第五章基因的分離與鑒定2

基因的分離與鑒定DNA克隆片段的產(chǎn)生和分離重組體DNA分子的構(gòu)建及導(dǎo)入受體細(xì)胞基因克隆的實(shí)驗(yàn)方案

克隆基因的分離

重組子的選擇與鑒定克隆基因的分離1.應(yīng)用核酸探針2.應(yīng)用差別雜交或扣除雜交法3.應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)4.應(yīng)用表達(dá)文庫5.酵母雙雜交體系應(yīng)用核酸探針分離克隆的目的基因步驟：1.獲得探針2.轉(zhuǎn)膜3.雜交TransfertheDNAintheplaqueorcolonytoaNylonornitrocellulosemembranePhageDNAbindtothemembranedirectly

BacterialcoloniesmustbelysedtoreleaseDNAonthemembranesurface.Hybridization

(inasolutionContainingNucleicacidprobe)Washto

removeunhybri-dizationprobeand

visualize

X-rayfilm(radio-activelylabeled

)

antibodyorenzyme(modifiednucleotidelabeled

Lineup

thehybridizatedregionorrepeatedhybridization(Alkalitreatment)探針的來源1.某種生物實(shí)驗(yàn)體系中分離到的基因序列，可作為從其它生物中分離相關(guān)基因的核酸探針。

2.根據(jù)蛋白質(zhì)家族保守性，合成核酸探針。功能相同或相近的蛋白質(zhì)，存在著具有共同氨基酸序列的區(qū)段（保守區(qū)），往往由彼此相鄰的6~7個氨基酸組成。

寡核苷酸探針的人工合成

1.探針的長度；要使探針與目的基因序列嚴(yán)格互補(bǔ)，最少的探針長度15~16個核苷酸，實(shí)驗(yàn)中為保證足夠的特異性，通常使用17~20個核苷酸。2.簡并性；根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸組分合成的寡核苷酸探針，通常是混合物的形式。在這種探針庫中，只有一種是與目的基因完全互補(bǔ)的。由于探針庫中只有一種是與目的基因完全互補(bǔ)的，其它的探針有可能與不相關(guān)的片斷雜交，產(chǎn)生假陽性信號。1.猜測體探針

2.PCR-猜測體探針猜測體：一種人工合成的用于分離克隆基因的低簡并性的寡核苷酸探針，其核苷酸序列是根據(jù)特定物種當(dāng)中某種已知蛋白質(zhì)的密碼子使用頻率，同時又采納了根據(jù)猜測最可能在目的基因中出現(xiàn)的密碼子資料，選擇含有密碼子簡并程度最低的蛋白質(zhì)區(qū)段進(jìn)行合成。一種較長的唯一的寡核苷酸序列，它能夠大范圍的卻不能夠完全的同靶序列互補(bǔ)。PCR-猜測體探針（尿酸氧化酶基因）根據(jù)末端32個氨基酸序列，設(shè)計PCR簡并引物，以cDNA為模板用猜測探針雜交篩選陽性克隆應(yīng)用差別雜交或扣除雜交法分離克隆的目的基因差別雜交（differentialhybridization）又稱差別篩選(differentialscreening)適用于分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達(dá)的mRNA的cDNA。扣除雜交（subtractivehybridization）又叫扣除cDNA克?。╯ubtractivecDNAcloning）通過構(gòu)建扣除文庫得以實(shí)現(xiàn)。差別雜交：需要兩種不同的細(xì)胞群體（目的基因正常表達(dá)、目的基因不表達(dá)），分別制備兩種不同mRNA提取物，以兩種總mRNA探針平行雜交，對有表達(dá)目的基因的細(xì)胞總mRNA構(gòu)建的克隆文庫進(jìn)行篩選。差別雜交的局限性：1.雜交靈敏度低，對于低峰度的mRNA尤為明顯2.工作量大，重復(fù)性差，兩套平行濾膜之間的DNA保有量有差別，導(dǎo)致雜交信號不一致。扣除雜交：去除普遍共同存在的、或是非誘發(fā)產(chǎn)生的cDNA序列，從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集。應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)（DDRT-PCR）分離克隆的目的基因

