綜述桂花在花色、花香等方面的基因工程研究進(jìn)展,基因工程論文

綜述桂花在花色、花香等方面的基因工程研究進(jìn)展,基因工程論文內(nèi)容摘要：桂花是重要的園林經(jīng)濟(jì)樹(shù)種,加強(qiáng)其快速繁衍和新品種培育對(duì)推進(jìn)桂花產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重大意義.文章根據(jù)近30年的桂花組織培養(yǎng)研究成果,分析了影響桂花胚、莖尖、莖段、葉片及花梗等不同外植體培養(yǎng)的因素,并綜述了桂花在花色、花香等方面的基因工程研究進(jìn)展,以期為桂花的分子育種工作提供參考.本文關(guān)鍵詞語(yǔ)：胚培養(yǎng);莖尖培養(yǎng);莖段培養(yǎng);桂花;AdvancesinTissueCultureandGeneticEngineeringonOsmanthusfragransCHENSiHUANGZhouYANGMengtingPANGJiliangGANJianpingXUJunchiSchoolofLifeandEnvironmentalSciences,HangzhouNormalUniversityKeyLaboratoryofEconomicForestGermplasmImprovementandResourcesComprehensiveUtilization,HubeiCollaborativeInnovationCenterfortheCharacteristicResourcesExploitationofDabieMountains,HuanggangNormalUniversityAbstract：OsmanthusfragransisanimportanteconomicgardentreeinChina.ItisofgreatsignificancethattheresearchofitsrapidpropagationandbreedingarecarriedouttopromotethedevelopmentofO.fragransindustry.AccordingtothetestdataoftissuecultureinO.fragransforrecentthirtyyears,thesuccessfulcultivationfactorsofdifferentexplants,suchasembryo,stemapex,stemsegments,leafandstalkareanalyzed.TheoverviewofrecentadvancesonO.fragransgeneticengineeringinflowercolorandfragranceisprovided,whichisaimedtoprovidereferenceforthemolecularbreedingofO.fragrans.Keyword：embryoculture;stemapexculture;stemsegmentculture;Osmanthusfragrans;桂花(OsmanthusfragransLour.)又名九里香、木犀等,是我們國(guó)家傳統(tǒng)十大名花之一,系木犀科常綠灌木或小喬木,分為金桂、銀桂、丹桂、四季桂和彩葉桂5個(gè)品種群[1].桂花在我們國(guó)家已有2500多年的栽培歷史,為亞熱帶短日照植物,廣泛栽培于長(zhǎng)江流域及其以南地區(qū),并且構(gòu)成了四川、浙江、廣西、湖南、湖北、安徽等重點(diǎn)產(chǎn)區(qū)[2].桂花是香花植物中最具觀賞和實(shí)用價(jià)值的植物,不僅在園林和庭院的綠化、美化及香化上具有特殊地位,而且能夠用來(lái)提取香精,制作桂花酒、桂花糕等,果實(shí)能夠榨油,桂木亦可制作家具,能夠講渾身是寶[3].自進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái),我們國(guó)家桂花研究在資源、品種、栽培、繁衍、育種、發(fā)育、花香、切花、文化等各個(gè)領(lǐng)域全面展開(kāi),且獲得了明顯成果,再加上2004年我們國(guó)家獲得木犀屬栽培植物國(guó)際登錄權(quán)威,更是極大推進(jìn)了我們國(guó)家桂花產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展[4].