現(xiàn)代基因工程-04將DNA引入活細(xì)胞

基因工程

第四講：將DNA引入活細(xì)胞IntroductionofDNAintoLivingCells講課提綱

概述4.1轉(zhuǎn)化-使細(xì)菌細(xì)胞獲取DNA4.2重組體的鑒定4.3將噬菌體DNA引入細(xì)菌細(xì)胞4.4重組噬菌體的鑒別4.5非細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化在創(chuàng)造出新的重組DNA分子后，接下來的步驟是將這些分子引入到活細(xì)胞中，通常情況下是細(xì)菌，并隨著活細(xì)胞的生長和分裂產(chǎn)生出克隆。嚴(yán)格地講，“克隆”這個詞僅指后面過程，并不包括重組DNA分子構(gòu)建本身。基因克隆的目的(1)目的(1)：

從有限數(shù)量的起始材料中產(chǎn)生出大量的重組DNA分子。用細(xì)菌中的質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，可以得到開始階段的上千倍重組DNA分子?；蚩寺〉哪康?2)純化是克隆的第二個重要功能。重組DNA分子過程中，連接反應(yīng)的混合物中可有其他的DNA分子：(1)未連接上的載體分子；(2)未連接上的DNA片段；(3)沒有插入新DNA而重新閉合的載體分子(“自連接”載體)；(4)攜帶插入錯誤DNA片段的重組DNA分子。未連接的分子很少造成污染：

因為即便它們會被加入到細(xì)菌細(xì)胞中，也只有在非常例外的情況下才能發(fā)生復(fù)制。更多的情況下，宿主細(xì)胞中的酶會降解這些DNA碎片。自連接的載體分子和錯誤重組的質(zhì)粒與目的分子以相同的效率被復(fù)制。通過克隆可以實現(xiàn)目的分子的純化：對于任何一個細(xì)胞來說，攜帶超過一個DNA分子是非常罕見的。每個細(xì)胞都產(chǎn)生單一的克隆。不同的克隆包含有不同的分子：一些包含了目的重組DNA分子，一些包含自連接的載體分子。因此問題就轉(zhuǎn)變成，如何鑒別出包含有正確重組質(zhì)粒的克隆。4.1轉(zhuǎn)化-使細(xì)菌細(xì)胞獲取DNA絕大多數(shù)種類的細(xì)菌能夠從它們生長的培養(yǎng)基中獲取DNA分子。通常這種DNA分子都會被降解掉；偶爾DNA分子存活下來并復(fù)制；特別是帶有復(fù)制起始點(diǎn)的質(zhì)粒時，這種現(xiàn)象更有可能發(fā)生。判斷質(zhì)粒是否被獲取和穩(wěn)定地保持，通常是通過質(zhì)粒所攜帶基因的表達(dá)情況來進(jìn)行檢測。例如，大腸桿菌細(xì)胞正常情況下對氨芐青霉素和四環(huán)素的生長抑制效應(yīng)敏感，但是，包含有質(zhì)粒pBR322的細(xì)胞，對這些抗生素有抵抗力。因為pBR322質(zhì)粒含有兩組基因：一個基因編碼能夠?qū)逼S青霉素修飾成對細(xì)菌無毒害作用的β-內(nèi)酰胺酶；另一組編碼使四環(huán)素?zé)o毒化的酶。4.1.1不同細(xì)菌獲取DNA效率不同在自然條件下，轉(zhuǎn)化很可能不是一個細(xì)胞獲取遺傳信息的主要方式。在實驗室中只有很少種類能夠很容易地被轉(zhuǎn)化，它們都具有復(fù)雜的結(jié)合和獲取DNA的機(jī)制。絕大多數(shù)細(xì)菌，僅能在正常條件下獲取有限數(shù)量的DNA。為了高效地轉(zhuǎn)化這些細(xì)菌，不得不讓細(xì)菌經(jīng)歷一些物理和／或化學(xué)處理以增強(qiáng)它們獲取DNA的能力。經(jīng)歷了這種處理的細(xì)菌細(xì)胞被稱作感受態(tài)細(xì)胞。4.1.2大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備人們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過冷的鹽溶液浸泡的大腸桿菌細(xì)胞，相比未經(jīng)浸泡的細(xì)胞獲取外源DNA要高效得多。習(xí)慣上使用50mM氯化鈣溶液。

