類載體也有一個(gè)明顯缺點(diǎn)，即插入片段不穩(wěn)定。當(dāng)插入片段來(lái)自于含有重復(fù)順序的真核基因組時(shí)，插入片段的不穩(wěn)定現(xiàn)象就尤為突出，因此在細(xì)菌細(xì)胞中就很難保持完整的大片段DNA。第48頁(yè)/共64頁(yè)

為了避免高拷貝數(shù)目載體中插入片段不穩(wěn)定這一問(wèn)題，人們開始利用低拷貝數(shù)目復(fù)制子，例如F-因子，來(lái)構(gòu)建載體。利用F因子構(gòu)建的載體可以克隆50～300Kb的外源DNA片段。

BAC載體含有F質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（oriS），控制質(zhì)粒復(fù)制的基因（repE）,確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因

（parA,parB），以及細(xì)菌的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。第49頁(yè)/共64頁(yè)第50頁(yè)/共64頁(yè)

構(gòu)建BAC文庫(kù)的方法與構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒文庫(kù)的方法相似，只是DNA插入片段是通過(guò)脈沖電泳制備的。pBeloBAC11是一種BAC載體。由HindIII部分酶切，通過(guò)PAGE分離得到DNA片段連接到通過(guò)HindIII酶切，并通過(guò)磷酸酶水解的pBeloBAC11上，連接分子通過(guò)電擊導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中，在含有氯霉素的培養(yǎng)基上篩選重組體。插入片段可以利用稀有位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶NotI切割下來(lái)。terminase可以在cosN位點(diǎn)切開質(zhì)粒。可以對(duì)線性化質(zhì)粒進(jìn)行末端標(biāo)記進(jìn)行限制酶作圖。HindIII克隆位點(diǎn)兩側(cè)的T7和SP6啟動(dòng)子可以被用作制備RNA探針進(jìn)行文庫(kù)篩選。第51頁(yè)/共64頁(yè)BAC載體的優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)很多代的傳遞，仍保持穩(wěn)定，并且BAC能夠通過(guò)電擊的方法高效地導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞，避免了體外包裝過(guò)程。第52頁(yè)/共64頁(yè)P(yáng)1噬菌體載體（BacteriophageP1vectors）

它含有很多P1噬菌體來(lái)源的順式作用元件，能容納70～100kb大小的基因組DNA片段。在這種系統(tǒng)中，含有基因組和載體序列的線狀重組分子在體外被組裝到P1噬菌體顆粒中，后者總?cè)萘靠蛇_(dá)115kb（包括載體和插入片段）。將重組DNA注射到表達(dá)Cre重組酶的大腸桿菌中，線狀DNA分子通過(guò)重組于載體的兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間而發(fā)生環(huán)化。另外，載體還攜帶一個(gè)通用的選擇標(biāo)記kanr，一個(gè)區(qū)分?jǐn)y帶外源DNA克隆的陽(yáng)性標(biāo)記sacB以及一個(gè)能夠使每個(gè)細(xì)胞都含有約一個(gè)拷貝環(huán)狀重組質(zhì)粒的P1質(zhì)粒復(fù)制子。另一個(gè)P1復(fù)制子（P1裂解性復(fù)制子）在可誘導(dǎo)的lac啟動(dòng)子（IPTG誘導(dǎo)）控制下，用于DNA分離前質(zhì)粒的擴(kuò)增。

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它含有很多P1噬菌體來(lái)源的順式作用元件，能容納70～100kb大小的基因組DNA片段。在這種系統(tǒng)中，含有基因組和載體序列的線狀重組分子在體外被組裝到P1噬菌體顆粒中，后者總?cè)萘靠蛇_(dá)115kb（包括載體和插入片段）。將重組DNA注射到表達(dá)Cre重組酶的大腸桿菌中，線狀DNA分子通過(guò)重組于載體的兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間而發(fā)生環(huán)化。另外，載體還攜帶一個(gè)通用的選擇標(biāo)記kanr，一個(gè)區(qū)分?jǐn)y帶外源DNA克隆的陽(yáng)性標(biāo)記sacB以及一個(gè)能夠使每個(gè)細(xì)胞都含有約一個(gè)拷貝環(huán)狀重組質(zhì)粒的P1質(zhì)粒復(fù)制子。P1噬菌體載體（BacteriophageP1vectors）第54頁(yè)/共64頁(yè)Cre重組酶：于1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，屬于λInt酶超基因家族,能識(shí)別特異的DNA序列，即loxP位點(diǎn)，使loxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。LoxP（locusofX-overP1）序列：來(lái)源于P1噬菌體，是有兩個(gè)13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時(shí)也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過(guò)程中與DNA共價(jià)結(jié)合，13bp的反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域。第55頁(yè)/共64頁(yè)1、如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列或環(huán)化；2、如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導(dǎo)致兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列倒位；3、如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導(dǎo)兩條DNA鏈的交換或染色體易位。第56頁(yè)/共64頁(yè)第57頁(yè)/共64頁(yè)正向選擇標(biāo)記，表達(dá)一種使某些宿主菌致死的基因產(chǎn)物，而含有外源基因片段插入后，該基因便失活。如蔗糖致死基因SacB，來(lái)自淀粉水解芽胞桿菌（Bacillusamyloliquefaciens），編碼果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培養(yǎng)基上sacB基因的表達(dá)對(duì)大腸桿菌來(lái)說(shuō)是致死的，因此該基因可用于插入失活篩選重組子。

第58頁(yè)/共64頁(yè)P(yáng)1噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫(kù)的示意圖pAd10sacBⅡScaI+BamHI

長(zhǎng)臂+短臂加入外源DNA片段重組DNA分子離體包裝感染宿主細(xì)胞第59頁(yè)/共64頁(yè)

還有一些大容量的載體使基于噬菌體P1發(fā)展而來(lái)的。P1