本文綜述了桂花組織培養(yǎng)和基因工程的研究現(xiàn)在狀況及其存在的問(wèn)題,以期為后續(xù)的桂花分子育種等研究工作提供參考.1桂花組織培養(yǎng)研究進(jìn)展木本植物的組織培養(yǎng)再生途徑能夠分為兩類(lèi)[5]:一是器官發(fā)生,包括外植體直接分化成器官的直接發(fā)生和外植體先脫分化構(gòu)成愈傷組織再分化成器官的間接發(fā)生;二是胚狀體發(fā)生,指外植體根據(jù)胚胎發(fā)生方式構(gòu)成再生植株.迄今關(guān)于桂花的組織培養(yǎng)已經(jīng)積累了不少經(jīng)歷體驗(yàn),本文就桂花胚、莖尖和莖段、葉片和花梗的培養(yǎng)進(jìn)行綜述.為方便查閱,本課題組將已收集到的資料編成名錄(表1),總結(jié)了桂花組培外植體的取材部位、品種、初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基及再生方式等.表1桂花組織培養(yǎng)名錄Tab.1DirectoryoftissuecultureonO.fragrans注:1.O1為器官直接發(fā)生途徑,O2為器官間接發(fā)生途徑,E為胚狀體途徑.2.培養(yǎng)基B5+6-BA1.0+GA3.0表示B5+6-BA1.0mg/L+GA3.0mg/L,以此類(lèi)推.表1桂花組織培養(yǎng)名錄Tab.1DirectoryoftissuecultureonO.fragrans注:1.O1為器官直接發(fā)生途徑,O2為器官間接發(fā)生途徑,E為胚狀體途徑.2.培養(yǎng)基B5+6-BA1.0+GA3.0表示B5+6-BA1.0mg/L+GA3.0mg/L,以此類(lèi)推.1.1桂花胚培養(yǎng)胚的發(fā)育時(shí)期和取材時(shí)間是影響其組培成功的關(guān)鍵因素之一.桂花胚發(fā)育時(shí)期為:當(dāng)年12月上旬,原胚發(fā)育至球形胚;12月下旬至次年1月上旬,發(fā)育至心形胚;1月下旬至2月上旬,發(fā)育至魚(yú)雷狀胚;2月下旬至3月上、中旬,幼胚的發(fā)育基本完成,構(gòu)成成熟胚[33].袁王俊[34]對(duì)5個(gè)時(shí)期的桂花胚(球形胚、魚(yú)雷胚、胚乳尚未硬化、胚乳硬化、果皮發(fā)紫)進(jìn)行離體培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)桂花胚適宜的取材時(shí)間是胚乳完全硬化到果實(shí)完全成熟之間,即3月中上旬,此時(shí)胚生理上雖未成熟,但形態(tài)上已經(jīng)成熟,呈乳白色,長(zhǎng)5mm左右,子葉明顯.胚在接種前經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)念A(yù)處理,如低溫、枯燥、光照等,能夠增加萌發(fā)率和出愈率[35].梁茂廠[12]發(fā)現(xiàn)種子4℃冷藏處理210d能有效打破種胚的自然休眠,促進(jìn)種子提早萌發(fā).鑒于桂花種子有一層堅(jiān)硬的內(nèi)果皮包被,種胚極少受外界細(xì)菌的污染,所以多數(shù)研究對(duì)去掉外果皮的種子采用的滅菌方式為:75%酒精浸泡30~60s后,0.1%升汞溶液消毒3~6min.這樣既能降低污染率、褐化率,又能保證外植體的活力.誘導(dǎo)桂花胚離體培養(yǎng)構(gòu)成組培苗常采用器官直接再生和間接再生兩種方式,如表1所示.袁王俊[34]比擬MS、B5和DCR3種培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果時(shí),發(fā)現(xiàn)胚在B5中的生長(zhǎng)狀況更好.韓瑞超[31]則發(fā)現(xiàn)桂花幼胚在MS和B5這兩種培養(yǎng)基上的萌發(fā)率不存在顯著性差異,但胚在MS中的長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于B5.劉友全等[8]也發(fā)現(xiàn)相較于B5和LMc,MS更有利于促進(jìn)幼胚苗正常生長(zhǎng).就培養(yǎng)基而言,MS和B5中都含有較高濃度的無(wú)機(jī)鹽,只是B5中銨鹽的濃度較低,但兩者都能夠知足幼胚萌發(fā)初期對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的需求.