生物學(xué)中第三代測序技術(shù)的原理與改革創(chuàng)新,生物工程論文

生物學(xué)中第三代測序技術(shù)的原理與改革創(chuàng)新,生物工程論文摘要：核酸測序技術(shù)的誕生是生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有里程碑意義的重大突破。以第二代測序?yàn)橹е暮怂釡y序技術(shù)在歷經(jīng)十余年的發(fā)展與積淀之后，仍在各方面的應(yīng)用中面臨很多挑戰(zhàn)。近年來，以第三代測序技術(shù)為核心的核酸檢測與診斷革新已在生物醫(yī)藥領(lǐng)域嶄露頭角。第三代測序技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)兆堿基級別超長測序以及無擴(kuò)增基因組修飾檢測，這一系列優(yōu)勢賦予其在傳染性疾病的及時(shí)診斷、精準(zhǔn)醫(yī)療、藥物研發(fā)等領(lǐng)域廣泛的應(yīng)用前景。第三代測序技術(shù)能夠高效完成病原體的全基因組組裝，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)病原微生物的全面檢測和準(zhǔn)確鑒定，此特點(diǎn)對于應(yīng)對以新型冠狀病毒爆發(fā)為代表的緊急公共衛(wèi)生事件至關(guān)重要。介紹第三代測序技術(shù)的發(fā)展、原理及其獨(dú)特優(yōu)勢，重點(diǎn)闡述第三代測序技術(shù)在病原微生物檢測以及精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用以及其在將來生物學(xué)領(lǐng)域的價(jià)值。本文關(guān)鍵詞語：第三代測序技術(shù);病原體檢測;分子診斷;精準(zhǔn)醫(yī)療;2005年，羅氏推出了第一個商業(yè)化的二代測序平臺454測序平臺[1]，結(jié)束了以Sanger測序?yàn)橹鲗?dǎo)的第一代測序時(shí)代[2]。2008年，Solexa/Illumina測序平臺和AppliedBiosystemsSOLiD測序平臺緊隨其后進(jìn)入市場[3,4]。與Sanger測序相比，二代測序〔second-generationsequencing,SGS〕技術(shù)能夠在保證低成本的情況下，幾天之內(nèi)生成數(shù)十萬至數(shù)十億個25～800bp的測序序列數(shù)據(jù)。憑借高通量的優(yōu)勢，SGS已經(jīng)占據(jù)了大部分的測序市場。但SGS無法實(shí)現(xiàn)對DNA準(zhǔn)確、全面的直接測序，對天然DNA測序前處理的每一個步驟都可能增加偏好和誤差，進(jìn)而導(dǎo)致測序結(jié)果出現(xiàn)錯誤的風(fēng)險(xiǎn)；樣本前期需要經(jīng)過PCR進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，這一經(jīng)過中GC含量較高的區(qū)域無法利用PCR實(shí)現(xiàn)高效擴(kuò)增，加之測序序列讀長仍較短，這一系列缺乏導(dǎo)致其無法實(shí)現(xiàn)全基因組覆蓋。除此之外，固然短讀長〔shortreads〕能夠較為準(zhǔn)確地檢測單核苷酸變異〔single-nucleotidevariations,SNVs〕，但難以檢測和表征構(gòu)造變異〔structuralvariations,SVs)[5]。為了解決一代和二代測序技術(shù)的局限性，高通量、長讀長且能實(shí)現(xiàn)無擴(kuò)增DNA直接測序的第三代測序〔thirdgenerationsequencing,TGS〕技術(shù)逐步在測序領(lǐng)域嶄露頭角。TGS能夠?qū)崿F(xiàn)對DNA或RNA的直接測序，減少前期樣本的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增步驟，克制讀長限制，實(shí)現(xiàn)全長測序。同時(shí)，TGS能夠檢測例如DNA的甲基化等基因組修飾。測序技術(shù)發(fā)展到如今，市場上應(yīng)用的第三代測序技術(shù)主要是太平洋生物科學(xué)公司〔PacificBiosciences,PacBio〕的單分子實(shí)時(shí)〔single-moleculereal-time,SMRT〕測序技術(shù)和牛津納米孔技術(shù)公司〔OxfordNanoporeTechnologies,ONT〕的單分子納米孔測序技術(shù)。