BMP4編碼蛋白結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測(cè)分析,生物工程論文

BMP4編碼蛋白結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測(cè)分析,生物工程論文隨著人類和真核生物基因組測(cè)序完成，當(dāng)代基因工程學(xué)已經(jīng)步入后基因組時(shí)代[1].面對(duì)核酸、蛋白序列及構(gòu)造數(shù)據(jù)資源增長(zhǎng)，生物信息學(xué)應(yīng)運(yùn)而生并逐步發(fā)展，逐步成為生命科學(xué)在信息時(shí)代的核心內(nèi)容之一[2].本試驗(yàn)將綿羊骨形態(tài)發(fā)生蛋白4〔bonemorphogeneticprotein4,BMP4〕基因通過NCBIBLAST、Protparam、Protscale、NetPhos2.0Server、InterProscan、DNAStar、TMHMMServerv.2.0、PsortⅡ、SignalP等多種生物信息學(xué)軟件來進(jìn)行同源性比對(duì)分析并揣測(cè)編碼蛋白的理化性質(zhì)、疏水性、磷酸化位點(diǎn)、保守功能構(gòu)造域、二級(jí)構(gòu)造、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位及信號(hào)肽，并用SWISS-MODELWorkspace來預(yù)測(cè)三維構(gòu)造。通過對(duì)BMP4編碼蛋白構(gòu)造和功能的預(yù)測(cè)和分析來為更近一步的研究奠定基礎(chǔ)。1材料與方式方法1.1數(shù)據(jù)來源綿羊BMP4基因序列來源于綿羊皮膚轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果[3],各物種的BMP4基因序列來源于NC-BI,GenBank登錄號(hào)分別：藏羚羊XM_005968646、小鼠NM_007554、野駱駝XM_006185423、美洲駝XM_006199839、人NM_130851、牛XM_005211793、豬XM_005659971、山羊NM_001285646、馬NM_001163970、家兔NM_001195723、雞NM_205237.1.2生物信息學(xué)分析利用NCBI的BLASTn軟件對(duì)BMP4基因進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析。運(yùn)用NCBI的ORFFind-er進(jìn)行開放閱讀框〔openreadingframe,ORF〕分析并獲取編碼蛋白的氨基酸序列，運(yùn)用DNAMAN軟件分析綿羊BMP4與各物種BMP4的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了各物種間BMP4的系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用Prot-param工具對(duì)綿羊BMP4基因編碼蛋白進(jìn)行分子質(zhì)量、等電點(diǎn)預(yù)測(cè).利用Ptotscale工具對(duì)綿羊BMP4基因編碼蛋白進(jìn)行疏水性分析。利用TMHMMServerv.2.0軟件進(jìn)行跨膜區(qū)域分析。信號(hào)肽是決定新生肽鏈在細(xì)胞中的定位或決定某些氨基酸殘基修飾的一些肽段，蛋白的定位是通過信號(hào)序列引導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的，信號(hào)序列通常為15-60個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，位于新生肽的N端，利用SignalP軟件進(jìn)行信號(hào)肽分析〔.保守功能構(gòu)造域檢索利用NCBI網(wǎng)站上的ConservedDomainSearch工具及EBI網(wǎng)站上的InterProscan[4]工具進(jìn)行。運(yùn)用ExPaSy軟件中的NetPhos2.0Server對(duì)蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)[4].運(yùn)用PsortⅡ軟件分析該蛋白的亞細(xì)胞定位[5].分析位置功能域或新發(fā)現(xiàn)蛋白分子的構(gòu)造并預(yù)測(cè)其功能單位或構(gòu)造域，可為已有蛋白的改造或新蛋白的設(shè)計(jì)提供根據(jù)，為新基因構(gòu)造和功能的預(yù)測(cè)提供參照，采用DNAStar軟件預(yù)測(cè)二級(jí)構(gòu)造，運(yùn)用SWISS-MODELWorkspace預(yù)測(cè)三維構(gòu)造。2結(jié)果與分析2.1BMP4的ORF分析對(duì)BMP4的cDNA進(jìn)行序列統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見圖1.