至于培養(yǎng)基中的激素配比研究,即細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素的相對(duì)濃度設(shè)置,均圍繞Skoog和Miller的激素平衡學(xué)講展開(kāi).桂花組織培養(yǎng)中,常用的細(xì)胞分裂素有6-BA(6-benzylaminopurine,6-芐氨基嘌呤)、KT(kinetin,沖動(dòng)素)、ZT(zeatin,玉米素)和TDZ(thidiazuron,N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲),生長(zhǎng)素有NAA(-naphthaleneaceticacid,萘乙酸)、2,4-D(2,4-dichlorophenoxyaceticacid,2,4-二氯苯氧乙酸)和IBA(indole-3-butyricacid,吲哚丁酸).在桂花胚直接分化的初代培養(yǎng)中,細(xì)胞分裂素是主要因素,由于胚內(nèi)可能存在某種抑制物,例如ABA,它會(huì)導(dǎo)致種子休眠,而6-BA能夠促進(jìn)ABA的降解,解除種子的休眠,促使胚提早萌發(fā)[11,36],或者配合使用一定濃度的GA也能到達(dá)目的[10];生長(zhǎng)素的作用是次要的,鄧?yán)鑋9]所做的6-BA和NAA穿插因子試驗(yàn)顯示,在基本培養(yǎng)基中只施加1.5mg/L6-BA最有利于胚的啟動(dòng).其他研究者也以為,1.0~2.0mg/L的6-BA有利于胚的萌發(fā)[8].而在誘導(dǎo)桂花胚脫分化構(gòu)成愈傷組織時(shí),生長(zhǎng)素是必不可少的,不過(guò)應(yīng)控制在0.1~0.5mg/L.李球紅等[14]發(fā)現(xiàn)胚在1/2MS+0.5mg/LTDZ+0.1mg/LNAA培養(yǎng)基上,愈傷化率可達(dá)100%,而且構(gòu)成的愈傷在這里培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)多代后能分化出叢生芽.不同品種的桂花在一樣的培養(yǎng)基上,其生長(zhǎng)狀況和芽分化也是不同的,講明外植體基因型的差異也會(huì)影響培養(yǎng)效果.至于胚幼苗的伸長(zhǎng)生長(zhǎng),多使用MS(B5)+2.0mg/LGA[8,9].在生根方面,研究者的結(jié)果比擬一致,培養(yǎng)基為1/2MS(B5)+2~3mg/LNAA+0~0.05mg/L6-BA[6,7,8,9,10,11,12].另外,切掉部分胚根有利于側(cè)根發(fā)育,根數(shù)增加[10].通過(guò)胚狀體途徑誘導(dǎo)桂花胚產(chǎn)生胚性愈傷組織,然后生成植株的研究則比擬少,當(dāng)前國(guó)內(nèi)外僅見(jiàn)3篇報(bào)道[15,16,17].綜合三者的研究發(fā)現(xiàn),金桂合子胚的子葉端是誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的良好外植體,MS培養(yǎng)基比WPM、B5更有助于胚性愈傷組織構(gòu)成,初代培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D或者M(jìn)S+0.5mg/LKT+1.5mg/L2,4-D時(shí)都能使胚性愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)83%以上,在繼代培養(yǎng)中則以不添加任何植物激素的MS培養(yǎng)基更有利于體細(xì)胞胚的構(gòu)成和發(fā)育.1.2桂花莖尖和莖段的組織培養(yǎng)袁王俊等[20]比擬了休眠芽、萌發(fā)芽和當(dāng)年生幼枝三者的莖尖組培差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn):正在萌發(fā)芽和尚未停止生長(zhǎng)的幼枝頂芽是較好的莖尖取材材料.休眠芽由于長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中,易感染病菌,所需消毒時(shí)間較長(zhǎng),且存活率較低,不宜作為莖尖組培材料.莖尖采用的消毒方式和胚類(lèi)似,萌發(fā)芽以升汞處理5min為好,存活率可達(dá)94.1%[20];嫩枝以不經(jīng)過(guò)乙醇處理、升汞直接消毒2.5min最佳,存活率可達(dá)95.6%[18].