本文將以TGS技術(shù)的發(fā)展和原理為出發(fā)點(diǎn)，闡述當(dāng)前擁有眾多優(yōu)勢的TGS在生物學(xué)領(lǐng)域的革新。1、第三代測序技術(shù)的原理1.1、單分子實(shí)時(shí)測序如此圖1所示，SMRT測序技術(shù)需要使用雙鏈DNA(double-strandDNA,dsDNA〕制備文庫[6]：將發(fā)夾構(gòu)造的銜接子連接到DNA分子的兩端，構(gòu)成SMRTbell的環(huán)化測序模板[7]。將測序文庫加載到SMRT測序單元中，該單元包含納米級觀察室零形式波導(dǎo)〔ZeroModeWaveguides,ZMW)[8]。每個ZMW中的聚合酶引導(dǎo)熒光標(biāo)記的核苷酸合成待測DNA的互補(bǔ)鏈，ZMW底部的熒光監(jiān)測裝置實(shí)時(shí)記錄合成時(shí)的熒光信號，這些信號生成的測序數(shù)據(jù)稱為連續(xù)長讀〔continuouslongreads,CLR)[8]。在測序經(jīng)過中能夠?qū)崟r(shí)檢測核苷酸的摻入率，核苷酸摻入之間的時(shí)間稱為脈沖間持續(xù)時(shí)間〔interpulseduration,IPD〕，這段時(shí)間的長短隨DNA表觀遺傳修飾的出現(xiàn)發(fā)生變化[9]。在測序經(jīng)過中，聚合酶每次持有大約十二個核苷酸，因而單個核苷酸表觀遺傳水平的變化會影響周圍核苷酸的摻入率，這種變化會構(gòu)成指紋[10]。不同的指紋對應(yīng)不同的表觀遺傳修飾，比方，m6A、m4C和m5C。2018年初，PacBio發(fā)布了利用SMRT技術(shù)發(fā)明的PacBioRS測序儀，該系統(tǒng)得益于天然高聚合酶的持續(xù)合成能力，起初的平均讀長相對較短〔1.5kb〕，平均錯誤率較高〔13%)[11]。隨著技術(shù)的發(fā)展，新測序儀Sequel的平均讀長增加了10倍以上，通量增加了100倍；得益于環(huán)狀模版的構(gòu)建和聚合酶合成能力的加強(qiáng)，如今能夠?qū)崿F(xiàn)對1～2kb分子的屢次測序，提高了測序準(zhǔn)確度。Sequel運(yùn)行時(shí)間短且讀長沒有遭到太多限制，在基因組較短的病原體分子檢測方面具備優(yōu)勢[12,13]。該系統(tǒng)還可用于直接鑒定甲基化的堿基，研究核糖體轉(zhuǎn)移RNA動力學(xué)，以及進(jìn)行RNA的直接測序[9,14]。圖1第三代測序技術(shù)原理1.2、納米孔測序技術(shù)利用納米孔對單鏈DNA或RNA分子進(jìn)行測序的概念起源于20世紀(jì)80年代末[14]。將測序銜接子和運(yùn)動蛋白附著到待測DNA鏈上，在人工電阻膜上構(gòu)建生物納米孔并在膜上施加電壓，運(yùn)動蛋白牽動DNA單鏈的單個堿基依次通過納米孔。不同的堿基穿過孔時(shí)發(fā)生的電流偏轉(zhuǎn)不同，連續(xù)一樣的堿基會使整個孔的電流變化持續(xù)時(shí)間變長，以圖1所示的檢測待測序列的堿基排列。理論上，納米孔測序技術(shù)無需進(jìn)行任何前期樣本處理即可分析極少細(xì)胞樣本的核酸分子并獲得長讀數(shù)據(jù)。除此之外，納米孔測序還能夠直接從RNA甚至是被修飾的核苷酸中獲得序列信息。2020年，ONT發(fā)布了首款納米孔測序儀MinION[15]，其具備便攜、測序快以及可實(shí)現(xiàn)樣本全長測序等優(yōu)點(diǎn)。與SMRT測序相比，納米孔檢測的序列長度不受技術(shù)本身的限制，測序的長度主要取決于DNA分子的長度，最大讀長可達(dá)1Mb；每條DNA或RNA在納米孔測序平臺中只會被檢測一次，該特點(diǎn)能夠?qū)崿F(xiàn)對測序樣本的定量；對DNA或RNA的直接測序減少了前期逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增步驟，不僅縮短了測序周期，還可實(shí)現(xiàn)核苷酸修飾的直接檢測。但納米孔測序無法像SMRT測序一樣對同一條鏈進(jìn)行屢次測序，這造成了其相對較高的測序錯誤率。據(jù)估計(jì)，R9.4芯片的納米孔測序數(shù)據(jù)錯誤率在15%左右[16]。為了獲得更高層次的測序準(zhǔn)確性，ONT開發(fā)了一種針對dsDNA分子進(jìn)行測序的方式方法。