高效液相色譜原理第一講

高效液相色譜原理第一講第一頁，共五十四頁，2022年，8月28日一、色譜概述二、高效液相色譜(HPLC)三、幾種主要的HPLC四、HPLC特點(diǎn)、流程及主要部件第二頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.什么是色譜?色譜是色譜法的簡稱(又叫色層法,層析法),其本質(zhì)是一種分離分析方法常見的分離方法蒸餾離心電泳過濾色譜(目前最有效的分離方法)一、色譜概述第三頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.色譜法簡介色譜法(Chromatography)溯源

100多年前俄國植物學(xué)家Tswett分離植物色素時采用的實(shí)驗(yàn)方法

他將植物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,結(jié)果色素中各組份互相分離形成各種不同顏色的譜帶

Tswett用希臘語chroma(色)和graphos(譜)描述他的實(shí)驗(yàn)方法，即現(xiàn)在的Chromatography(色譜法)第四頁，共五十四頁，2022年，8月28日第五頁，共五十四頁，2022年，8月28日3.色譜法的發(fā)展色譜法是一種現(xiàn)代的分離方法

1906年正式命名20世紀(jì)30年代開始廣泛研究和應(yīng)用高效液相色譜法的廣泛應(yīng)用始于20世紀(jì)70年代第六頁，共五十四頁，2022年，8月28日4.色譜法原理色譜法的原理利用混合物中各組份在不同的兩相(流動相、固定相）中溶解,分配,吸附等化學(xué)作用性能的差異,當(dāng)流動相中所攜帶的混合物流過固定相時，就會和固定相發(fā)生作用(力的作用)。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上有差異，與固定相發(fā)生作用的大小也有差異。因此，在同一推動力作用下，不同組分在固定相中的滯留時間有長有短，從而按先后不同的次序從固定相中流出。兩相中有一相是固定的,叫作固定相(StationaryPhase),有一相是流動的,稱為流動相(MobilePhase),流動相又叫洗脫劑,溶劑第七頁，共五十四頁，2022年，8月28日相(Phase):

物理化學(xué)術(shù)語,特指在某一系統(tǒng)中,具有相同成分及相同物理、化學(xué)性質(zhì)的均勻物質(zhì)部分。各相之間有明顯可分的界面。第八頁，共五十四頁，2022年，8月28日

分離分離是一個物理過程。固定相(StationaryPhase)流動相(MobilePhase)進(jìn)樣(Injection)洗脫(Elution)相互作用(Interaction)第九頁，共五十四頁，2022年，8月28日Temporalcourse淋洗液色譜分離第十頁，共五十四頁，2022年，8月28日5.色譜法的分類(1)按分離過程的機(jī)理分:吸附色譜(AbsorptionChromatography)根據(jù)樣品組分對活性固定相表面吸附親和力的不同實(shí)現(xiàn)分離分配色譜(PartitionChromatography)分離基于樣品組分在固定相和流動相中的溶解度(分配系數(shù))不同離子交換色譜(IonExchangeChromatography)根據(jù)樣品組份離子交換親和力的差異分離,簡稱離子色譜(IC)第十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日GPC(GelPermeationChromatography)

固定相是疏水性凝膠,流動相是有機(jī)溶劑

GFC(GelFiltrationChromatography)

固定相是親水性凝膠,流動相是水溶液利用多孔性物質(zhì)對不同大小的分子的排阻作用進(jìn)行分離的方法

體積排除色譜(SizeExclusionChromatography)

親和色譜利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。第十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日(2)按流動相的物態(tài)分:氣相色譜(GasChromatography,GC)

用氣體作為流動相(又叫載氣)液相色譜(LiquidChromatography,LC)

用液體作為流動相(又叫洗脫劑)(3)按固定相的形態(tài)分:平面色譜紙色譜薄層色譜柱色譜第十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日色譜法分類示意圖第十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日二、高效液相色譜(HPLC)HPLC的產(chǎn)生

HPLC的固定相

HPLC的流動相第十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.HPLC的產(chǎn)生液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經(jīng)典液相色譜法柱效低、時間長(常有幾個小時)。第十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上,于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻,小顆粒具有高柱效,但會引起高阻力,需用高壓輸送流動相,故又稱高壓液相色譜法(HighPressureLiquidChromatography，HPLC).因分析速度快而又稱為高速液相色譜法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。第十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日HPLC是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜,基于儀器方法的高效能分離手段

高性能色譜柱,高精度輸液泵,高靈敏度檢測器…

廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域:醫(yī)藥,環(huán)保,石化,生命科學(xué),食品工業(yè),農(nóng)業(yè)…