(differentialdisplayreversetranscriptionpolymerasechainreaction)原理：用3’-端錨定引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈；用3’-端錨定引物和5’-端10-mer隨機(jī)引物組成引物對，以反轉(zhuǎn)錄第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（DDRT-PCR），在標(biāo)準(zhǔn)的序列膠中電泳2~3小時，可顯示出50~100條長度在100~5000bp之間的DNA條帶。

P.Liang等人設(shè)計合成了全部12種不同的引物，用以反轉(zhuǎn)錄mRNA，合成第一鏈cDNA。這種引物通常叫作3'-端錨定脫氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M為除了T以外的任何一種核苷酸（即A、G或C），而N則為任何一種核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12種不同的排列組合方式。mRNA:5’-NMAAAAAA…AA-3’(12種序列)3’-NMTTTTTTT…TT-5’3’-錨定引物：10-mer，更好的同第一鏈結(jié)合，從而呈現(xiàn)出更多種的mRNA。一般用20種隨機(jī)引物和12種3’-端錨定引物組成的全部240組引物對PCR擴(kuò)增后，所產(chǎn)生的大約20000條條帶，基本涵蓋了在一定的發(fā)育階段某種類型細(xì)胞中所表達(dá)的全部的mRNA。5’-隨機(jī)引物由于在cDNA群體中，代表特定細(xì)胞類型或發(fā)育階段的mRNA的含量非常低，所以要把一種只在某一階段或某種細(xì)胞類型中表達(dá)、而在另一發(fā)育階段或某種細(xì)胞類型中不表達(dá)的目的基因分離出來，就需要PCR擴(kuò)增。DDRT-PCR1.從一對處于不同發(fā)育階段（或不同基因型）的細(xì)胞群體中分離總mRNA，并用3’-端錨定引物作反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA;2.用5’-端隨機(jī)引物和3’-端錨定引物組成的引物對，在加入放射性同位素標(biāo)記的dNTP的條件下，以第一步反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3.將擴(kuò)增樣品在變性的DNA測序膠中進(jìn)行電泳分離基本過程：4.將有關(guān)的差別表達(dá)的DNA條帶從測序膠上切割下來回收其DNA片斷；5.膠塊中的DNA量非常少，不能用于克隆，需進(jìn)行二次擴(kuò)增；6.將克隆的特定的DNA分別同基因組DNA及總mRNA作Southern或Northern雜交，測序；7.以此目的片斷作探針從cDNA文庫中或基因組文庫中篩選全長的cDNA克隆或基因組克隆。1.可以同時比較多個樣品表達(dá)的差異；2.可以同時檢測“上游”及“下游”的基因；3.檢測靈敏度高，所需樣品少，經(jīng)PCR擴(kuò)增一些低峰度的mRNA也可以被檢測出來；4.結(jié)合使用了PCR和序列膠電泳分析兩項(xiàng)技術(shù)，使本方法顯得較單方便。優(yōu)點(diǎn)：