在dsDNA單端使用發(fā)夾銜接子，確保第二條鏈在第一條鏈之后進(jìn)行測序，該系統(tǒng)稱為雙向〔two-directional,2D〕測序。該系統(tǒng)當(dāng)前已經(jīng)被1D2系統(tǒng)取代，1D2使用特定序列的銜接子，該銜接子能夠提高第一條鏈測序結(jié)束后第二條鏈繼續(xù)進(jìn)入測序孔的概率，這樣的改良能夠讓錯誤率降低到3%。但由于每個分子的兩條鏈都進(jìn)行了測序，因而測序通量遭到了影響，測序時(shí)間也延長了一倍。2、第三代測序在生物學(xué)領(lǐng)域的革新2.1、致病病原體的檢測2.1.1、病毒的檢測人類一直在尋找能夠徹底消滅致病病毒以及及時(shí)應(yīng)對病毒突變的方式方法。2022年，在湖北武漢發(fā)現(xiàn)多起病毒性肺炎病例，該肺炎由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2,SARS-CoV-2〕引起，世界衛(wèi)生組織將其命名為COVID-19。首個造成全人類疾病大流行的冠狀病毒SARS-CoV-2屬于RNA病毒，具備極高的變異速度。早期SARS-CoV-2的研究主要依靠于實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反響〔real-timereversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR〕，任何一個病毒檢測靶標(biāo)的突變都會降低現(xiàn)有檢測方式方法的靈敏度。為確定更穩(wěn)定的SARS-CoV-2分子檢測靶點(diǎn)，實(shí)時(shí)監(jiān)測SARS-CoV-2的突變，KELVIN等利用MinION測序鑒定臨床樣本中SARS-CoV-2基因組的高表示出區(qū)域。鑒定后發(fā)現(xiàn)位于SARS-CoV-2基因5端的非構(gòu)造蛋白1(non-structuralprotein1,nsp1〕為高表示出基因，并以此設(shè)計(jì)nsp1RT-PCR驗(yàn)證其在臨床檢測中的高敏感性和特異性。在SARS-CoV-2感染人類之前，VIEHWEGER等[17]就嘗試?yán)眉{米孔測序?qū)θ祟惙窝撞《尽睭CoV-229E〕的全長RNA進(jìn)行直接的檢測，觀察其構(gòu)造變體并進(jìn)行修飾分析。TGS在病毒檢測中的應(yīng)用不只局限于基因組，KIM等[18]利用納米孔測序技術(shù)直接對病毒RNA進(jìn)行測序，在病毒轉(zhuǎn)錄本上找到了至少41個RNA修飾位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)修飾的RNA其poly(A〕尾更短，表示清楚RNA修飾與3ploy(A〕尾之間存在聯(lián)絡(luò)。在轉(zhuǎn)錄組層面，研究發(fā)現(xiàn)的未知轉(zhuǎn)錄本和RNA修飾的功能能夠?yàn)槔斫釹ARS-CoV-2的生命周期和致病性開拓新的方向。臨床應(yīng)用是實(shí)驗(yàn)研究的主要目的，公共衛(wèi)生緊急事件需要通過實(shí)驗(yàn)建立快速的測序報(bào)告和具體的流行病學(xué)分析。MEREDITH等[19]通過收集5613例COVID-19患者的臨床數(shù)據(jù)和樣本，建立SARS-CoV-2的納米孔測序診斷技術(shù)。通過基因組學(xué)分析，在159例患者數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)35個一樣的病毒簇；經(jīng)流行病學(xué)分析，華而不實(shí)92名患者具有較強(qiáng)流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。臨床、感染控制和醫(yī)院管理團(tuán)隊(duì)通過該診斷技術(shù)的反應(yīng)結(jié)果，能夠盡快建立感染控制措施并告知患者安全報(bào)告。傳統(tǒng)的COVID-19臨床診斷方式方法往往呈現(xiàn)較高的假陰性結(jié)果，MING等利用納米孔測序技術(shù)結(jié)合靶向擴(kuò)增開發(fā)了納米孔靶向測序〔nanoporetargetedsequencing,NTS〕，在6～10h內(nèi)同時(shí)檢測SARS-CoV-2和其他呼吸道病毒，檢測結(jié)果顯示NTS對SARS-CoV-2的特異性到達(dá)100%。