流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞技術(shù)第一頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)檢查中的應(yīng)用一、淋巴細(xì)胞及其亞群的分析二、淋巴細(xì)胞功能分析三、淋巴造血系統(tǒng)分化抗原及白血病免疫分型四、腫瘤耐藥相關(guān)蛋白分析五、AIDS病檢測(cè)中的應(yīng)用六、自身免疫性疾病相關(guān)HLA抗原分析七、移植免疫中的應(yīng)用思考題小結(jié)第二頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。第三頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日

流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選。

流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)第四頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)概述第五頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日

流式細(xì)胞儀是測(cè)量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強(qiáng)度的細(xì)胞分析儀，是在單個(gè)細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的對(duì)細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進(jìn)行快速測(cè)量并可分類收集的高技術(shù)。第六頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日第七頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞組成細(xì)胞功能大小細(xì)胞表面/胞漿/核--特異性抗原粒度細(xì)胞活性DNA,RNA含量胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點(diǎn)鈣離子,PH值,膜電位酶活性流式細(xì)胞儀常檢測(cè)的細(xì)胞特性第八頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測(cè)的靈敏度和特異性；一、工作原理第九頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)分析精確性。第十頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日

（1）液流系統(tǒng)（2）光學(xué)系統(tǒng)（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1.流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)：第十一頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日由樣本和鞘液組成待測(cè)細(xì)胞 單個(gè)細(xì)胞的懸液 熒光染料標(biāo)記的單抗對(duì)其染色受清潔氣體壓力 從樣品管進(jìn)入流動(dòng)室形成樣本流鞘液：輔助樣本流被正常檢測(cè)的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細(xì)胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。

（1）液流系統(tǒng)第十二頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長(zhǎng)/短波長(zhǎng)，通過短/長(zhǎng)波長(zhǎng)光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS（散射光），F(xiàn)L1,FL2,FL3,FL4（熒光）（2）光學(xué)系統(tǒng)第十三頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日FlowTipLaserSSandFLDetectorFSDetector光學(xué)系統(tǒng)示意圖第十四頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日主要由計(jì)算機(jī)及其軟件組成（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第十五頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日基本工作原理第十六頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日區(qū)別流式細(xì)胞儀顯微鏡光源激光自然光、燈光對(duì)象細(xì)胞、生物粒子細(xì)胞、組織等承載工具鞘液及流動(dòng)室載玻片檢測(cè)信號(hào)光學(xué)信號(hào)形態(tài)及染色放大方式PMT、放大電路目鏡×物鏡、光學(xué)放大統(tǒng)計(jì)計(jì)算機(jī)，>5000人工，200結(jié)果多參數(shù)，綜合分析簡(jiǎn)單，單參數(shù)流式細(xì)胞儀與顯微鏡的區(qū)別第十七頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周圍360°立體角方向散射的光線信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為前向散射光和側(cè)向散射光。二、散射光的測(cè)定第十八頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日第十九頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比。第二十頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日

側(cè)向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以90°角散射的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。第二十一頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日

測(cè)得的FS與SS信號(hào)通過計(jì)算機(jī)處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。光散射測(cè)量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群第二十二頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。三、熒光測(cè)量第二十三頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。第二十四頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征。線性放大器和對(duì)數(shù)放大器第二十五頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)發(fā)射波長(zhǎng)(EMISSION)第二十六頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日

通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。四、細(xì)胞分選原理第二十七頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞懸液形成液流柱流動(dòng)室振動(dòng)液流斷裂成液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)不充電充電（一）分選基本原理第二十八頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日分選速度：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與懸液中細(xì)胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的百分率。（二）分選的技術(shù)要求第二十九頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日分選收獲率：實(shí)際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過測(cè)量點(diǎn)的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實(shí)際得率。與分選速度成反比。第三十頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)數(shù)據(jù)的顯示與分析第三十一頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日參數(shù)：FS,SS,FL數(shù)據(jù)顯示方式（單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點(diǎn)圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數(shù)散點(diǎn)圖）設(shè)門分析技術(shù)第三十二頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少一、參數(shù)第三十三頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點(diǎn)圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析直分析方圖二、數(shù)據(jù)顯示方式第三十四頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。（一）單參數(shù)直方圖第三十五頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。（二）雙參數(shù)直方圖第三十六頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。第三十七頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日2.二維等高圖由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線)所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。第三十八頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日

