厭氧菌的培養(yǎng)方法

物理方法包括遮斷空氣法、煮沸法、真空法、空氣置換法、氣體噴射法或轉(zhuǎn)管法等化學(xué)方法包括焦性沒(méi)食子酸法、鐵絲絨法、保險(xiǎn)粉法等生物學(xué)方法包括與需氧菌共生好氧法、燕麥發(fā)芽法等混合法包括厭氧罐（袋）法、厭氧手套箱法或厭氧室法、空氣置換鐵絲絨法、空氣置換鈀粒法等。第1頁(yè)/共30頁(yè)第一頁(yè)，共31頁(yè)。1液體培養(yǎng)基的厭氧培養(yǎng)法培養(yǎng)基煮沸：驅(qū)氣后置流水中急速冷卻添加還原劑：

0.03～0.05％L-鹽酸半胱氨酸

0.01～0.02％硫乙醇鈉

0.5～1％葡萄糖

0.1％抗壞血酸其它還原劑添加瓊脂

第2頁(yè)/共30頁(yè)第二頁(yè)，共31頁(yè)。2固體培養(yǎng)基的厭氧培養(yǎng)法厭氧罐法簡(jiǎn)易厭氧罐和厭氧袋法鋼絲絨法焦性沒(méi)食子酸法抽氣換氣厭氧培養(yǎng)法生物好氧厭氧培養(yǎng)法轉(zhuǎn)管技術(shù)和氣體噴射培養(yǎng)法厭氧手套箱法（又稱厭氧室法）第3頁(yè)/共30頁(yè)第三頁(yè)，共31頁(yè)。2.1Gas-pak法第4頁(yè)/共30頁(yè)第四頁(yè)，共31頁(yè)。

原理氣體發(fā)生袋：

檸檬酸和碳酸氫鈉

＋H2OCO2

硼氫化鈉

＋H2OH2

觸媒：鈀粒

H2O

厭氧罐中的O2

厭氧指示劑

11111第5頁(yè)/共30頁(yè)第五頁(yè)，共31頁(yè)。

厭氧指示劑

亞甲基蘭指示劑盧卡斯固體厭氧指示劑布魯氏指示劑第6頁(yè)/共30頁(yè)第六頁(yè)，共31頁(yè)。

亞甲基蘭指示劑6％葡萄糖水溶液20.1N氫氧化鈉水溶液0.10.05％亞甲基蘭水溶液0.2

厭氧無(wú)色殘存有氧氣藍(lán)色

第7頁(yè)/共30頁(yè)第七頁(yè)，共31頁(yè)。盧卡斯固體厭氧指示劑

2％硼砂溶液5毫升9％硫乙醇酸1毫升酚紅溶液0.1～0.2毫升0.02％美蘭溶液10毫升瓊脂1％

厭氧無(wú)色殘存有氧氣藍(lán)色第8頁(yè)/共30頁(yè)第八頁(yè)，共31頁(yè)。

布魯氏指示劑

60％羥甲基氨基甲酯14％葡萄糖10.02％美藍(lán)1

厭氧無(wú)色殘存有氧氣藍(lán)色第9頁(yè)/共30頁(yè)第九頁(yè)，共31頁(yè)。Gas-Pak罐的使用操作程序

平皿培養(yǎng)基裝入平皿架中置厭氧罐內(nèi)；打開內(nèi)蓋居中金屬網(wǎng)袋，裝入觸媒鈀粒；打開錫箔紙袋，取出厭氧指示劑片；剪開氣體發(fā)生袋一角，注入10毫升水，迅速緊閉罐蓋，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約經(jīng)5～10分鐘后，放入?yún)捬踔甘緞┢?。?0頁(yè)/共30頁(yè)第十頁(yè)，共31頁(yè)。2.2.1簡(jiǎn)易厭氧罐

干燥器容內(nèi)徑（厘米）容器1容器2容器3

容積（毫升）硼氫鈉氯化鈷0.2克檸檬酸0.6克

15cm（約2150毫升）或和

0.6克鈀粒1.5克碳酸氫鈉0.7克18cm（約3500毫升）硼氫鈉氯化鈷0.33克檸檬酸1克或和

1克鈀粒2克碳酸氫鈉1.15克第11頁(yè)/共30頁(yè)第十一頁(yè)，共31頁(yè)。2.2.2厭氧袋法

聚碳酸酯（復(fù)合塑料膜）制厭氧袋產(chǎn)氣袋厭氧指示劑觸媒

第12頁(yè)/共30頁(yè)第十二頁(yè)，共31頁(yè)。第13頁(yè)/共30頁(yè)第十三頁(yè)，共31頁(yè)。第14頁(yè)/共30頁(yè)第十四頁(yè)，共31頁(yè)。第15頁(yè)/共30頁(yè)第十五頁(yè)，共31頁(yè)。2.2.3保險(xiǎn)粉的厭氧罐培養(yǎng)法

