儀器分析-高效液相色譜

第六章

高效液相色譜法化工系徐吉成2011年9月2023/2/61第六章高效液相色譜法

(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)

1906年，俄國生化學家茨維特第一個運用玻璃柱分離植物色素，并取得較好的分離效果，成為世界公認的液相色譜的奠基人。但受當時技術條件的限制，這種經典的柱色譜由于柱效、回收率、重現性等因素的影響，未能迅速發(fā)展。高效液相色譜法（HPLC）是20世紀60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術，隨著不斷改進與發(fā)展，目前已成為應用極為廣泛的化學分離分析的重要手段。它是在經典液相色譜基礎上，引入了氣相色譜的理論，在技術上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。-、高效液相色譜的概述2023/2/62高速：HPLC采用高壓輸液設備，流速大增加，分析速度極快，只需數分鐘；而經典方法靠重力加料，完成一次分析需時數小時。高效：填充物顆粒極細且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質阻力小，因而柱效很高?？梢栽跀捣昼妰韧瓿蓴蛋俜N物質的分離。高靈敏度：檢測器靈敏度極高：UV——10-9g,熒光檢測器——10-11g。

1．高效液相色譜法與經典液相色譜法

高效液相色譜法比起經典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。

經典LCHPLC柱之內徑1~5cm~0.4cm長度50~100cm15~50cm填充材料粒度150μm~200μm4μm~10μm使用壓力1~10atm50~200atm分離時間0.5h~天~10min例:分離苯的羥基化合物，7個組分只需1min就可完成。對氨基酸分離，用經典色譜法，柱長約170cm，柱徑0.9cm，流動相速度為30cm3·h-1，需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內即可完成。2023/2/632．高效液相色譜法與氣相色譜法

（l）氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數的20％。對于占有機物總數近80％的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質量大的物質，目前主要采用高效液相色譜法進行分離和分析。

(2)氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起很大作用，相當于增加了一個控制和改進分離條件的參數，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。

(3)氣相色譜一般都在較高溫度下進行的，而高效液相色譜法則經?？稍谑覝貤l件下工作。P296從色譜分析的發(fā)展來看，HPLC比GC更為有用、更具發(fā)展前途2023/2/64總之，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經典液相色譜優(yōu)點，并用現代化手段加以改進，因此得到迅猛的發(fā)展。目前高效液相色譜法已被廣泛應用于分析對生物學和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質，例如蛋白質、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質的分離和分析。1、樣品不必氣化2、分離溫度低3、選擇性好4、樣品回收容易5、分離效果好塔板數達到104~105/m6、采用高壓輸液泵，高效微粒固定相和高靈敏度檢測器

7、儀器設備費用昂貴，操作嚴格。3.HPLC的特點2023/2/65廣義地講，除柱色譜外，薄層色譜（液—固色譜）和紙色譜（液—液色譜）也屬于LC。狹義的LC指柱色譜。按分離機理，柱色譜法可分為液—固吸附色譜、液—液分配色譜、鍵合相色譜、離子色譜等。

§6.1HPLC的主要類型及選擇2023/2/666.1.1液—固吸附色譜法

液---固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質（如硅膠、氧化鋁等），在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實質是根據物質在固定相上的吸附作用不同來進行分離的。1．分離原理當流動相通過固定相（吸附劑）時，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時，當試樣分子（X）被流動相帶入柱內，只要它們在固定相有一定程度的保留就要取代數目相當的已被吸附的流動相溶劑，于是，在固定相表面發(fā)生競爭吸附:X+nSad=Xad+nS達平衡時,有其中Kad為吸附平衡常數，值大表示組分在吸附劑上保留強，難于洗脫。Kad值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據此得以分離。2023/2/672.固定相

液---固吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點較多，如線性容量較高，機械性能好，不溶脹，與大多數試樣不發(fā)生化學反應等，因此，以硅膠用得最多。

3.流動相

把吸附色譜中流動相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對極性大的試樣往往采用極性強的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強弱可用溶劑強度參數（ε0）來衡量。ε0越大，表示洗脫劑的極性越強。2023/2/68在液---液色譜中，流動相和固定相都是液體，它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。1.分離原理

液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據物質在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進行的，使這種分配平衡可反復多次進行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復雜組分。6.1.2液---液分配色譜法2.固定相

為了更好解決固定液在載體上流失問題。產生了化學鍵合固定相。它是將各種不同有機基團通過化學反應鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機械涂漬，因此它的產生對液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以認為它的出現是液相色譜法的一個重大突破。最常用的強極性固定液β,β′---氧二丙睛，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊烷等。2023/2/693．流動相

在液液色譜中為了避免固定液的流失，對流動相的一個基本要求是流動相盡可能不與固定相互溶，而且流動相與固定相的極性差別越顯著越好。根據所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。如果采用流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相分配色譜，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。如果采用流動相的極性大于固定相的極性，稱為反相分配色譜，它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。2023/2/610正相色譜法反相色譜法1.極性固定相

聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相2.相對非極性流動相

正已烷、環(huán)已烷

3.極性調節(jié)劑

乙醇、四氫呋喃、三氯甲烷4.分離中等極性和極性較強化合物.

