淡水渦蟲(chóng)的眼點(diǎn)結(jié)構(gòu)與形態(tài)發(fā)生過(guò)程分析,分子生物學(xué)論文

淡水渦蟲(chóng)的眼點(diǎn)結(jié)構(gòu)與形態(tài)發(fā)生過(guò)程分析,分子生物學(xué)論文淡水渦蟲(chóng)從屬于扁形動(dòng)物門(mén)〔Platyhelminthes〕,渦蟲(chóng)綱〔Turbellaria〕,是動(dòng)物界最早出現(xiàn)兩側(cè)對(duì)稱(chēng)、三胚層、營(yíng)自由爬行生活的動(dòng)物類(lèi)群，在動(dòng)物系統(tǒng)演化中占有重要地位。同時(shí)渦蟲(chóng)具有極強(qiáng)的再生能力，即便是小到蟲(chóng)體1279的渦蟲(chóng)組織也能夠再生出一個(gè)完好的個(gè)體[1].當(dāng)渦蟲(chóng)自耳突后切去頭部后，1周內(nèi)便能再生出完好的頭部，包括功能正常的眼點(diǎn)[2].淡水渦蟲(chóng)由于其眼點(diǎn)構(gòu)造簡(jiǎn)單，加上其獨(dú)特的進(jìn)化地位和極強(qiáng)的再生能力等特點(diǎn)，已成為研究視覺(jué)系統(tǒng)的構(gòu)成、發(fā)育及再生的形式動(dòng)物。1.淡水渦蟲(chóng)的眼點(diǎn)構(gòu)造以淡水渦蟲(chóng)的重要代表---日本三角渦蟲(chóng)〔Dugesiajaponica〕為例，其視覺(jué)系統(tǒng)非常明顯，一對(duì)眼點(diǎn)位于頭部背側(cè)兩側(cè)，僅由兩類(lèi)細(xì)胞構(gòu)成：感光細(xì)胞和色素細(xì)胞，色素細(xì)胞構(gòu)成半月形的視杯，感光細(xì)胞位于視杯外側(cè)，其樹(shù)突向前延伸到視杯內(nèi)[3],軸突〔視神經(jīng)纖維〕沿著身體背側(cè)中部向后延伸，一部分在腹側(cè)構(gòu)成視覺(jué)中樞，一部分投射到身體對(duì)側(cè)構(gòu)成視穿插以整合雙側(cè)光感覺(jué)纖維傳入的信息[4].另外，一些肌纖維伸入到視杯內(nèi)，根據(jù)光線的強(qiáng)弱共同調(diào)節(jié)視杯開(kāi)口處直徑的大小，進(jìn)而控制光的攝入量[5]〔圖1A,1B〕.渦蟲(chóng)的眼點(diǎn)由于不含有晶狀體等復(fù)雜的光折射系統(tǒng)，因而，其功能只能感遭到光強(qiáng)而不能成像。盡管如此，它們也和其他高等動(dòng)物的眼一樣，能吸收光能并轉(zhuǎn)化成化學(xué)能再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成電能進(jìn)而調(diào)節(jié)其生理活動(dòng)。渦蟲(chóng)的眼點(diǎn)所具有的這些特征使得它接近于達(dá)爾文所提出的原始眼[6].它正在成為研究后生動(dòng)物眼形態(tài)發(fā)生和進(jìn)化的形式動(dòng)物。2.渦蟲(chóng)眼點(diǎn)的形態(tài)發(fā)生經(jīng)過(guò)在正常成體渦蟲(chóng)體內(nèi)，其眼點(diǎn)細(xì)胞的更新是靠體內(nèi)多能干細(xì)胞〔neoblasts〕的分化[8].利用免疫熒光染色技術(shù)對(duì)于渦蟲(chóng)視覺(jué)系統(tǒng)的形態(tài)發(fā)生經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，其再生經(jīng)過(guò)可分為4個(gè)階段：〔1〕自耳突切割后的第2天在背部?jī)蓚?cè)有成團(tuán)的視覺(jué)細(xì)胞構(gòu)成；〔2〕第3天兩側(cè)視神經(jīng)細(xì)胞的軸突橫向生長(zhǎng)，穿過(guò)中線互相連接構(gòu)成視穿插；〔3〕第5天另一部分視神經(jīng)細(xì)胞向后縱向生長(zhǎng)延伸至腦神經(jīng)中樞的視覺(jué)中心；〔4〕第7天新構(gòu)成的視神經(jīng)細(xì)胞聚集構(gòu)成軸突，構(gòu)成完好的視覺(jué)系統(tǒng)[9]〔圖2A,2B〕.3.