多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。（四）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析第三十九頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求

第四十頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日樣本制備標(biāo)記染色液相芯片技術(shù)質(zhì)量控制第四十一頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備 分離單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備蛋白酶消化機(jī)械吹打使貼壁細(xì)胞脫落洗滌尼龍網(wǎng)過濾單細(xì)胞懸液一、免疫檢測(cè)樣品制備第四十二頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備機(jī)械法酶處理法化學(xué)試劑處理法表面活性劑處理法第四十三頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日單細(xì)胞懸液的保存深低溫保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）第四十四頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日適用條件:有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)對(duì)488nm的激發(fā)光波長(zhǎng)有較強(qiáng)的吸收發(fā)射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)間有較大的波長(zhǎng)差易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色第四十五頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日名稱染料激發(fā)波長(zhǎng)熒光顏色溶解性對(duì)PH敏感性特點(diǎn)異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團(tuán)，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復(fù)合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料第四十六頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日

用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過一個(gè)熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而檢測(cè)到該特定熒光信號(hào)。能量傳遞復(fù)合染料第四十七頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日熒光染料與細(xì)胞成分的四種結(jié)合方式

結(jié)構(gòu)親和式 嵌入結(jié)合 共價(jià)鍵結(jié)合 熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合（二）免疫熒光標(biāo)記第四十八頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日免疫熒光標(biāo)記方法

直標(biāo):干擾少,但需購(gòu)買多種單抗

間標(biāo):步驟多,干擾多,不需標(biāo)記多種抗體 組合標(biāo)記第四十九頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日免疫膠乳顆粒的應(yīng)用即液相芯片技術(shù)是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色，把針對(duì)不同檢測(cè)物的乳膠微球混合后再加入待標(biāo)本，在懸液中與微粒進(jìn)行特異性地結(jié)合，經(jīng)激光照射后不同待測(cè)特產(chǎn)生不同顏色，并可進(jìn)行定量分析。因檢測(cè)速度極快，所以又有“液相芯片”之稱。三、免疫膠乳顆粒技術(shù)的應(yīng)用第五十頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色（固相芯片是用探針在芯片上的坐標(biāo)位置給基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來(lái)編碼）第五十一頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)在免疫學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用第五十二頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日

流式細(xì)胞術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于免疫學(xué)基礎(chǔ)研究和逐步進(jìn)入臨床應(yīng)用各方面，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面的抗原成分進(jìn)行標(biāo)記分析，可區(qū)別多種細(xì)胞的特性，為細(xì)胞免疫的研究增加了有效的手段和幫助。第五十三頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日T淋巴細(xì)胞及其亞群分析

Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴細(xì)胞及其亞群分析

B1(CD19+CD5+):產(chǎn)生IgM型自身抗體,參與免疫調(diào)節(jié)、與自身免疫病的發(fā)生有關(guān)

B2(CD19+CD5-):受外來(lái)抗原刺激,產(chǎn)生高親和性特異性抗體NK細(xì)胞分析

NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴細(xì)胞及其亞群的分析第五十四頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性試驗(yàn)(死細(xì)胞與活細(xì)胞比例)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)定二、淋巴細(xì)胞功能分析第五十五頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日三、淋巴造血系統(tǒng)及白血病免疫分型對(duì)淋巴瘤和白血病進(jìn)行多色免疫分型用于選擇化療方案、判斷預(yù)后及檢出微小殘留病變第五十六頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日CD4+Th細(xì)胞、CD4+/CD8+比例

MDR(+)表示對(duì)化療藥物耐藥四、腫瘤耐藥基因分析五、AIDS病檢測(cè)中的應(yīng)用第五十七頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日HLA-B27可出現(xiàn)在58%～97%的強(qiáng)直性脊椎炎(As)患者 六、自身免疫病相關(guān)HLA抗原分析第五十八頁(yè)，共六十頁(yè)，2022年，8月28日

FCM作為一個(gè)強(qiáng)大的技術(shù)平臺(tái)，已應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，其在