在疑似COVID-19病例的61個核酸樣本檢測結(jié)果中，NTS能夠靈敏地檢測到華而不實(shí)的22個陽性樣本；同時(shí)NTS能夠有效監(jiān)測突變的核酸序列，對SARA-CoV-2進(jìn)行分類并檢測樣本中其他的呼吸道病毒。除此之外NTS能夠進(jìn)一步擴(kuò)展，應(yīng)用到其他病原微生物的診斷當(dāng)中。綜上所述，TGS能夠?qū)崿F(xiàn)對病毒感染樣本的全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序，確定高表示出基因區(qū)域和構(gòu)造變體，及時(shí)發(fā)現(xiàn)高變異病毒的新監(jiān)測靶點(diǎn)，以便快速阻斷高突變病毒的傳播。TGS在病毒檢測方面的應(yīng)用不僅僅局限于檢測靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)上，而且能夠?qū)崿F(xiàn)病毒全基因組測序，有助于病毒進(jìn)化的研究。2020年，MinION初次應(yīng)用于西非埃博拉疫情的基因組檢測。在資源條件缺乏的西非，多個團(tuán)隊(duì)利用納米孔測序技術(shù)完成了疫情的應(yīng)急檢測和未知病原體的鑒定。2020年，JAN等將PCR、Illumina和MinION測序相結(jié)合，在原有技術(shù)上進(jìn)行改良。無論埃博拉病毒變異與否，該方式方法均可實(shí)現(xiàn)基因組快速精到準(zhǔn)確的檢測。結(jié)合PCR和TGS，簡化后的病毒檢測能夠從臨床樣本中成功檢測低豐度寨卡病毒基因，進(jìn)而建立病毒進(jìn)化樹，解析該病毒在感染地的傳播途徑，為干涉病毒傳播提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)支撐[20]。同年，STUBBS等[21]利用ONTMinION測序設(shè)備對登革熱病毒基因的PCR擴(kuò)增序列進(jìn)行測序，能夠?qū)崿F(xiàn)近乎完好的編碼區(qū)覆蓋率。TGS技術(shù)在烈性病毒鑒定與進(jìn)化研究中的應(yīng)用，極大地解決了以往病毒檢測面臨的培養(yǎng)周期長、無法定性分析和不能確定未知病原體的問題，對未知病原體及時(shí)有效的診斷特別重要。2.1.2、寄生蟲的檢測致病病原體的概念不僅僅局限在微生物層面，緊急公共衛(wèi)生事件的始作俑者有時(shí)可以能是寄生蟲。TGS全長測序的特性能夠?qū)崿F(xiàn)特定致病生物的全基因組測序，進(jìn)而建立致病病原體耐藥性研究體系。寄生蟲本身基因組的可變性能夠?qū)θ祟悪C(jī)體的免疫應(yīng)答迅速做出反響并產(chǎn)生耐藥性。比方，瘧原蟲的耐藥性主要是由細(xì)胞色素B、PfCRt、PfMDR1和K13基因的單核苷酸多態(tài)性〔singlenucleotidepolymorphisms,SNPs〕和不同突變點(diǎn)之間的組合造成的。為縮短藥物研發(fā)時(shí)間，提高尋找耐藥基因的準(zhǔn)確度，RUNTUWENE等[22]利用便攜的MinION在野外初次成功鑒定惡性瘧原蟲的基因分型，利用MinION鑒定的SNP信息以及K13突變基因，推斷出臨床瘧原蟲中的耐藥性狀態(tài)，及時(shí)調(diào)整藥物治療方案。研究寄生蟲的耐藥性只是TGS應(yīng)用的一個方面，TGS可以應(yīng)用于寄生蟲致病機(jī)理研究。LIECHTI等[23]利用MinION對萘氏飛虱的基因組進(jìn)行測序，通過長讀序列的組裝和基因修飾得到高質(zhì)量的基因組，預(yù)測可能會在萘氏飛虱發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮重要作用的分泌蛋白。經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)的國家和地區(qū)是寄生蟲感染的高發(fā)地，由于醫(yī)療衛(wèi)生水平和測序水平較落后，在致病病原體感染爆發(fā)初期不能得到有效的控制。以MinION為代表的TGS測序技術(shù)平臺具備良好的便攜性以及樣本處理簡易等特點(diǎn)，對于應(yīng)對需要緊急援助的公共衛(wèi)生事件至關(guān)重要，同時(shí)也使野外鑒定病原體基因型成為可能。