菌種的管理和保藏

2023/2/141前言

試驗(yàn)過(guò)程中，生物樣本可能是最敏感的，因?yàn)樗鼈兊幕钚院吞匦砸蕾囉诤线m的試驗(yàn)操作和貯藏條件。實(shí)驗(yàn)室菌種的處理和保藏的程序應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化，使盡可能減少菌種污染和生長(zhǎng)特性的改變。按統(tǒng)一操作程序制備的菌株是微生物試驗(yàn)結(jié)果一致性的重要保證。2023/2/142菌種保藏的重要性

菌種保藏是微生物學(xué)檢驗(yàn)工作中的一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)，菌種的科學(xué)保藏和管理直接關(guān)系到檢驗(yàn)結(jié)果的正確性。

2023/2/143菌種的來(lái)源

藥品微生物檢驗(yàn)用的試驗(yàn)菌應(yīng)來(lái)自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種收藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生菌株。2023/2/144

⒈廣泛收集各種有用的微生物菌種。⒉選擇最適宜的保藏方法。⒊研究、檢驗(yàn)、交換和使用。菌種保藏的中心任務(wù)2023/2/145

國(guó)外的菌種保藏機(jī)構(gòu)

2023/2/146常用菌種保藏方法

菌種保藏的原則根據(jù)微生物菌種的生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，使細(xì)胞基本上處于休眠狀態(tài)，生長(zhǎng)繁殖受到抑制但不至于死亡，以減低菌種的變異率。

2023/2/147

標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)活或培養(yǎng)物的制備應(yīng)按供應(yīng)商提供的說(shuō)明或按驗(yàn)證的方法進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株-從國(guó)內(nèi)、外菌種收藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)復(fù)活并在適宜的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后,既為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株。常用菌種保藏方法2023/2/148

低溫、干燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境條件都可以抑制微生物的代謝和生長(zhǎng)繁殖，因此低溫、干燥和真空是菌種保藏的重要手段。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株經(jīng)純度和特性確認(rèn)后保存時(shí)，可將培養(yǎng)物等份懸浮于抗冷凍的培養(yǎng)基中，并分裝于小瓶中,建議采用低溫冷凍干燥，液氮儲(chǔ)存，超低溫冷凍(低于-70℃)等方法保存。

2023/2/149

低于-70℃或低溫冷凍干燥可以延長(zhǎng)菌種的保存時(shí)間.標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株可用于制備每月或每周一次轉(zhuǎn)種的工作菌株。冷凍菌株一旦解凍轉(zhuǎn)種制備工作菌株后,不得重新冷凍或再次使用。2023/2/1410

工作菌株不可代替標(biāo)準(zhǔn)菌株，標(biāo)準(zhǔn)菌株的商業(yè)衍生物僅可用作工作菌株。2023/2/1411

不同的微生物，應(yīng)根據(jù)其生物特征來(lái)選擇最適宜的保藏方法，菌種的保藏方法一般分四個(gè)階段：2023/2/1412⑴

挑選特征典型的純菌菌落。⑵確定保藏的合適菌體。⑶選擇最適宜的方法保藏。⑷定期對(duì)保藏的菌種進(jìn)行檢查。2023/2/1413二、菌種的傳代和使用

工作菌種的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制，不得超過(guò)5代，（從菌種保藏中心獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株為第0代）防止過(guò)度的傳代造成菌種變異。

1代是指將活的培養(yǎng)物接種到新鮮培養(yǎng)基中，任何亞培養(yǎng)的形式均被認(rèn)為是轉(zhuǎn)種或傳代一次。必要時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)工作菌株的特性和純度進(jìn)行確認(rèn)。2023/2/1414

細(xì)菌的接種、分離和培養(yǎng)常用培養(yǎng)基種類斜面培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基