1.假陽性比例高（50%～75%）；同一長度的條帶，含有多種DNA序列；鄰近條帶回收時，造成人為誤差；mRNA3’-端序列保守性高，而常用3’-端cDNA作探針

2.擴(kuò)增的差別條帶分子長度比較短?。?10～450bp）；

局限性：應(yīng)用表達(dá)文庫分離克隆的目的基因當(dāng)沒有可用的核苷酸序列供作篩選基因文庫的探針時，將cDNA克隆在表達(dá)載體上，再導(dǎo)入大腸桿菌寄主細(xì)胞然后通過對蛋白質(zhì)產(chǎn)物的鑒定，分離克隆的真核目的基因。表達(dá)文庫分離克隆的目的基因1.表達(dá)的蛋白質(zhì)以融合蛋白質(zhì)的形式存在，其中原核蛋白質(zhì)的氨基酸序列是整合在真核蛋白質(zhì)的一個末端，不易被原核細(xì)胞中的有關(guān)蛋白酶消化降解，因而顯得比較穩(wěn)定，可以得到較高的表達(dá)水平。2.cDNA片斷必須置于啟動子序列下游，在其控制之下；按正確的取向和讀碼結(jié)構(gòu)插入，確保產(chǎn)生正確的蛋白質(zhì)。特點(diǎn)：1.利用抗體篩選表達(dá)文庫；2.測定蛋白質(zhì)的功能；3.用放射性同位素標(biāo)記的、帶有特定蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的DNA片斷作探針篩選表達(dá)文庫。篩選的方法：將菌落或噬菌斑原位復(fù)制到膜上處理之后蛋白質(zhì)暴露，與第一抗體溫育漂洗未結(jié)合的抗體，加入經(jīng)標(biāo)記的第二抗體能與第一抗體結(jié)合抗體篩選表達(dá)文庫生物化學(xué)研究表明，存在Ca＋＋離子的條件下，鈣調(diào)蛋白能與許多種酶結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物。將放射性同位素標(biāo)記得鈣調(diào)蛋白用作探針篩選cDNA表達(dá)文庫，鑒定能夠表達(dá)出與它特異性結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)的陽性克隆。2.測定蛋白質(zhì)的功能鑒定能夠表達(dá)出與特定DNA片斷（真核啟動子中與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA元件）結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)的克隆。3.用放射性同位素標(biāo)記的、帶有特定蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的DNA片斷作探針篩選表達(dá)文庫酵母雙雜交體系

（two-hybridsystem）有效的分離能與已知的靶蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因。應(yīng)用于真核基因地表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞粘合因子間的相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及細(xì)胞周期與分化、反式因子的鑒定與分離等研究酵母雙雜交體系又叫相互作用陷阱(interactiontrap)許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個結(jié)構(gòu)上可以分開的、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成（example）；應(yīng)用重組DNA技術(shù)，也可以將來自同一個轉(zhuǎn)錄因子的、或者兩種不同轉(zhuǎn)錄因子的、分開的兩種結(jié)構(gòu)域，在體內(nèi)重新組裝成具有功能的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活UAS（上游激活序列）下游啟動子調(diào)節(jié)的報告基因的表達(dá)。基本原理：釀酒酵母的半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4，在N端1～147位氨基酸區(qū)段有一個結(jié)合域（DNA-bindingdomain,DNA-BD）；在C端768～881位氨基酸區(qū)段有一個轉(zhuǎn)錄激活域（transcriptionactivationdomain,AD）DNA-BD能識別激活序列并與之結(jié)合；AD通過同轉(zhuǎn)錄機(jī)制中的其它成份之間的結(jié)合作用啟動下游基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。用DNA重組技術(shù)將它們分開，即使在同一個寄主中表達(dá)，也不會直接發(fā)生相互作用不能激活相關(guān)的效應(yīng)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。Example:寄主菌株：剔除掉GAL4基因的釀酒酵母1.SFY526和HF7c帶有報告基因lacZ、HIS3和LEU22.還有兩種可以在大腸桿菌和酵母中自主復(fù)制的穿梭載體a.

pGBT9(DNA-BD)：靶基因是按正確的取向和讀碼結(jié)構(gòu)被克隆在載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)內(nèi)，于是靶蛋白和GAL4-BD之間產(chǎn)生融合作用，形成雜種蛋白質(zhì)b.第二種質(zhì)粒載體pGAD424(AD質(zhì)粒載體)用來構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫專用載體，克隆cDNA片斷是按正確的取向和讀碼結(jié)構(gòu)插入在載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)內(nèi)，因此由cDNA編碼的蛋白質(zhì)便會同GSL4-AD之間產(chǎn)生融合作用，形成雜種蛋白質(zhì)。