渦蟲(chóng)眼點(diǎn)形態(tài)發(fā)生經(jīng)過(guò)相關(guān)基因最近幾年，借助先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)，有關(guān)渦蟲(chóng)眼點(diǎn)形態(tài)發(fā)生經(jīng)過(guò)中基因的表示出調(diào)控研究已獲得了較大的進(jìn)展。當(dāng)前，在淡水渦蟲(chóng)中已克隆出了大量與視覺(jué)系統(tǒng)形態(tài)發(fā)生相關(guān)的調(diào)控因子并對(duì)其功能進(jìn)行了研究〔表1〕,進(jìn)而為研究渦蟲(chóng)視覺(jué)系統(tǒng)的構(gòu)成和發(fā)育奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。3.1與眼點(diǎn)前體細(xì)胞分化相關(guān)的基因：當(dāng)前發(fā)現(xiàn)，在渦蟲(chóng)眼點(diǎn)發(fā)育早期表示出的基因有Djsix-1、Djeya、Smednos、Smed-pbx、Smed-ovo和Smed-soxB主要與眼點(diǎn)前體細(xì)胞的分化密切相關(guān)。Djsix-1和Djeya分別屬于Sineoculis/Six基因家族和Eya基因家族，兩者均為比擬古老的保守基因。Djsix-1和Djeya在眼點(diǎn)構(gòu)成的早期共表示出并且兩者在渦蟲(chóng)眼點(diǎn)形態(tài)發(fā)生經(jīng)過(guò)中協(xié)同作用，共同調(diào)控眼點(diǎn)的再生經(jīng)過(guò)[10].通過(guò)RNA干擾技術(shù)〔RNAinterference,RNAi〕分別沉默兩種基因，導(dǎo)致再生經(jīng)過(guò)中均出現(xiàn)無(wú)眼類(lèi)型。假如把Djeya和Djsix-1同時(shí)沉默，將發(fā)育成大量的無(wú)眼類(lèi)型。而且，通過(guò)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，也發(fā)現(xiàn)Djeya的保守區(qū)域ED和Djsix-1保守區(qū)域SD高度結(jié)合，據(jù)此揣測(cè)，Djeya和Djsix-1編碼的調(diào)控蛋白通過(guò)構(gòu)成嚴(yán)密結(jié)合的二聚體來(lái)促進(jìn)眼點(diǎn)的構(gòu)成和發(fā)育[10].通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)〔quantitativereal-timePCR,Real-timePCR〕發(fā)現(xiàn)，兩種基因在渦蟲(chóng)眼點(diǎn)發(fā)育早期高表示出并且在再生的整個(gè)經(jīng)過(guò)中表示出量都比擬高，因而以為兩者不僅介入了眼點(diǎn)前體細(xì)胞的分化，而且在視覺(jué)系統(tǒng)功能恢復(fù)及維持其正常功能中發(fā)揮重要作用[11].當(dāng)前，Djsix-1和Djeya已成為渦蟲(chóng)眼點(diǎn)形態(tài)發(fā)生早期標(biāo)志性基因。最新研究顯示，在果蠅眼的發(fā)育經(jīng)過(guò)中，Eya不僅在感光細(xì)胞中表示出，還調(diào)控色素細(xì)胞的發(fā)育[12],但在渦蟲(chóng)眼點(diǎn)發(fā)育中尚未發(fā)現(xiàn)其對(duì)色素細(xì)胞的調(diào)控作用。Smednos基因?qū)儆贜anos基因家族，它調(diào)控具有鋅指構(gòu)造的NANOS蛋白，這種蛋白是高度保守的，其功能主要是促進(jìn)生殖細(xì)胞的分化，同時(shí)，nanos基因也介入神經(jīng)細(xì)胞的分化[13].Smednos基因在渦蟲(chóng)眼點(diǎn)的再生經(jīng)過(guò)和胚胎發(fā)育經(jīng)過(guò)中在正在分化的眼點(diǎn)細(xì)胞中表示出，但是眼點(diǎn)細(xì)胞分化完成后不再表示出，因而揣測(cè)Smednos基因可能在眼點(diǎn)前體細(xì)胞的分化經(jīng)過(guò)中發(fā)揮作用[14].Smed-pbx基因是在地中海渦蟲(chóng)〔Schmidteamediterranea〕中鑒定出的一種編碼包含PBC同源域〔包含PBX〕蛋白的基因，RNAi沉默該基因則渦蟲(chóng)不能再生出眼點(diǎn)，并且發(fā)現(xiàn)眼點(diǎn)前體細(xì)胞明顯減少。