由圖1可知，BMP4基因序列包含完好的CDS區(qū)，有一個(gè)完整的ORF.ORF位于422-1651bp,長(zhǎng)度為1230bp,共編碼409個(gè)氨基酸，得到編碼蛋白的氨基酸序列，以便后續(xù)試驗(yàn)對(duì)BMP4進(jìn)行各項(xiàng)分析。2.2物種間同源性比對(duì)分析將BMP4的cDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與已頒布的藏羚羊BMP4基因序列〔登錄號(hào)：XM_005968646〕同源性為99%,與小鼠〔登錄號(hào)：NM_007554〕同源性為92%,與野駱駝〔登錄號(hào)：XM_006185423〕同源性為97%,與美洲駝〔登錄號(hào)：XM_006199839〕同源性為96%,與人〔登錄號(hào)：NM_130851〕同源性為95%,與?！驳卿浱?hào)：XM_005211793〕同源性為99%,與豬〔登錄號(hào)：XM_005659971〕同源性為96%,與山羊〔登錄號(hào)：NM_001285646〕同源性為99%,與馬〔登錄號(hào)：NM_001163970〕同源性為95%,與家兔〔登錄號(hào)：NM_001195723〕同源性為94%,與雞〔登錄號(hào)：NM_205237〕同源性為79%.用DNAMAN軟件構(gòu)建綿羊BMP4與其他幾個(gè)物種之間cDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2,各物種BMP4基因部分保守區(qū)域比對(duì)分析見圖3.由圖2、3可知，除了與雞〔登錄號(hào)：NM_205237〕的BMP4基因同源性較低外，與其他幾個(gè)物種均具有很高的同源性，且BMP4基因在各物種之間的保守區(qū)域位于cDNA序列的前10-390位堿基之間。2.3BMP4編碼蛋白的理化性質(zhì)分析利用Protparam工具對(duì)蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示BMP4編碼蛋白的分子式為C2058H3234N622O596S16,原子總數(shù)為6526,相對(duì)分子質(zhì)量為46739.0,理論等電點(diǎn)為8.73,氨基酸總數(shù)為409個(gè)。在氨基酸組成上，亮氨酸〔Leu,L〕最多，有39個(gè)，占9.5%;精氨酸〔Arg,R〕其次，有37個(gè)，占9.0%;色氨酸〔Trp,W〕最少，有6個(gè)，占1.5%.總的帶負(fù)電殘基〔Asp+Glu〕為46,總的帶正電殘基〔Arg+Lys〕為51.其消光系數(shù)在280nm時(shí)為49890,不穩(wěn)定系數(shù)為59.96,講明BMP4蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為80.54,總平均親水性為-0.553,講明BMP4蛋白是一個(gè)親水蛋白。2.4BMP4編碼蛋白的疏水性分析利用Protscale軟件分析蛋白疏水性質(zhì)，結(jié)果顯示整條多肽鏈表現(xiàn)為較強(qiáng)的親水性，華而不實(shí)第305位的精氨酸〔Arg,R〕具有最低的分值〔-3.200〕，親水性最強(qiáng)；多肽鏈的第18位的異亮氨酸〔Ile,I〕具有最高的分值〔1〕，疏水性最強(qiáng)，推斷BMP4蛋白是一種可溶性的蛋白〔圖4〕.2.5BMP4編碼蛋白的功能域預(yù)測(cè)用NCBIConservedDomainSearch工具結(jié)合EBI網(wǎng)站的InterProscan工具預(yù)測(cè)BMP4編碼蛋白的功能域。BMP4編碼蛋白含有2個(gè)功能域，即TGF-超家族和TGF-前肽超家族，無跨膜區(qū)〔圖5〕.TGF-超家族為編碼蛋白的活性區(qū)域，位于309-409位氨基酸處，它是控制很多細(xì)胞增殖、分化及其他功能的多功能肽。TGF-前肽超家族位于38-276位氨基酸處，與C末端生物活性區(qū)以非共價(jià)鍵結(jié)合構(gòu)成LAP.2.6BMP4編碼蛋白的二級(jí)構(gòu)造預(yù)測(cè)用DNAStar軟件預(yù)測(cè)BMP4編碼蛋白的二級(jí)構(gòu)造，預(yù)測(cè)圖見圖6,蛋白的二級(jí)構(gòu)造是它的生物基礎(chǔ)。2.7BMP4編碼蛋白的信號(hào)肽分析本研究采用蛋白序列信號(hào)分析工具SignalP對(duì)BMP4編碼蛋白進(jìn)行了分析，并得到3種C、Y、S值計(jì)算結(jié)果。對(duì)于一個(gè)典型的信號(hào)肽，C值和Y值趨向于+1,S值在剪切位點(diǎn)之前高，而在剪切位點(diǎn)之后變低。由圖7可知，編碼產(chǎn)物的分值曲線非常典型，C值為0.554,Y值為0.694,S值為0.953,可能的剪切位點(diǎn)位于24和25位氨基酸之間，基本能夠斷定BMP4編碼蛋白存在信號(hào)肽。2.8BMP4編碼蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位TMHMMServerv.2.0是一款預(yù)測(cè)和分析蛋白跨膜區(qū)域的功能軟件。通過TMHMMServerv.2.0預(yù)測(cè)蛋白跨膜區(qū)，結(jié)果顯示無跨膜區(qū)〔圖8〕。