2.2、精準(zhǔn)醫(yī)療TGS能夠更好地為精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域提供服務(wù)。2001年，人類基因組測序的第一稿完成。在二代測序技術(shù)的推動下，經(jīng)過近二十年改良得到的人類參考基因組〔GRCh38〕是當(dāng)前最準(zhǔn)確、最完好的脊椎動物基因組[24]，但其并未實(shí)現(xiàn)端粒到端粒的完好染色體測序。同時(shí)，一代和二代測序方式方法的局限性使人工拼接的染色體存在成百上千的缺口。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，高通量、長讀長及低成本的TGS能夠克制先前測序技術(shù)的缺點(diǎn)，使測序數(shù)據(jù)得以完好地覆蓋基因組。利用TGS，加州大學(xué)圣克魯斯分校聯(lián)合美國國家人類基因研究所〔NationalHumanGenomeResearchInstitute,NHGRI〕初次合成人類X染色體完好序列,為血友病、慢性肉芽腫病和杜興式肌肉萎縮癥等多種X染色體關(guān)聯(lián)性疾病提供了研究基礎(chǔ)[25]。由此可見，基于TGS基因組測序的應(yīng)用進(jìn)一步推動了精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。2.2.1、生物標(biāo)志物的探尋求索精準(zhǔn)醫(yī)療的應(yīng)用方向主要集中在癌癥治療研究領(lǐng)域，TGS可應(yīng)用于預(yù)測臨床上癌癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)生物標(biāo)志物。急性髓細(xì)胞性白血病〔acutemyeloidleukemia,AML〕是一種分子異質(zhì)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，基因的反復(fù)突變是患者治療和預(yù)后反響異質(zhì)性的原因之一[26,27]。在AML臨床研究中，確定具有疾病預(yù)測性的生物標(biāo)志物是開展靶向治療或進(jìn)行預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)臨床試驗(yàn)的必要條件。CUMBO等基于納米孔測序技術(shù)建立了更為高效的檢測方式方法，實(shí)現(xiàn)了AML中反復(fù)突變的六個基因〔NPM1、FLT3、CEBPA、TP53、IDH1和IDH2〕的快速測序。同樣是血液癌癥，慢性粒細(xì)胞白血病〔chronicmyrloidleukemia,CML〕則是由9號染色體和22號染色體之間的易位產(chǎn)生BCR-ABL1融合蛋白引起的病變。臨床中，CML患者通常通過酪氨酸激酶抑制劑〔tyrosinekinaseinhibitors,TKIs〕進(jìn)行治療，但該療法可誘導(dǎo)靶基因點(diǎn)突變導(dǎo)致耐藥性。CAVELIER等[28]構(gòu)建了一個約1.5kb的BCR-ABL1cDNA擴(kuò)增子，并利用SMRT進(jìn)行測序檢測TKI的抗性突變，檢測閾值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Sanger測序。以癌癥為例，罹患同類癌癥的不同病人致病基因具有異質(zhì)性。TGS能夠?qū)崿F(xiàn)病患生物標(biāo)志物的個性化研究，推進(jìn)了個性化精準(zhǔn)醫(yī)療的應(yīng)用和發(fā)展。2.2.2、人類表觀遺傳機(jī)制的探尋求索癌癥的發(fā)生通常伴隨著基因組表觀遺傳學(xué)修飾的改變。TGS利用電信號進(jìn)行測序的原理賦予其直接檢測堿基修飾的能力，為探尋求索表觀遺傳學(xué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。表觀遺傳學(xué)機(jī)制雖不牽涉基因組核苷酸的改變，但可通過表觀遺傳修飾介導(dǎo)下游基因表示出形式發(fā)生改變，此現(xiàn)象可跨代遺傳。與單純研究遺傳因素相比，探尋求索表觀遺傳學(xué)機(jī)制是解析疾病致病機(jī)理的又一重要研究方向。在1型糖尿病〔diabetesmellitustype1,T1D〕中，表觀遺傳修飾異常〔DNA甲基化、組蛋白修飾和microRNA失調(diào)〕與致病基因表示出的改變息息相關(guān)[29]。