因而以為Smed-pbx基因在渦蟲(chóng)眼點(diǎn)再生經(jīng)過(guò)中對(duì)眼點(diǎn)前體細(xì)胞的構(gòu)成是必需的[15].Lapan等[16]通過(guò)對(duì)渦蟲(chóng)眼點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組的研究發(fā)現(xiàn)，一種保守的轉(zhuǎn)錄因子Ovo在渦蟲(chóng)眼點(diǎn)形態(tài)發(fā)生經(jīng)過(guò)中發(fā)揮著與Six-1和Eya基因同等重要的作用。原位雜交實(shí)驗(yàn)表示清楚，在地中海渦蟲(chóng)〔S.mediterranea〕的眼點(diǎn)再生經(jīng)過(guò)中，Smed-ovo基因在感光細(xì)胞和色素細(xì)胞中均表示出。頭部切割后，Smed-ovo的表示出形式與眼點(diǎn)前體細(xì)胞的表示出形式類(lèi)似，而且，幾乎所有表示出Ovo基因的細(xì)胞同時(shí)表示出眼點(diǎn)前體細(xì)胞的標(biāo)記基因Six-1/2和Eya.因而揣測(cè)，Ovo基因在眼點(diǎn)前體細(xì)胞中表示出，調(diào)控前體細(xì)胞的分化。RNAi沉默Smed-ovo導(dǎo)致再生經(jīng)過(guò)中不能構(gòu)成眼原基及眼點(diǎn)前體細(xì)胞。因而以為，Smed-ovo基因與Six-1和Eya基因一樣，在眼點(diǎn)再生經(jīng)過(guò)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Smed-soxB在感光細(xì)胞和眼點(diǎn)前體細(xì)胞中均有表示出。在干擾Smed-soxB的渦蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)前部感光細(xì)胞明顯減少，這表示清楚Smed-soxB基因可能具有促進(jìn)感光細(xì)胞分化的功能。3.2與視神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)相關(guān)基因：在眼點(diǎn)的發(fā)育經(jīng)過(guò)中發(fā)現(xiàn)，與視神經(jīng)纖維生長(zhǎng)相關(guān)的基因主要有Otx、Djpax6、Djnetrin、Smed-netR、Djslit和Smed-roboA,它們主要在眼點(diǎn)形態(tài)發(fā)生的中期表示出。Otx基因家族是一個(gè)非常龐大的基因家族，其同源基因廣泛存在于脊椎動(dòng)物及無(wú)脊椎動(dòng)物的視覺(jué)系統(tǒng)中[17~20].在淡水渦蟲(chóng)中，Djotx是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的與視覺(jué)系統(tǒng)相關(guān)的基因。固然Gtotx初次發(fā)如今淡水渦蟲(chóng)〔Girardiatigrina〕頭部再生的胚基中強(qiáng)烈表示出，但對(duì)其在視覺(jué)系統(tǒng)中的功能并未具體闡述[21].隨后，在日本三角渦蟲(chóng)〔D.japonica〕中發(fā)現(xiàn)了Otx基因的兩個(gè)同源基因DjotxA和DjotxB,華而不實(shí)，DjotxB與Gtotx同源性比擬高。通過(guò)原位雜交發(fā)現(xiàn)兩者主要在視神經(jīng)細(xì)胞及視神經(jīng)纖維部位表示出，因而推斷兩者與視神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)及光傳導(dǎo)作用相關(guān)[22].Pax6基因?qū)儆赑ax基因家族，在很多脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中Pax6基因的表示出和視覺(jué)系統(tǒng)的發(fā)育密切相關(guān)，其突變體會(huì)導(dǎo)致眼的發(fā)育出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷或無(wú)眼類(lèi)型[23~25].