在桂花莖尖的初代培養(yǎng)中,袁王俊[34]發(fā)現(xiàn)適宜的基本培養(yǎng)基是B5,而以MS為培養(yǎng)基時(shí),無(wú)論是冬季休眠芽還是萌發(fā)芽都不能萌發(fā),且DCR的培養(yǎng)效果也不佳.該研究還確定了休眠芽、萌發(fā)芽和幼枝頂芽離體啟動(dòng)培養(yǎng)所需的6-BA濃度,隨著芽在植株上的萌發(fā)和抽枝,所需要的6-BA濃度逐步降低,除此之外三者的萌發(fā)能力表現(xiàn)為萌發(fā)芽幼枝頂芽休眠芽.組織培養(yǎng)中基因型的差異會(huì)影響再生能力是一種常見(jiàn)現(xiàn)象,表現(xiàn)為種間、品種間的再生能力有較大差異,因而在選擇激素配比時(shí)也要考慮這一因素.蔡新玲[29]以金桂、銀桂、丹桂、四季桂4種桂花品種群的莖尖為試材,分析比擬了基本培養(yǎng)基(B5、LMc)和不同濃度6-BA及NAA對(duì)莖尖叢生芽誘導(dǎo)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),金桂的最佳培養(yǎng)基為B5+2.0mg/L6-BA+0.12mg/LNAA,銀桂為B5+7.0mg/L6-BA+0.12mg/LNAA,丹桂為B5+7.0mg/L6-BA,四季桂僅分化出少量叢生芽;品種群之間的萌芽率優(yōu)勢(shì)差異表現(xiàn)為金桂銀桂丹桂四季桂.莖段培養(yǎng)的取材部位主要是帶腋芽的新梢莖段,宋會(huì)訪[7]探究了不同取材時(shí)間(2月下旬、3月上旬和3月下旬)對(duì)桂花新梢初代培養(yǎng)的影響,發(fā)現(xiàn)最佳的取材時(shí)間為2月下旬,而3月下旬不合適桂花莖段培養(yǎng)取材,取材的污染率、褐變率都比擬高.這一結(jié)果也反映了桂花在其生長(zhǎng)開(kāi)場(chǎng)的季節(jié)取材較好,在生長(zhǎng)期或已進(jìn)入休眠期取材則因外植體在培養(yǎng)中污染率高、褐化率高和反響遲鈍而不能培養(yǎng)成功.桂花莖段在空氣中由于暴露時(shí)間較長(zhǎng)且具有皮孔易含內(nèi)生菌,所需的升汞消毒時(shí)間較長(zhǎng),一般10min左右[21,22,23,24,25,26].梁茂廠[12]比擬了MS、B5和WPM對(duì)莖段萌發(fā)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)B5培養(yǎng)效果最好.而呂志鵬[25]的研究結(jié)果則表示清楚MS相較于B5和改進(jìn)的MS而言更有利于莖段不定芽誘導(dǎo)和愈傷誘導(dǎo).不過(guò)歸納來(lái)看,莖段初代培養(yǎng)多項(xiàng)選擇擇MS.宋會(huì)訪等[24]以金桂為試材,探究發(fā)現(xiàn)KT誘芽效果比TDZ好,新梢莖段在LMc+8.0mg/LKT+0.1mg/LNAA的培養(yǎng)基上萌芽快且腋芽長(zhǎng)而粗壯,而TDZ誘導(dǎo)的莖段切口處產(chǎn)生大量的愈傷,抑制了芽的萌發(fā),因而TDZ更合適莖段愈傷組織誘導(dǎo).1.3桂花葉片和花梗的組織培養(yǎng)桂花葉片和花梗的組織培養(yǎng)不同于胚、莖尖和莖段,只能通過(guò)愈傷誘導(dǎo)再分化芽.胡甜甜等[28]以桂花幼嫩花梗和葉片為外植體,發(fā)現(xiàn)花梗最佳消毒方式為5%NaClO消毒3min,葉片最佳消毒方式為0.1%HgCl2消毒5min.在葉片取材方面,以新生幼嫩的葉片為宜.另外,李林[30]]發(fā)如今同一激素配比的培養(yǎng)基中,同一葉片不同位置的出愈情況是一樣的,并沒(méi)有由于位置不同而產(chǎn)生不同的分化.葉片的腹面朝上和反面朝上這兩種接種方式對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)也沒(méi)有顯著影響[31]].蔡新玲[29]以丹桂葉片為試材探究發(fā)現(xiàn),葉片在B5培養(yǎng)基上出愈率最高,而在MS和LMc兩種培養(yǎng)基上未誘導(dǎo)出愈傷.梁茂廠[12]也比擬了MS、B5和WPM對(duì)金桂葉片愈傷的誘導(dǎo),結(jié)果表示清楚B5和WPM是較適宜培養(yǎng)基.在激素配置上,詳細(xì)用量要考慮到組織內(nèi)源激素和外源激素效應(yīng)的總和.