利用PsortⅡ分析BMP4編碼蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示47.8%位于細(xì)胞核、13.0%位于細(xì)胞外〔包括細(xì)胞壁〕、13.0%位于細(xì)胞支架、8.7%位于細(xì)胞質(zhì)、8.7%位于線粒體、4.3%位于空泡、4.3%位于分泌腺系統(tǒng)，所以揣測(cè)該蛋白很可能定位于細(xì)胞核中。2.9BMP4編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)運(yùn)用ExPaSy軟件中的NetPhos2.0Server對(duì)蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示BMP4編碼蛋白具有18個(gè)磷酸化位點(diǎn)，華而不實(shí)色氨酸〔Ser,W〕位點(diǎn)12個(gè)、蘇氨酸〔Thr,T〕位點(diǎn)3個(gè)、酪氨酸位點(diǎn)〔Tyr,Y〕3個(gè)〔圖9〕.2.10BMP4編碼蛋白的三維構(gòu)造預(yù)測(cè)應(yīng)用SWISS-MODELWorkspace平臺(tái)對(duì)BMP4編碼蛋白的三級(jí)構(gòu)造進(jìn)行預(yù)測(cè)，選擇3bmp.1.A〔303-409〕作為模板蛋白，結(jié)果顯示預(yù)測(cè)出的三維構(gòu)造氨基酸序列與模板蛋白同源性到達(dá)了88.29%〔圖10〕.3討論生物信息學(xué)技術(shù)分析基因序列所含的遺傳信息，研究基因所控制構(gòu)成的蛋白產(chǎn)物，并揭示表示出的生物學(xué)意義[6].對(duì)綿羊皮膚轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果得到的BMP4基因序列的cDNA進(jìn)行序列統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP4基因序列包含完好的CDS區(qū)，有一個(gè)完好的ORF.ORF位于422-1651bp,長(zhǎng)度為1230bp,共編碼409個(gè)氨基酸。將綿羊BMP4的cDNA序列與GenBank中其他物種BMP4基因進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與其他物種都具有很高的同源性，華而不實(shí)與藏羚羊和牛具有最高的同源性，為99%;與雞具有最低的同源性僅為79%.通過理化性質(zhì)分析得出BMP4編碼蛋白的分子式為C2058H3234N622O596S16,原子總數(shù)為6526,相對(duì)分子質(zhì)量為46739.0,理論等電點(diǎn)為8.73,氨基酸總數(shù)為409個(gè)。綿羊BMP4編碼蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定的親水蛋白，不存在跨膜區(qū)，很可能位于細(xì)胞核中，且存在信號(hào)肽。編碼蛋白具有18個(gè)磷酸化位點(diǎn)，通過功能域的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)編碼蛋白含有2個(gè)功能域，即TGF-超家族和TGF-前肽超家族，無跨膜區(qū)。這與BMP4基因家族的功能相一致，證明了綿羊BMP4是一種生長(zhǎng)因子，具有信號(hào)傳導(dǎo)功能。蛋白三維構(gòu)造預(yù)測(cè)結(jié)果與模板蛋白3bmp.1.A同源性到達(dá)了88.29%.1374已有研究結(jié)果表示清楚，BMPs是一組能在骨骼外異位誘導(dǎo)軟骨和骨形態(tài)發(fā)生的分泌型蛋白，其成員不少于20種[7-8].BMPs不僅能誘導(dǎo)成骨，而且在胚胎發(fā)育、神經(jīng)、造血組織、皮膚附屬物等的構(gòu)成和分化中都起重要作用[8].多項(xiàng)研究報(bào)道，在一些動(dòng)物的卵巢、前列腺、皮膚及其衍生物等組織中檢測(cè)到BMPs,BMPs及其受體在毛囊發(fā)育經(jīng)過中具有重要作用，且主要起抑制性作用[9-11].研究結(jié)果表明BMP4基因是影響皮膚和毛囊發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵候選功能基因[12].它也是TGF-超家族中的一員[12],TGF-超家族由一大類具有共同構(gòu)造特征的細(xì)胞因子組成，在物質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖、分化、黏附和凋亡及生物各種組織器官生長(zhǎng)發(fā)育中都發(fā)揮著極其重要的作用[8,13].綜合生物信息學(xué)軟件分析得出綿羊BMP4的各種生物學(xué)特性及科學(xué)研究已經(jīng)得出的BMP4性質(zhì)能夠?yàn)橐院笤诳蒲袑?shí)踐中深切進(jìn)入研究BMP4功能提供根據(jù)和方向?！緢D略】以下為參考文獻(xiàn)：[1]HubbardMJ.Functionalproteomics:Thegoalpostsaremoving[J].Proteomics,2002,2〔9〕:1069-1078.[2]程博涵，冷麗