酚類、胺類、羰基類及氨基酸類

5.組分流出順序

極性小先洗出1.非極性固定相

C18（簡稱ODS）、C82.極性流動相

水或緩沖液3.極性調節(jié)劑

甲醇、乙腈、四氫呋喃4.分離非極性和極性較弱化合物

占整個HPLC應用的80%左右5.組分流出順序

極性大先洗出

液液分配色譜2023/2/6116.1.3化學鍵合相色譜法

采用化學鍵合相的液相色譜稱為化學鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜。由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。用來制備鍵合固定相的載體(基體），幾乎都用硅膠。鍵合相色譜的最大優(yōu)點是：通過改變流動相的組成和種類，可有效地分離各種類型化合物（非極性、極性和離子型）。2023/2/612鍵合在硅膠表面的非極性或弱極性基團具有較強的疏水特性，當用極性溶劑為流動相來分離含有極性官能團的有機化合物時：3.被分離物極性部分受到極性流動相的作用（或流動相極性減小時），這種疏溶劑斥力下降，會發(fā)生解締，并把溶質分子釋放而被洗脫下來，促使它離開固定相。

顯然，鍵合固定相對每一種溶質分子締合和解締能力的差異，決定了溶質分子在色譜分離過程中的保留值。1、溶質分子進入極性流動相后，即占據流動相中相應的空間，而排擠一部分溶劑分子；2、當溶質分子被流動相推動和固定相接觸時，溶質分子的非極性部分(或非極性分子）會將非極性固定相上附著的溶劑膜排擠開，直接和非極性固定相上的烷基官能團相結合形成締合物，構成吸附層，保留在固定相中；2023/2/613

2023/2/6146.1.4凝膠色譜法凝膠色譜又稱分子排阻色譜法主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現分離的。尺寸排阻色譜被廣泛應用于大分子的分級，即用來分析大分子物質相對分子質量的分布。它具有其他液相色譜所沒有的特點：（1）保留時間是分子尺寸的函數，有可能提供分子結構的某些信息。(2)保留時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強保留分子，因此柱壽命長。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質量差別必須大于10％才能得以分離。2023/2/615

以凝膠(gel)為固定相，它類似于分子篩，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多。凝膠內具有一定大小的孔穴，小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；中等體積的分子部分滲透；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。樣品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。分離原理

尺寸排阻色譜是按分子大小順序進行分離的一種色譜方法。2023/2/6166.1.4親和色譜法

親和色譜是利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力，進行選擇性分離的一種方法。它通常是在載體（無機或有機填料）表面先鍵合一種具有一般反應性能的所謂間隔臂（如環(huán)氧、聯氨等）；隨后，再連接上配基（酶、抗原或激素等）。這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，沒有這種作用的分子不被保留。2023/2/617離子交換色譜法固定相:離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基陽離子交換樹脂在表面未端芳環(huán)上接上季胺基陰離子交換樹脂流動相：電解質溶液、有機弱酸或有機弱酸鹽溶液6.1.6離子交換色譜法ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－2023/2/618離子交換色譜法分離原理

樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換而分離。應用

離子交換色譜法主要用于分析陰，陽離子，凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。分析物質有機酸、氨基酸、多肽及核酸。

離子交換色譜法分離機理2023/2/6196.1.5分離類型的選擇

1．根據相對分子質量選擇

相對分子質量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。標準液相色譜類型（液一固、液一液、及離子交換色譜）最適合的相對分子質量范圍是20O～2000。對于相對分子質量大于2000的樣品，則用尺寸排阻法為最佳。

2．根據溶解度選擇

弄清樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度是很有用的。如果樣品可溶于水并屬于能離解物質，以采用離子交換色譜為佳；如樣品可溶于烴類（如苯或異辛烷），則可采用液一固吸附色譜；如樣品溶解于四氯化碳，則多采用常規(guī)的分配和吸附色譜分離；如樣品既溶于水又溶于異丙醇時，常用水和異丙醇的混合液作液一液分配色譜的流動相，以憎水性化合物作固定相。

3．根據分子結構選擇

用紅外光譜法，可預先簡單地判斷樣品中存在什么官能團。然后，確定采用什么方法合適。例如，酸、堿化合物用離子交換色譜；脂肪族或芳香族用液一液分配色譜、液一固吸附色譜；異構體用液一固吸附色譜；同系物不同官能團及強氫鍵的用液一液分配色譜。2023/2/620色譜類型選擇2023/2/621§6.2高效液相色譜儀6.2.1基本構成和工作過程