當(dāng)前T1D主要的易感基因是HLAII類等位基因，具有50%的遺傳風(fēng)險(xiǎn)。已有研究表示清楚，TGS與靶向捕獲技術(shù)聯(lián)用可實(shí)現(xiàn)人類白細(xì)胞抗原〔humanleukocyteantigen,HLA〕的高分辨基因分型及主要組織相容性復(fù)合體〔majorhistocompatibilitycomplex,MHC〕區(qū)域單倍體類型的精到準(zhǔn)確鑒定[30]。SUZUKI等[31]利用SGS和TGS進(jìn)行全長HLA等位基因測序，通過對46名健康受試者的基因組進(jìn)行測序，檢測到253個不同的等位基因，華而不實(shí)137個是新穎等位基因?；蚪M等位基因分辨率的提高增加了基因多態(tài)性，為精準(zhǔn)醫(yī)療和HLA相關(guān)疾病的研究提供理論根據(jù)。TGS節(jié)省了樣本前期的PCR經(jīng)過，將原始基因組的表觀遺傳修飾完好地保存了下來，并利用電信號測序或熒光脈沖間時(shí)間的長短實(shí)現(xiàn)基因組修飾的檢測，這一點(diǎn)是SGS無法企及的。因而，TGS實(shí)現(xiàn)未擴(kuò)增樣本的測序不僅能夠減少偏差，同時(shí)為表觀遺傳修飾的研究提供了可能。3、瞻望TGS克制了Sanger測序和SGS在樣本處理、測序通量和測序讀長上的限制。讀長的增加減少了基因組拼接的成本和時(shí)間，避免了PCR擴(kuò)增時(shí)可能引入的錯誤，同時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)表觀遺傳中DNA的修飾和基因構(gòu)造變異方面的研究。除此之外，TGS可以以完成藥用植物的全基因組拼接，解析和健全藥用植物的分子作用機(jī)制。單萜吲哚生物堿〔monoterpeneindolealkaloid,MIA〕包含3000多種不同化學(xué)骨架的化合物，是中草藥中重要的有效成分，主要通過化學(xué)方式方法從長春花、夾竹桃和喜樹中提取。鑒于MIA復(fù)雜的化學(xué)性質(zhì)及其在藥用上的價(jià)值，需要研究MIA的基因簇在不同植物中能否一致，以及在不同的植物中能否存在加速M(fèi)IA生物合成的分子。鉤吻是產(chǎn)生MIA的代表性植物之一，LIU等[32]借鑒棉花和人類基因組組裝的成功經(jīng)歷體驗(yàn)，使用納米孔測序技術(shù)和高通量染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)〔high-throughputchromosomeconformationcapturetechniques,Hi-C〕組裝鉤吻基因組，研究合成MIA的基因序列，拓展中藥在臨床治療中的用處。TGS的檢測速度和檢測長度的優(yōu)勢能夠在緊急疫情爆發(fā)時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用，符合國家衛(wèi)健委在(關(guān)于全面推進(jìn)社區(qū)醫(yī)院建設(shè)的通知〕中將強(qiáng)化傳染病早發(fā)現(xiàn)、早報(bào)告能力作為社區(qū)醫(yī)院的主要建設(shè)任務(wù)之一的宏觀指導(dǎo)?；ㄗ钌俚臅r(shí)間獲得最多的候選病原體信息是快速應(yīng)對公共突發(fā)疫情的前提。中國疾病預(yù)防控制中心分別以IonTorrentPGM、PacBioSMRTSequal和ONTMinION這三個測序平臺為基礎(chǔ)建立病毒檢測工作流程〔virusidentificationpipeline,VIP)[33]。該方案解決了TGS應(yīng)用到病毒檢測領(lǐng)域時(shí)所面臨的兩個重要問題：(1)能否能夠從復(fù)雜的臨床樣本中準(zhǔn)確地辨別出病毒；(2)能否完好覆蓋病毒全基因組。同時(shí)，通過比擬不同的測序平臺數(shù)據(jù)得出結(jié)論：Sequal能夠準(zhǔn)確覆蓋病毒基因組，MinION能夠使用最低的成本實(shí)現(xiàn)最快的測序速度，盡管準(zhǔn)確度相對較低，但能夠完成病毒分類鑒定。這類流程的建立，推動TGS快速準(zhǔn)確地應(yīng)對致病病原體的傳播。綜上所述，TGS不僅能夠在傳染性疾病的及時(shí)診斷、精準(zhǔn)醫(yī)療、藥物研發(fā)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，而且在中草藥有效成分的合成生物學(xué)領(lǐng)域具有重要的指導(dǎo)意義。