選擇缺失GAL4編碼基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c；構(gòu)建帶有GAL1UAS-啟動子-lacZ（His3）的轉(zhuǎn)化載體;把已知的靶蛋白質(zhì)編碼基因克隆到pGBT9的多克隆位點(diǎn)上，把所有cDNA都克隆到pGAD424載體上，構(gòu)成cDNA表達(dá)文庫。從大腸桿菌中分別提取這兩種重組質(zhì)粒DNA，共轉(zhuǎn)化感受態(tài)釀酒酵母菌株。

e.將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培養(yǎng)基上，篩選表達(dá)相互作用的雜種蛋白的陽性菌落。酵母雙雜交體系的主要實(shí)驗(yàn)過程：go

1.遺傳檢測法2.物理檢測法3.菌落或噬菌斑雜交篩選法4.免疫化學(xué)檢測法5.蛋白質(zhì)篩選法6.轉(zhuǎn)譯篩選法重組子分子的選擇與鑒定重組子、目的重組子與非目的重組子由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子

該方法要求克隆基因能夠表達(dá)，并利用相應(yīng)的基因突變型作為受體細(xì)胞，當(dāng)受體細(xì)胞由突變型變?yōu)橐吧蜁r或賦予受體細(xì)胞特定的表型時，我們基本可以確定所克隆的基因是否是目的基因優(yōu)點(diǎn)：簡便、快速，結(jié)果較可靠缺點(diǎn)：基因必須表達(dá)并具有合適的受體細(xì)胞遺傳檢測法1.根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子的直接選擇法a.抗藥性記號插入失活選擇法b.β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法抗藥性篩選法的基本原理抗藥性篩選法可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子將外源DNA片段插在EcoRI位點(diǎn)：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcr將外源DNA片段插在BamHI位點(diǎn)：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcs抗藥性篩選法的基本操作：先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Ap的平板再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Ap和Tc的平板上在Ap平板上生長、但在Ap和Tc平板上不長的轉(zhuǎn)化子即為重組子顯色篩選法顯色篩選法的基本原理：顯色篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍(lán)色反應(yīng)）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應(yīng)）等顯色篩選法的基本操作將外源基因克隆在pUC18的lacZ’標(biāo)記基因內(nèi)部，使之滅活，此時重組子呈Apr、lacZ-，淡黃色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍(lán)色菌落2.根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體分子的直接選擇法

轉(zhuǎn)化進(jìn)來的外源DNA編碼的基因，能夠?qū)Υ竽c桿菌寄主菌株所具有的突變體發(fā)生體內(nèi)抑制或互補(bǔ)效應(yīng)，從而使被轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。Example:

λgt.λB噬菌體（由于C片斷的缺失而造成重組缺陷的λred－噬菌體），在大腸桿菌ligts菌株上生長不能形成噬菌斑，在有連接酶功能的大腸桿菌lig＋菌株上形成噬菌斑。將具有連接酶基因的重組體噬菌體λgt.λB，涂布在大腸桿菌ligts菌株上時，通過寄主細(xì)胞的互補(bǔ)作用，能夠形成噬菌斑。根據(jù)形成噬菌斑這種表型特征，直接選擇具野生功能的重組體噬菌體。

缺點(diǎn)：不單要求克隆的DNA片斷必須大到括足以包含一個完整的基因，而且還要求所編碼的基因能夠在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)。（對于真核基因很難達(dá)到要求）物理檢測法