2023/2/1415接種方法涂布法劃線法穿刺法直接加入法等2023/2/1416

分離：為了獲得純菌種（株），采用的將細(xì)菌分離成單個(gè)細(xì)胞，使其獨(dú)立分裂繁殖形成單個(gè)菌落的操作技術(shù)。分離一般采用平板培養(yǎng)基。分離方法主要有分段劃線法、連續(xù)劃線法、涂布分離法、傾注分離法等。2023/2/1417

培養(yǎng)：接種后的培養(yǎng)基，根據(jù)不同微生物生長(zhǎng)條件的要求，將培養(yǎng)基放在適宜微生物生長(zhǎng)的環(huán)境中（溫度、濕度、氧氣等），使其生長(zhǎng)繁殖的過(guò)程。

需氣菌培養(yǎng)法

厭氧培養(yǎng)法2023/2/1418

培養(yǎng)后微生物的生長(zhǎng)判斷

固體培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基

2023/2/1419

三、菌種的檢查與復(fù)壯

菌種的衰退菌種經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期人工傳代培養(yǎng)或保藏，由自發(fā)突變的作用而引起某些優(yōu)良特性變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象?？刂凭N的衰退方法

⑴控制傳代次數(shù)盡量避免不必要的接種和傳代，降低突變幾率。采用良好的傳代保藏方法。《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定，傳代次數(shù)不得超過(guò)5代。2023/2/1420

⑵創(chuàng)造適宜的培養(yǎng)條件⑶用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳代⑷采用有效的保藏方法2023/2/1421

定期檢查

主要檢查項(xiàng)目菌落形態(tài)、革蘭染色、顯微鏡下菌體形態(tài)、生化特性及血清學(xué)檢查。2023/2/1422菌種的復(fù)壯使衰退的菌種重新恢復(fù)原來(lái)的優(yōu)良特性的過(guò)程驗(yàn)室主要采用分離純化的方法。2023/2/1423

四、菌種的管理

1、使用菌種的單位，應(yīng)具備從事微生物工作的條件和設(shè)備。菌種應(yīng)由專人負(fù)責(zé)管理，管理人員應(yīng)具有微生物專業(yè)知識(shí)和技術(shù)水平，并應(yīng)具有較強(qiáng)的責(zé)任心。

2023/2/1424

2、實(shí)驗(yàn)室必須建立菌種保存和使用文件化的程序管理制度；

包括：每支菌種標(biāo)注名稱、標(biāo)準(zhǔn)號(hào)、接種日期、傳代次數(shù)、進(jìn)出、收集、貯藏、保存、確認(rèn)試驗(yàn)以及銷毀的記錄、標(biāo)準(zhǔn)菌種的申購(gòu)記錄、從標(biāo)準(zhǔn)菌株到工作菌株操作記錄，如菌種定期轉(zhuǎn)種傳代，鑒定（純度、特性）、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件、菌種保存的位置和條件及其它需要的程序。2023/2/14253、菌種應(yīng)冷藏或冷凍保存，保存菌種的冰箱不得放置食品和易揮發(fā)性藥品，放置菌種應(yīng)有專用的冰箱，應(yīng)上鎖管理。4、由專人按操作規(guī)程和有關(guān)要求定期進(jìn)行傳代，并定期對(duì)保存的菌種進(jìn)行檢查，一般每年1～2次，（或定期更換凍干菌種）。發(fā)現(xiàn)菌種的異常情況應(yīng)及時(shí)檢查。一旦發(fā)現(xiàn)菌種污染和變異現(xiàn)象，應(yīng)立即報(bào)告、研究處理。尤其長(zhǎng)期保存時(shí)。

2023/2/1426

詳細(xì)記錄菌種的來(lái)源、接收、傳代、分離、復(fù)壯、使用和鑒定等均應(yīng)做好詳細(xì)記錄。包括菌保存位置、環(huán)境(溫度)、種傳代或使用時(shí)間、名稱、菌號(hào)、代數(shù)、傳代或保存形式、分離、復(fù)壯方式、使用內(nèi)容、鑒定情況等都應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的記錄。2023/2/1427菌種不得隨意帶