第三代測序技術(shù)的應(yīng)用如此圖2所示。當(dāng)前的TGS技術(shù)同樣存在缺乏：(1)在實(shí)現(xiàn)DNA或RNA的全長測序時(shí)，對樣本本身的核酸質(zhì)量有很高的要求，測序前樣本的抽提必須盡可能減少人為造成的誤差；(2)TGS的測序錯誤率仍然相對較高，這也是當(dāng)前的TGS技術(shù)無法真正替代SGS的原因。但值得慶幸的是，測序技術(shù)的不斷改良和算法的助力正在嘗試解決TGS面臨的瓶頸，幫助進(jìn)一步拓展其在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。圖2第三代測序技術(shù)的應(yīng)用以下為參考文獻(xiàn)[1]MARGULIESLM,EGHOLMLM,ALTMANW,etal.Genomesequencinginmicrofabricatedhigh-densitypicolitrereactors[J].Nature,2005,437(7057):376-380[2]SANGERF,COULSONAR.ArapidmethodfordeterminingsequencesinDNAbyprimedsynthesiswithDNApolymerase[J]Jmolbiol,1975,94(3):441-448.[3]BENTLEYDR,BALASUBRAMANIANS,SWERDLOWHP,etal.Accuratewholehumangenomesequencingusingreversibleterminatorchemistry[J].Nature,2008,456(7218):53-59.[4]VALOUEVA,ICHIKAWAJ,TONTHATT,etal.Ahigh-resolution,nucleosomepositionmapofC.elegansrevealsalackofuniversalsequence-dictatedpositioning[J].Genomeres,2008,18(7):1051-1063.[5]SALKJJ,SCHMITTMW,LOEBLA.Enhancingtheaccuracyofnext-generationsequencingfordetectingrareandsubclonalmutations[J].Natrevgenet,2021,19(5):269-285.[6]EIDJ,FEHRA,GRAYJ,etal.Real-timeDNAsequencingfromsinglepolymerasemolecules[J].Science,2018,323(5910):133-138.[7]TRAVERSKJ,EIDJS,RANKETDR,etal.AflexibleandefficienttemplateformatforcircularconsensussequencingandSNPdetection[J].Nucleicacidsres,2018,38(15):159.[8]RHOADSA,AUKF.PacBiosequencinganditsapplications[J].Genomicsproteomicsbioinformatics,2021,13(5):278-289.[9]FLUSBERGBA,WEBSTERDR,LEEJH,etal.DirectdetectionofDNAmethylationduringsingle-molecule,real-timesequencing[J].Natmethods,2018,7(6):461-465.[10]SCHADTEE,BANERJEEO,FANGG,etal.ModelingkineticratevariationinthirdgenerationDNAsequencingdatatodetectputativemodificationstoDNAbases[J].Genomeres,2020,23(1):129-141.[11]QUAILMA.Ataleofthreenextgenerationsequencingplatforms:comparisonofIonTorrent,PacificBiosciencesandIlluminaMiSeqsequencers[J].BMCgenomics,2020(13):341.[12]CHINCS,SORENSONJ,HARRISJB,etal.TheoriginoftheHaitiancholeraoutbreakstrain[J].Nengljmed,2018,364(1):33-42.