蔡新玲[29]發(fā)現(xiàn)合適金桂葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為B5+1.0mg/L6-BA+0.6mg/L2,4-D,出愈率可達(dá)92%;梁茂廠[12]卻以為金桂葉片最適誘導(dǎo)配方為B5+1.5mg/L6-BA+0.12mg/L2,4-D,出愈率可達(dá)100%.二者6-BA和2,4-D相對(duì)用量的差異,是源于研究時(shí)所選取的品系材料、激素濃度梯度以及試驗(yàn)方式方法等多因素的差異,講明任何一種材料組織培養(yǎng)的最適配方并不是絕對(duì)的,詳細(xì)試驗(yàn)應(yīng)用時(shí)需考慮相對(duì)條件.彭盡暉等[32]以四季桂幼嫩花梗為試材,培養(yǎng)在MS+1.5mg/L6-BA+0.1mg/L2,4-D上,出愈率可達(dá)85.17%.該研究還發(fā)現(xiàn),繼代培養(yǎng)中采用2,4-D,愈傷增殖率雖高,但易使細(xì)胞老化,喪失活力.韓瑞超[31]也證明了2,4-D不利于桂花幼葉愈傷的生長(zhǎng)與增殖.當(dāng)前還沒(méi)有關(guān)于桂花葉片、花梗及莖段愈傷再分化出芽的報(bào)道,對(duì)愈傷的研究停留在繼代增殖階段.不過(guò),王珍華等[27]以大花金桂的子葉為外植體,在1/2MS+0.5mg/LTDZ+0.1mg/LNAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)多代后成功實(shí)現(xiàn)了桂花愈傷組織分化成苗.這反映了不同桂花組織誘導(dǎo)的愈傷存在某些特性,需要擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)因素范圍,使用更多外源激素和其他添加物,探尋求索芽點(diǎn)構(gòu)成的條件.2桂花基因工程研究進(jìn)展基因工程操作包括上游的基因克隆和下游的遺傳轉(zhuǎn)化,通過(guò)將某些功能基因?qū)胫参矬w內(nèi)使其性狀穩(wěn)定表示出是當(dāng)代植物育種中的一種重要手段.當(dāng)前桂花基因工程研究多集中在基因克隆方面,而鮮有桂花遺傳轉(zhuǎn)化的報(bào)道.2.1桂花基因的克隆NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)收錄的桂花基因序列主要與花色和花香相關(guān).桂花花色主要由類(lèi)黃酮和類(lèi)胡蘿卜素兩類(lèi)物質(zhì)決定,當(dāng)前這兩者的生物合成途徑解析得較為透徹,牽涉多個(gè)代謝步驟、多種酶催化,以及與之相關(guān)的基因調(diào)控.桂花類(lèi)黃酮生物合成代謝途徑中OfPAL、Of4CL、OfC4H、OfCHS、OfCHI、OfDFR、OfANS和OfMYB1等關(guān)鍵構(gòu)造基因[37,38,39,40,41,42,43],以及類(lèi)胡蘿卜素生物合成代謝途徑中OfCCD1、OfCCD4、OfPSY、OfPDS、OfZDS和OfZ-ISO等關(guān)鍵構(gòu)造基因[44,45,46,47]相繼被克隆和研究.通過(guò)分析桂花花色素構(gòu)造基因的作用特性,就能夠借助反義RNA技術(shù)、外源基因插入、核酶抑制及共抑制作用等方式方法[48]順勢(shì)改造桂花花色,培育出更多更有觀賞價(jià)值的新品種.植物花香物質(zhì)主要分為3大類(lèi):萜類(lèi)、苯基/苯丙烷類(lèi)、脂肪酸衍生物.萜類(lèi)化合物是植物花香物質(zhì)中最大的類(lèi)群,也是很多植物香味物質(zhì)的主要成分[49].在桂花中,一些與萜類(lèi)化合物合成相關(guān)的基因已被成功克隆,如OfTPS、OfDXS、OfGES、OfADH、OfDXPS、OfAACT和OfLIS等[50,51,52,53,54,55].這些關(guān)鍵基因的分離,為桂花香氣品質(zhì)遺傳改進(jìn)提供了可能.從分子水平對(duì)植物花香進(jìn)行改進(jìn)主要有兩種方式方法:一是引入花香相關(guān)的外源基因;二是調(diào)控內(nèi)源相關(guān)基因的表示出.