二亞硫酸鈉（Na2S2O4）碳酸氫鈉無(wú)水硫酸鈉

不用觸媒第16頁(yè)/共30頁(yè)第十六頁(yè)，共31頁(yè)。2.3鋼絲絨法

酸性硫酸銅溶液鋼(鐵)絲絨銅和鐵的絡(luò)合物

O2厭氧指示劑第17頁(yè)/共30頁(yè)第十七頁(yè)，共31頁(yè)。酸性硫酸銅溶液：將自來(lái)水1升加硫酸銅60g，吐溫-8020ml，加熱溶解后，又加入2N的硫酸90ml，最后加水至6升；方法：取5～6g鋼絲絨/L，于1～1.5升酸性硫酸銅溶液浸泡30～60s，鋼絲絨變成紅銅色，擠凈液體置鋁質(zhì)或玻璃容器中，放入?yún)捬豕迌?nèi)。隨后將厭氧指示劑放入，密封厭氧罐，1～4h后可達(dá)厭氧狀態(tài)第18頁(yè)/共30頁(yè)第十八頁(yè)，共31頁(yè)。2.4焦性沒(méi)食子酸法

焦性末食子酸粉末，NaHCO3或NaOH溶液無(wú)菌玻片已接種細(xì)菌的平板倒扣在上面融化的白蠟封邊

第19頁(yè)/共30頁(yè)第十九頁(yè)，共31頁(yè)。2.5抽氣換氣厭氧培養(yǎng)法

玻璃干燥罐混合氣鋼瓶:10％二氧化碳、10％的氫氣、80％的氮?dú)馊ㄩy觸媒:鈀粒/浸泡鋼絲絨/氯化鈷

厭氧指示劑第20頁(yè)/共30頁(yè)第二十頁(yè)，共31頁(yè)。1：厭氧培養(yǎng)罐2：混合氣體（CO2：H2：N2=1：1：8）鋼瓶3：壓力表4：三通閥5：緩沖瓶6：真空泵第21頁(yè)/共30頁(yè)第二十一頁(yè)，共31頁(yè)。2.6生物好氧厭氧培養(yǎng)法

皰肉培養(yǎng)基:

牛肉渣0.5g

牛肉浸液7ml

液面上加蓋3～4mm厚的融化凡士林，滅菌。生物好氧厭氧培養(yǎng)方法

第22頁(yè)/共30頁(yè)第二十二頁(yè)，共31頁(yè)。2.7轉(zhuǎn)管技術(shù)和氣體噴射培養(yǎng)法

360℃鋼瓶進(jìn)氣銅柱除氧氣體

（亮黃色）微量O2H2源

CuO（黑色）接種或移植第23頁(yè)/共30頁(yè)第二十三頁(yè)，共31頁(yè)。2.8厭氧手套箱法又稱厭氧室法第24頁(yè)/共30頁(yè)第二十四頁(yè)，共31頁(yè)。第25頁(yè)/共30頁(yè)第二十五頁(yè)，共31頁(yè)。3厭氧培養(yǎng)方法的選擇亨格特的預(yù)還原滅菌厭氧培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)管技術(shù)、氣體噴射培養(yǎng)法

厭氧手套箱培養(yǎng)法用于要求嚴(yán)格的厭氧培養(yǎng)法的微生態(tài)學(xué)（正常菌群）的研究工作厭氧罐(袋)法結(jié)合其它厭氧培養(yǎng)方法

不適用于對(duì)氧極其敏感的厭氧菌。但是在臨床細(xì)菌的檢驗(yàn)工作中，可以充分使用此法分離感染癥中的厭氧病原菌。

第26頁(yè)/共30頁(yè)第二十六頁(yè)，共31頁(yè)。4厭氧菌的保存4.1繼代保存：以GAM半固體流動(dòng)培養(yǎng)基和TEP半固體培養(yǎng)基作傳代培養(yǎng)保存。用毛細(xì)吸管吸菌進(jìn)行繼代培養(yǎng)，使用白金接種環(huán)移菌接種，可以避免有的菌在操作中接觸空氣或氧化物而死亡。數(shù)周作一次繼代培養(yǎng)。新分離的的菌種，在幾個(gè)月內(nèi)，每3～4星期傳代一次。被保存的菌種，放室溫下暗處。最好是不同菌用不同培養(yǎng)基保存。第27頁(yè)/共30頁(yè)第二十七頁(yè)，共31頁(yè)。

4.2冷凍保存：

20％脫脂牛奶0.5ml分注在帶螺旋塞的玻璃瓶中，經(jīng)110℃、15分鐘高壓滅菌，冷卻后，先用毛細(xì)吸管取半固體高層培養(yǎng)基24～48h生長(zhǎng)茂盛部位的厭氧菌液0.5ml，加入玻璃瓶中，直接置于－80℃冰庫(kù)中保存。

厭氧菌較理想的保存方法是液氮保存法。將108以上濃菌液置脫纖維羊血、脫纖維兔血或羊血牛奶各半的分散劑中，先在干冰中預(yù)凍，然后連容器一起放入液氮罐中。第28頁(yè)/共30頁(yè)第二十八頁(yè)，共31頁(yè)。

謝謝第29頁(yè)/共30頁(yè)第二十九頁(yè)，共31頁(yè)。謝謝