1.基本構成高效液相色譜儀的結構示意見，一般可分為5個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)、進樣器、色譜柱、檢測器和工作站（數據處理系統(tǒng)）。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣等。2.工作過程其工作過程如下：高壓輸液泵將儲液器中的流動相以穩(wěn)定的流速（或壓力）輸送到分析系統(tǒng)，在色譜柱之前通過進樣器將樣品導入，流動相將樣品依次帶入預柱、色譜柱，在色譜柱中各組分被分離，并依次隨流動相流至檢測器，檢測器的信號送至工作站記錄、處理和保存，由此得到液相色譜圖。2023/2/622高壓泵流動相溶劑廢液色譜柱進樣口檢測器2023/2/623

1．高壓輸液系統(tǒng)

由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、梯度洗脫裝置等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。6.2.2儀器基本結構

貯液器材質：玻璃、不銹鋼、氟塑料或特種塑料聚醚醚酮（PEEK）容積：0.5～2.0L

放置位置：高于泵體，保持一定的輸液靜壓差注意：密封、過濾2023/2/624高壓輸液泵

要求：泵體材料能耐化學腐蝕；能在高壓（30～60MPa）下連續(xù)工作；輸出流量穩(wěn)定（±1%），無脈沖，重復性高（±0.5%），而且輸出流量范圍寬；適用于梯度洗脫。

類型：一般可分為恒壓泵和恒流泵兩大類恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重視性差。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。2023/2/625梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置——類似于GC中的程序升溫。已成為現代高效液相色譜中部缺少的部分。作用是使保留值相差很大的多種組分在合理的時間內全部洗脫并達到相互分離。所謂梯度洗脫，就是載液中含有兩種（或更多）不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性，通過載液中極性的變化來改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。它可以分為兩種：

低壓梯度（也叫外梯度）：在常壓下，預先按一定程序將兩種或多種不同極性的溶劑混合后，再用一臺高壓泵輸入色譜柱。高壓梯度(或稱內梯度系統(tǒng))：利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按設定的比例送入梯度混合室，混合后，進入色譜柱。2023/2/626梯度洗脫裝置低壓梯度高壓梯度通過改變流動相的組成來調整組分的k值，改變分離因子α值，以達到最短時間內得到最佳分離的目的。梯度洗脫2023/2/627等度洗脫與梯度洗脫2023/2/628梯度洗脫的特點改善分離,加快分析速度；改善峰形,減少拖尾;可能引起基線漂移分配比變化范圍寬的復雜樣品應采取梯度洗脫方式分離2023/2/6292．進樣系統(tǒng)

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術要求較嚴。

液相色譜進樣針：類似于氣相色譜進樣針，只是其針頭為平頭，以免扎破六通閥管路。用于可變體積進樣2023/2/630六通閥進樣器：用于固定體積進樣2023/2/6313分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm，內徑為4～5mm，凝膠色譜柱內徑3～12mm，制備往內徑較大，可達25mm以上。一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離技的性能不受影響。

2023/2/6324．檢測系統(tǒng)

在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學特性有響應，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學性質有響應，屬于這類檢測器的有示差折光，電導檢測器等。1）紫外檢測器其檢測原理和UV-Vis方法一樣。只是此時所采用的吸收池為微量吸收池，通常其光程為2-10mm,體積約為1~10L。

HPLC分析中，約有80%的物質可以在254nm或280nm處產生紫外吸收。因此該類檢測器應用很廣。

在選擇測量波長時注意：溶劑必須能讓所選擇的光透過，即所選波長不能小于溶劑的最低使用波長。石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液2023/2/633兩種檢測器的色譜圖(a)：可變波長紫外檢測器；(b)：二極管陣列檢測器(b)(a)2023/2/6342）熒光檢測器

許多有機物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強的活性。熒光檢測器是一種選擇性很強的檢測器，其靈敏度比UV檢測器高2~3個數量級。靈敏度高，選擇性好，可用于梯度洗脫。

2023/2/635紫外吸收檢測器(a)可變波長紫外檢測器(b)二極管陣列檢測器氘燈光柵流通池測量光電二極管參比光電二極管二極管陣列檢測器2023/2/6363）示差折光檢測器原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對光的折射率不同，其中一束（通常是通過樣品+溶劑相）光因為發(fā)生偏轉造成兩束光的強度差發(fā)生變化，將此差示信號放大并記錄，該信號代表樣品的濃度。為通用型檢測器，靈敏度為10-7g/mL。但對溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗。光源調零光學零參比樣品平面鏡透鏡光電轉換記錄儀放大器遮光板2023/2/6374）電導檢測器