但是此經(jīng)過(guò)需要注意:一是從轉(zhuǎn)化植株中產(chǎn)生的芳香揮發(fā)物可能被修飾成非揮發(fā)性的物質(zhì);二是在轉(zhuǎn)化植株中缺少適宜的底物產(chǎn)生相應(yīng)芳香揮發(fā)物;三是即使在轉(zhuǎn)化植株中產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì),可以能缺乏以被人類(lèi)的嗅覺(jué)所感悟[56].2.2桂花遺傳轉(zhuǎn)化的研究木本植物轉(zhuǎn)基因操作中應(yīng)用比擬成熟的技術(shù)主要是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,該技術(shù)已經(jīng)在楊樹(shù)、番木瓜、蘋(píng)果等多種木本植物中得到成功的應(yīng)用[57].除此之外也有用基因槍法、電擊法和PEG(polyethyleneglycol)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化.固然有研究者對(duì)桂花轉(zhuǎn)基因進(jìn)行了試驗(yàn),但當(dāng)前未見(jiàn)轉(zhuǎn)化成功的報(bào)道.本課題組在建立桂花遺傳轉(zhuǎn)化體系方面做過(guò)不少?lài)L試.李球紅[58]構(gòu)建了FYF(FOREVERYOUNGFLOWER)的過(guò)表示出載體,擬將其轉(zhuǎn)入桂花中以得到花期延長(zhǎng)的新品種.試驗(yàn)采用綠梗籽銀桂、廬州黃籽銀桂和蓮籽丹桂的幼胚,以及大花金桂子葉切塊和天香臺(tái)閣花芽的愈傷作為轉(zhuǎn)化受體材料,利用超聲波輔助的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化,固然得到了抗性愈傷,但愈傷褐化率較高且基本不分化.因而,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)桂花進(jìn)行品種改進(jìn)任重道遠(yuǎn),外植體的取材、培養(yǎng)基的激素配比、轉(zhuǎn)化方式方法的選取以及褐化的控制等條件仍需進(jìn)一步探尋求索.3瞻望桂花在園林綠化上雖應(yīng)用廣泛,具有眾多優(yōu)點(diǎn),但也存在些許缺乏.例如,桂花單朵花期極短,僅7d左右,使其美化、香化功能遭到了限制;其次香氣馥郁的桂花品種主要是金桂和銀桂這兩類(lèi)秋桂品種群,四季桂除了天香臺(tái)閣等品種外鮮有香氣濃郁的,也限制了其香化的功用;桂花的抗寒能力弱,長(zhǎng)江以北難以栽培.因而,怎樣培育出花期長(zhǎng)、抗寒能力強(qiáng)的桂花新品種,是今后桂花育種中的長(zhǎng)期課題.建立成熟的遺傳轉(zhuǎn)化體系的第一步是建立高效的離體快繁體系.桂花組織培養(yǎng)研究雖獲得了不少進(jìn)展,但仍存在外植體增殖率低、胚性愈傷誘導(dǎo)分化體系不成熟等問(wèn)題,因而仍需加強(qiáng)桂花組織培養(yǎng)研究,為桂花分子育種研究奠定基礎(chǔ).以下為參考文獻(xiàn)[1]向民,段一凡,向其柏.木犀屬品種國(guó)際登錄中心年報(bào)(1)彩葉桂品種群的建立[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2020,38(1):2.[2]朱文江.我們國(guó)家桂花的地理分布及其開(kāi)花之生態(tài)環(huán)境的討論[J].上海農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1987,5(3):243-250.[3]向其柏,劉玉蓮.中國(guó)桂花品種圖志[M].杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社,2008.[4]葉小梅,梁如煜,余義勛.桂花幾個(gè)方面的研究進(jìn)展[J].廣東林業(yè)科技,2007,23(2):77-80.[5]許智宏.經(jīng)濟(jì)植物組織培養(yǎng)[M].北京:科學(xué)出版社,1988.[6]秦新民.桂花成熟胚的組織培養(yǎng)[J].植物雜志,1987(5):3.[7]宋會(huì)訪.桂花組織培養(yǎng)技術(shù)體系的研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.[8]劉友全,梁茂廠,陳躍華.桂花離體胚的組織培養(yǎng)[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2008,26(2):12-16.[9]鄧?yán)?早花籽金桂離體胚的組培快繁技術(shù)研究[D].