因而，Pax6被視為動(dòng)物視覺(jué)系統(tǒng)發(fā)育中的關(guān)鍵調(diào)控基因[26~28].然而，在淡水渦蟲(chóng)中，Pax6基因主要在成體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)〔centralnervoussystem,CNS〕中表示出，在再生的眼點(diǎn)中表示出水平很低，只能在超微水平檢測(cè)到其表示出。并且，利用RNAi技術(shù)同時(shí)沉默Pax6A和Pax6B基因，再生的眼點(diǎn)未出現(xiàn)異常[5].利用Real-timePCR技術(shù)對(duì)渦蟲(chóng)眼點(diǎn)再生經(jīng)過(guò)中Pax6基因的表示出情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，Djpax6基因的表示出水平在渦蟲(chóng)頭部再生的第5天到達(dá)峰值[11],而這個(gè)時(shí)期是視神經(jīng)纖維向腦部延伸和眼點(diǎn)功能恢復(fù)期[29].因而以為，Djpax6基因可能與視神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)有關(guān)，而在眼點(diǎn)發(fā)育的早期作用不大[11].Djnetrin屬于Netrin基因家族，在高等動(dòng)物中，主要是在體內(nèi)血管構(gòu)成經(jīng)過(guò)中具有抗血管生成的作用[30,31].在日本三角渦蟲(chóng)中，Djnetrin在腦背側(cè)中部視穿插部位表示出，因而以為它對(duì)視神經(jīng)纖維向腦部延伸經(jīng)過(guò)中具有誘導(dǎo)作用[32].在地中海渦蟲(chóng)〔S.mediterranea〕中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)Netrin基因的同源基因Smed-netrin1和Smed-netrin2,它們?cè)诔审w和再生個(gè)體的CNS中均有表示出，并且在視中心部位也有表示出。通過(guò)RNAi同時(shí)沉默Smed-netrin1和Smed-netrin2,結(jié)果伸向視中心的視神經(jīng)纖維變短。因而以為Smed-netrin1和Smed-netrin2在視神經(jīng)纖維生長(zhǎng)經(jīng)過(guò)中起協(xié)同作用[29].另外，Real-timePCR結(jié)果顯示，Djnetrin的表示出量在渦蟲(chóng)頭部再生經(jīng)過(guò)中逐步升高，且在切割后的第4天有一個(gè)明顯調(diào)高[11],而切割后的第4天，也正是視神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的時(shí)期[33].因而以為，在渦蟲(chóng)眼點(diǎn)再生經(jīng)過(guò)中Djnetrin的作用主要是促進(jìn)視神經(jīng)纖維生長(zhǎng)。Smed-netR〔netrinreceptor〕屬于Netrin受體基因家族。在地中海渦蟲(chóng)中，RNAi沉默Smed-netR基因，不僅視神經(jīng)纖維與腦部視中心的結(jié)合出現(xiàn)異常，而且，渦蟲(chóng)的避光反響也發(fā)生了改變。因而以為，Smed-netR基因是視神經(jīng)纖維向腦部視覺(jué)中心正確結(jié)合經(jīng)過(guò)所必需的，除此之外Smed-netR基因可能還介入了避光反響的調(diào)節(jié)[29].在日本三角渦蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)，Djslit和DjroboA基因與視神經(jīng)穿插的正確構(gòu)成有關(guān)，原位雜交結(jié)果顯示Djslit在再生芽基的中心部位表示出。