[13]RASKODA,WEBSTERDR,SAHLJW,etal.OriginsoftheE.colistraincausinganoutbreakofhemolyticuremicsyndromeinGermany[J].Nengljmed,2018,365(8):709-717.[14]DEAMERD,AKESONM,BRANTOND.Threedecadesofnanoporesequencing[J].Natbiotechnol,2021,34(5):518-524.[15]JAINM,FIDDESIT,MIGAKH,etal.ImproveddataanalysisfortheMinIONnanoporesequencer[J].Natmethods,2021,12(4):351-356.[16]JAINM,TYSONJR,LOOSEMW,etal.MinIONanalysisandreferenceconsortium:phase2datareleaseandanalysisofR9.0chemistry[J].F1000Res,2021(6):760.[17]VIEHWEGERA,KRAUTWURSTS,LAMKIEWICZK,etal.DirectRNAnanoporesequencingoffull-lengthcoronavirusgenomesprovidesnovelinsightsintostructuralvariantsandenablesmodificationanalysis[J].Genomeres,2022,29(9):1545-1554.[18]KIMD,LEEJ,YANGJ,etal.ThearchitectureofSARS-CoV-2transcriptome[J].Cell,2020,181(4):914-921.[19]MEREDITHLW,HAMILTONWL,WARNEB,etal.RapidimplementationofSARS-CoV-2sequencingtoinvestigatecasesofhealth-careassociatedCOVID-19:aprospectivegenomicsurveillancestudy[J].Lancetinfectdis,2020,3099(20):30562-30564[20]GRUBAUGHND,LADNERJT,DUDASG,etal.GenomicepidemiologyrevealsmultipleintroductionsofZikavirusintotheUnitedStates[J].Nature,2021,546(7658):401-405.[21]STUBBSSCB,BLACKLAWSBA,YOHANB,etal.AssessmentofamultiplexPCRandnanopore-basedmethodfordenguevirussequencinginindonesia[J].Virolj,2020,17(1):24.[22]RUNTUWENELR,TUDAJSB,MONGANAE,etal.Nanoporesequencingofdrug-resistance-associatedgenesinmalariaparasites,plasmodiumfalciparum[J].Scirep,2021,8(1):8286.[23]LIECHTIN,SCHURCHN,BRUGGMANNR,etal.Nanoporesequencingimprovesthedraftgenomeofthehumanpathogenicamoebanaegleriafowleri[J].Scirep,2022,9(1):16040.[24]LANDERES,LINTONLM,BIRRENB,etal.Initialsequencingandanalysisofthehumangenome[J].Nature,2001,409(6822):860-921.[25]MIGAKH,KORENS,RHIEA,etal.Telomere-totelomereassemblyofacompletehumanXchromosome[J].Nature,2020,585(7823):79-84.[26]ARBERDA,ORAZIA,HASSERJIANR,etal.The2021revisiontotheWorldHealthOrganizationclassificationofmyeloidneoplasmsandacu