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2018.[10]馬燕,韓瑞超,臧德奎,等.桂花幼胚的離體培養(yǎng)及生根誘導(dǎo)[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2020,45(3):7-10.[11]袁王俊,董美芳,尚富德.桂花胚的離體培養(yǎng)[J].園藝學(xué)報(bào),2005,32(6):1136-1139.[12]梁茂廠.桂花組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的研究[D].長(zhǎng)沙:中南林業(yè)科技大學(xué),2008.[13]劉萍,袁王俊.桂花愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(34):14889-14890.[14]李球紅,宋華東,周文怡,等.桂花幼胚離體培養(yǎng)構(gòu)成叢生苗[J].杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2021,14(5):507-510.[15]鄒晶晶.桂花未成熟合子胚誘導(dǎo)體細(xì)胞胚再生[C]//中國(guó)園藝學(xué)會(huì)觀賞園藝專(zhuān)業(yè)委員會(huì).中國(guó)觀賞園藝研究進(jìn)展2021.廈門(mén):中國(guó)園藝學(xué)會(huì)觀賞園藝專(zhuān)業(yè)委員會(huì),2021:238-242.[16]袁斌.金桂體細(xì)胞胚發(fā)生的研究[C]//中國(guó)園藝學(xué)會(huì)觀賞園藝專(zhuān)業(yè)委員會(huì).中國(guó)觀賞園藝研究進(jìn)展2021.廈門(mén):中國(guó)園藝學(xué)會(huì)觀賞園藝專(zhuān)業(yè)委員會(huì),2021:579-585.[17]ZOUJJ,GAOW,CAIX,etal.SomaticembryogenesisandplantregenerationinOsmanthusfragransLour.[J].PropagationofOrnamentalPlants,2020,14(1):32-39.[18]李林,韓遠(yuǎn)記,袁王俊,等.桂花組織培養(yǎng)快繁體系的建立[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2020,43(6):667-671.[19]蔡新玲,胡蕙露,傅松玲.四種桂花莖尖培養(yǎng)試驗(yàn)初報(bào)[J].浙江林業(yè)科技,2006,26(5):24-27.[20]袁王俊,張維瑞,尚富德.桂花莖尖離體培養(yǎng)體系的建立[J].西北植物學(xué)報(bào),2008,28(2):244-248.[21]秦新民.桂花的組織培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊,1988(3):55.[22]王彩云,白吉?jiǎng)?楊玉萍.桂花的組織培養(yǎng)[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,23(S2):24-25.[23]何鋼,燕亞飛,劉賢桂,等.金獅桂花叢生芽的誘導(dǎo)[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2007,27(4):28-32.[24]宋會(huì)訪,葛紅,周媛,等.桂花離體培養(yǎng)與快速繁衍技術(shù)的初步研究[J].園藝學(xué)報(bào),2005,32(4):738-740.[25]呂志鵬.金桂的組織培養(yǎng)與快速繁衍[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2020,18(8):27.[26]張麗霞,王毅彰.桂花的離體快繁技術(shù)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2020,41(3):42-43.[27]王珍華,龐基良,陳益紅,等.桂花子葉切塊培養(yǎng)再生苗的研究[J].北方園藝,2020(9):126-128.[28]胡甜甜,王亞莉,楊秀蓮,等.桂花花梗與葉片的愈傷組織誘導(dǎo)研究[J].北方園藝,2021(19):95-101.