RNAi沉默Djslit基因，視神經(jīng)穿插的構(gòu)成出現(xiàn)異常；RNAi沉默DjroboA后，渦蟲(chóng)視神經(jīng)穿插的構(gòu)成也出現(xiàn)異常[9].同時(shí)在地中海渦蟲(chóng)中，RNAi沉默Smed-roboA基因同樣會(huì)導(dǎo)致視神經(jīng)纖維生長(zhǎng)出現(xiàn)異常現(xiàn)象。因而以為這兩個(gè)基因在渦蟲(chóng)眼點(diǎn)發(fā)育經(jīng)過(guò)中具有指導(dǎo)視神經(jīng)纖維正確生長(zhǎng)的功能[34].3.3與視覺(jué)系統(tǒng)功能恢復(fù)相關(guān)的基因：在眼點(diǎn)形態(tài)發(fā)生后期表示出的基因主要有Eye53、1020HH和Opsin基因。Eye53和1020HH基因在日本三角渦蟲(chóng)再生的第5天表示出，RNAi沉默Eye53和1020HH基因后，固然沒(méi)有觀察到渦蟲(chóng)的大腦和視覺(jué)神經(jīng)產(chǎn)生缺陷，但是渦蟲(chóng)卻沒(méi)有恢復(fù)避光反響的功能，因而以為Eye53和1020HH基因可能介入了視覺(jué)系統(tǒng)功能的恢復(fù)和維持[33].Inoue等[33]還指出，Eye53和1020HH基因編碼分泌蛋白，這些分泌蛋白可能介入了視神經(jīng)纖維的正確連接。Opsin基因所編碼的視蛋白是動(dòng)物視覺(jué)系統(tǒng)中最普遍的感光分子，與生色基團(tuán)共價(jià)結(jié)合構(gòu)成視色素，其功能是將光能轉(zhuǎn)化成電能進(jìn)而介導(dǎo)視覺(jué)構(gòu)成。對(duì)水母〔Tripedaliacystophora〕的最新研究表示清楚，Opsin在其視覺(jué)系統(tǒng)中表示出，可能與光感受及圖像的構(gòu)成有關(guān)[35].在淡水渦蟲(chóng)中，Opsin主要在感光細(xì)胞胞體中表示出[10,36],RNAi沉默Gtops發(fā)現(xiàn)渦蟲(chóng)個(gè)體失去了避光反響的功能[36~38].同時(shí)Real-timePCR結(jié)果顯示，在渦蟲(chóng)頭部切割后Djopsin呈逐步上調(diào)表示出趨勢(shì)，再生第5天明顯升高，第14天到達(dá)最高值[11].這種表示出趨勢(shì)和再生個(gè)體避光行為的恢復(fù)經(jīng)過(guò)相對(duì)應(yīng)，因而，進(jìn)一步證實(shí)Djopsin基因在日本三角渦蟲(chóng)的眼點(diǎn)形態(tài)發(fā)生中的作用是恢復(fù)和維持個(gè)體的視功能。3.4與眼點(diǎn)視杯的構(gòu)成相關(guān)的基因：有Sp6-9、Dlx、Smed-foxQ2、Smed-klf和Smed-meis基因。淡水渦蟲(chóng)的視杯主要是由色素細(xì)胞構(gòu)成，其功能是感受光的方向并介入感光膜的生化反響[39].研究發(fā)現(xiàn)，Sp6-9和Dlx在再生渦蟲(chóng)的眼點(diǎn)色素細(xì)胞中表示出，尤其是在視杯前體細(xì)胞分化早期表示出。RNAi沉默這兩種基因后導(dǎo)致再生經(jīng)過(guò)中不能生成早期的視杯前體細(xì)胞，進(jìn)而不能構(gòu)成視杯。因而以為，Sp6-9和Dlx基因在渦蟲(chóng)再生經(jīng)過(guò)中調(diào)控視杯的構(gòu)成[40].同時(shí)，在對(duì)渦蟲(chóng)眼點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，Smed-foxQ2、Smed-klf和Smed-meis基因分別在感光細(xì)胞和眼點(diǎn)前體細(xì)胞中表示出，RNAi沉默這3種基因發(fā)現(xiàn)視杯的形狀均表現(xiàn)出異常，因而揣測(cè)，這3種基因可能與正常視杯的構(gòu)成相關(guān)[16].4.結(jié)束語(yǔ)及瞻望毋庸置疑，渦蟲(chóng)由于其在動(dòng)物系統(tǒng)演化中的特殊地位、驚人的再生能力和構(gòu)造簡(jiǎn)單的原始眼,已成為研究后生動(dòng)物眼的形