1.凝膠電泳檢測法

利用凝膠電泳的方法，鑒定外源片斷是否插入及其長度

優(yōu)點(diǎn)：簡便、快速

缺點(diǎn)：只能提供克隆片段大小的信息

2.R-環(huán)檢測法：鑒定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源區(qū)域

在臨近雙鏈DNA變性溫度下和高濃度的甲酰胺溶液中（70%），雙鏈的DNA-RNA分子比雙鏈的DNA-DNA分子更加穩(wěn)定。在這種條件下，RNA會同它的雙鏈DNA分子中的互補(bǔ)序列退火形成穩(wěn)定的RNA-DNA，而被取代的另一條DNA呈單鏈狀態(tài)。這種由雙鏈RNA-DNA和單鏈DNA形成的泡狀體稱R-環(huán)結(jié)構(gòu)

包括菌落或噬菌斑的原位雜交技術(shù)

優(yōu)點(diǎn)：方法簡便、快速。

缺點(diǎn)：必須具有相應(yīng)的探針。分子雜交技術(shù)檢測法菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據(jù)克隆的目的基因或DNA片段的同源序列設(shè)計并合成探針，以此搜尋篩選含有目的基因的目的重組子。其中，DNA同源序列之間的特異性互補(bǔ)雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù)菌落原位雜交法的基本操作：用硝酸纖維素薄膜影印克隆平板用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜80℃烘干固定影印薄膜薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫用SSC-SDS液洗滌雜交薄膜用X光膠片覆蓋薄膜感光

利用免疫學(xué)的原理，檢測克隆基因的表達(dá)產(chǎn)物。免疫化學(xué)檢測法

該方法類似于原位雜交法優(yōu)點(diǎn)：方法簡便，一次可檢測大量的克隆子缺點(diǎn)：克隆基因必須表達(dá)并具有相應(yīng)的抗體1.放射性抗體檢測法1.免疫血清含有幾種IgG抗體，識別抗原分子上不同定子，并分別同各自識別的抗原定子相結(jié)合；2.抗體分子或抗體的F（ab）部分，能夠牢固的吸附在固體基質(zhì)上（聚乙烯等塑料制品），而不容易被洗脫掉；3.通過體外碘化作用，IgG抗體會迅速的被放射性同位素125I標(biāo)記上。

原理：1.菌落溶解釋放出抗原蛋白質(zhì)；a.把平板放置在氯仿蒸氣中；b.用烈性噬菌體的氣溶膠噴灑；c.用帶有能被熱誘發(fā)的原噬菌體的寄主菌處理。2.將連結(jié)在固體支持物上的抗體緩慢的同溶解的細(xì)胞接觸，形成抗原－抗體復(fù)合物3.將固體支持物取出，與放射性標(biāo)記的第二種抗體溫育；4.放射自顯影檢測。步驟：用氯仿蒸汽或烈性噬菌體噴灑克隆平板用固定了特異性抗體的聚乙烯薄膜影印裂解平板輕輕漂洗影印薄膜，干燥固定與II125標(biāo)記的IgG保溫洗滌、干燥、感光放射免疫原位雜交鑒定細(xì)菌菌落溶解，釋放出抗原蛋白質(zhì)雙位點(diǎn)檢測法：適用于含有雜種多肽菌落分析。雜種多肽A–B（A）抗體（B）抗體固定在固體基質(zhì)125I標(biāo)記濾膜抗體溶液放射性標(biāo)記抗體檢測法的操作程序聚乙烯薄膜培養(yǎng)皿及菌落放射性標(biāo)記抗體檢測法的操作程序

在生長菌落的瓊脂培養(yǎng)基中，加入專門抗這種蛋白質(zhì)分子的特異性抗體。如果菌落的細(xì)菌會分泌出某種蛋白質(zhì)，那么它的周圍，就會出現(xiàn)一條由一種叫做沉淀素的抗體-抗原沉淀物所形成的白色的圓圈

靈敏度低，易受干擾，實(shí)用性差。

2.免疫沉淀檢測法免疫沉淀鑒定：用專門設(shè)計的表達(dá)載體，將真核基因編碼