[29]蔡新玲.不同桂花品種群組織培養(yǎng)的研究[D].合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.[30]李林.桂花無(wú)性繁衍技術(shù)研究[D].開(kāi)封:河南大學(xué),2020.[31]韓瑞超.桂花幼胚培養(yǎng)與愈傷組織誘導(dǎo)及分化[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2020.[32]彭盡暉,呂長(zhǎng)平,周晨.四季桂愈傷組織誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,29(2):131-133.[33]楊琴軍,黃燕文,李和平.桂花胚和胚乳發(fā)育經(jīng)過(guò)的研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,22(2):175-178.[34]袁王俊.桂花(OsmanthusfragransLour.)組織培養(yǎng)的研究[D].開(kāi)封:河南大學(xué),2005.[35]左靜靜,劉少翔,閆貴云,等.小麥幼胚組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2018,26(19):81-87.[36]趙淑清,郭劍波,常留印.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)離體培養(yǎng)早熟杏胚休眠的破除[J].果樹(shù)學(xué)報(bào),2001,18(2):84-86.[37]張威威,許鋒,張芙蓉,等.桂花苯丙氨酸解氨酶基因的克隆與序列分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2018,25(5):56-60.[38]母洪娜,孫陶澤,徐晨,等.桂花(OsmanthusfragransLour.)4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)基因克隆與表示出分析[J].分子植物育種,2021,14(3):536-541.[39]曾祥玲,鄭日如,羅靖,等.桂花C4H基因的克隆與表示出特性分析[J].園藝學(xué)報(bào),2021,43(3):525-537.[40]徐秀榮,馬燕,臧德奎.桂花查耳酮合酶chs基因的克隆及序列分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2021,32(1):118-124.[41]張水明,涂佳麗,阿不都熱扎克依沙克,等.桂花查爾酮異構(gòu)酶OfCHI基因的克隆與表示出分析[J].西北植物學(xué)報(bào),2021,36(9):1728-1734.[42]徐秀榮.桂花CHS、DFR基因全長(zhǎng)克隆、表示出分析及表示出載體構(gòu)建[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2021.[43]HANYJ,CHENWC,YANGFB,etal.cDNA-AFLPanalysison2osmanthusfragranscultivarswithdifferentflowercolorandmolecularcharacteristicsofOfMYB1gene[J].Trees,2021,29(3):931-940.[44]BALDERMANNS,KATOM,KUROSAWAM,etal.Functionalcharacterizationofacarotenoidcleavagedioxygenase1anditsrelationtothecarotenoidaccumulationandvolatileemissionduringthefloraldevelopmentofOsmanthusfragransLour.[J].JournalofExperimentalBotany,2018,61(11):2967-2977.[45]HUANGFC,MOLNRP,SCHWABW.Cloningandfunctionalcharacterizationofcarotenoidcleavagedioxygenase4genes[J].JournalofExperimentalBotany,2018,60(11):3011-3022.[46]HANYJ,WANGXH,CHENWC,etal.Di