無論在技術(shù)上,理論上,還是在應(yīng)用上仍有較大的發(fā)展空間第十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.高效液相色譜的固定相(1)固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.0108～1.0109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5108Pa。第十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日表面多孔型固定相它的基體是實(shí)心玻璃球，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化硅、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。(2)固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型兩類。多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達(dá)到平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受到限制。第二十頁，共五十四頁，2022年，8月28日全多孔型固定相由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。這類固定相由于顆粒細(xì)(5～10m)，孔仍然較淺，傳遞速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及衡量分析。第二十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日3.液相色譜的流動相(1)流動相特性液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況.親水性固定相常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。

第二十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日(2)流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間。第二十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日(3)流動相選擇在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。溶劑的極性越高，則保留時間縮短，通過改變流動相的極性可以得到理想的保留時間。常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)。第二十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日(4)流動相的要求流動相是液體，它對組分有親合力，并參與固定相對組分的競爭，因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：溶劑對于待測樣品，須具有合適的極性和良好的選擇性。溶劑與檢測器匹配①對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。(所謂溶劑的紫外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測量)。②對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達(dá)到最高靈敏度。第二十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日高純度由于高效液相色譜靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”?；瘜W(xué)穩(wěn)定性好低粘度(粘度適中)若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離①常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等；②但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自谏V柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。第二十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日(5)選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。第二十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日按分離機(jī)制的不同分為：吸附色譜法分配色譜法交換色譜法（離子）體積排阻色譜法親和色譜法三、幾種主要的HPLC第二十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日(一)吸附(液-固)色譜基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸。固定相：固體吸附劑為硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。應(yīng)用：適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性。缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾。第二十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日基本原理：利用試樣各組分在固定相和流動相上的分配比例不同而分離。在固定相上分配多的組分（分配系數(shù)高）后出峰，分配少（分配系數(shù)低）的先出峰。流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相normalphase），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。(二)分配（液-液）色譜第三十頁，共五十四頁，2022年，8月28日(三)離子交換色譜基本原理：組分在固定相上發(fā)生反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時間長。陽離子交換：R-SO3H+M+=R-SO3M+H+

陰離子交換：R-NR4OH+X-=R-NR4X+OH-

固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂。流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液。應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等第三十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日陽離子交換分離機(jī)理ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＨＣＯ３－Ｃｌ－ＳＯ４２－Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－TemporalcourseＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＨＣＯ３－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋第三十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日

ＳＯ３－ＳＯ３－ＳＯ３－ＳＯ３－Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３陰離子交換分離機(jī)理５μm＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋第三十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日(四)體積排阻色譜固定相：具有一定大小孔隙的凝膠；原理：借助多孔性凝膠孔徑的大小，使樣品中的大分子不能進(jìn)入凝膠孔洞而完全被排阻，只能沿凝膠粒子之間的空隙通過色譜柱，而首先被洗脫出來。被分析樣品可按分子的相對大小分別先后流出。第三十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日(五)親和色譜

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留.改變淋洗液后洗脫。第三十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日按分離過程物理化學(xué)原理分類的各種液相色譜法的比較具有鎖匙結(jié)構(gòu)絡(luò)合物的可逆性離解

多孔凝膠的滲透或過濾

可逆性的離子交換

吸附與解吸

分離原理

不同pH值的緩沖溶液，加入改性劑

有機(jī)溶劑或一定pH值的緩沖溶液

不同pH值的緩沖溶液

不同極性有機(jī)溶劑

流動相

多種不同性能的配位體鍵聯(lián)在固相基體上

具有不同孔徑的多孔性凝膠

高效微粒離子交換劑

溶解與揮發(fā)

不同極性有機(jī)溶劑和水

固定液載在固相基體上

全多孔固體吸附劑

固定相

親和色譜體積排阻色譜離子色譜分配色譜吸附色譜相\色譜第三十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日四、HPLC特點(diǎn)、流程及主要部件

特點(diǎn)流程主要部件第三十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日HPLC儀器（1）第三十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日液相色譜儀（2）第三十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日液相色譜儀（3）第四十頁，共五十四頁，2022年，8月28日液相色譜儀（4）第四十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.HPLC的特點(diǎn)

分離效能高選擇性能高檢測靈敏度高分析速度快第四十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.流程第四十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日色譜的基本流程圖淋洗液

高壓泵分離柱檢測器泵液分離檢測記錄進(jìn)樣器抑制器檢測器進(jìn)樣第四十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日3.主要部件

輸液泵(高壓)

梯度淋洗器(裝置)

進(jìn)樣器(裝置)

分離器(柱)

檢測器(裝置)

結(jié)果記錄器(計(jì)算機(jī)及軟件)第四十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性第四十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日(2)梯度淋洗裝置外梯度(低壓梯度):一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。梯度:不同溶劑的比例.

通過設(shè)置不同溶劑之間的比例(梯度)使流動相的強(qiáng)度、極性、pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化，達(dá)到提高分離效果，縮短分析時間的目的。內(nèi)梯度(高壓梯度):兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。第四十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日(3)進(jìn)樣裝置(器)流路中