尚不非常清楚這一處理如何發(fā)揮作用的?？赡茉颍篊aCl2使DNA在細(xì)胞外側(cè)沉淀；鹽溶液造成細(xì)胞壁的某種改變增強(qiáng)了對DNA的結(jié)合。當(dāng)DNA加入到經(jīng)過處理的細(xì)胞時，會吸附在細(xì)胞外表面并保持這一狀態(tài)，這一步驟并不會發(fā)生DNA轉(zhuǎn)化入細(xì)胞的反應(yīng)(圖5-3)。DNA真正進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞，需要經(jīng)過一次短暫的升高溫度到42℃的刺激反應(yīng)，但為什么這種熱休克法能夠有效促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化還不為人們所知。4.1.3對轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇盡管進(jìn)行了前述處理，轉(zhuǎn)化效率仍然很低。必須找到一些方法，能夠辨別出轉(zhuǎn)化細(xì)胞。辦法：使用攜帶有選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒。選擇性標(biāo)記：給轉(zhuǎn)化細(xì)胞帶來新的性質(zhì)的基因，而這樣的性質(zhì)是未轉(zhuǎn)化細(xì)胞所不具備的。例子：pBR322的氨芐青霉素抗性基因。轉(zhuǎn)化實驗后：只有吸收了質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞才表現(xiàn)出ampRterR的性質(zhì)，并在含有氨芐青霉素或四環(huán)素的瓊脂培養(yǎng)基上形成菌落；未發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞仍然是ampSterS，不能夠在選擇性培養(yǎng)基上生成菌落。因此，轉(zhuǎn)化細(xì)胞和未轉(zhuǎn)化細(xì)胞得到了區(qū)分。絕大多數(shù)質(zhì)?？寺≥d體，都至少攜帶一種賦予宿主細(xì)胞耐抗生素的基因，通過將這些宿主細(xì)胞鋪到含有相關(guān)抗生素的瓊脂培養(yǎng)基上來達(dá)到對轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選。需要記住的是，對抗生素的耐藥性不能僅僅歸因于轉(zhuǎn)化細(xì)胞中質(zhì)粒的存在。質(zhì)粒中的抗藥基因必須能夠被表達(dá)，從而合成出把抗生素脫氧化的酶。抗藥性基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)化后立刻開始進(jìn)行，但是在細(xì)胞能夠包含足夠的消除抗生素毒性作用的酶之前，還需要幾分鐘的時間。所以，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌不能在熱休克處理后立刻鋪到選擇性培養(yǎng)基上，而是要首先加入一個小體積的不含抗生素的液體培養(yǎng)基中，并培育一段較短的時間，質(zhì)粒復(fù)制和表達(dá)就能夠開始進(jìn)行。這樣在細(xì)胞被鋪到選擇性培養(yǎng)基上，并遭遇到抗生素時，它們已經(jīng)合成出了足夠的耐藥性酶，來保證自己能夠存活于選擇性培養(yǎng)基中。4.2重組體的鑒定如何區(qū)分?jǐn)y帶重組DNA分子的菌落和含有自連接載體分子的菌落？因為絕大多數(shù)插入DNA片段的過程都不可避免地會破壞質(zhì)粒分子中原本存在的某個基因的完整性（插入失活）。所以只要鑒別出該基因在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中已經(jīng)失去活性，即不再表現(xiàn)出該基因的性質(zhì)，就可以確定重組體的存在。4.2.1pBR322重組體的篩選-

抗生素抗性基因的插入失活在插入新的DNA片段前，pBR322有一些獨(dú)一無二的限制性位點(diǎn)，可以打開載體分子，供DNA片段插入。如：僅有一個BamHI位點(diǎn)，位于編碼耐四環(huán)素藥性的基因內(nèi)部。在BamHI位點(diǎn)插入DNA片段的重組pBR322分子，就不再能賦予其宿主細(xì)胞耐四環(huán)素的性質(zhì)，這樣該基因就被插入的外源基因破壞。含有重組pBR322分子的細(xì)胞依然能夠?qū)Π逼S青霉素保持耐藥性，但對四環(huán)素變得敏感(ampRterS)。方法：1.轉(zhuǎn)化后細(xì)胞鋪到含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)到出現(xiàn)菌落。所有這些菌落都是轉(zhuǎn)化細(xì)胞(未轉(zhuǎn)化細(xì)胞是ampS，不能夠在選擇培養(yǎng)基上產(chǎn)生菌落)，但只有一小部分包含重組pBB322分子；絕大多數(shù)是正常的自連接質(zhì)粒。2.為了鑒別出這些重組體，菌落被復(fù)制培養(yǎng)(replicaplated)到含有四環(huán)素瓊脂培養(yǎng)基上。生長出來的菌落：攜帶有正常的pBR322質(zhì)粒而沒有插入DNA；沒有生長的菌落含有重組體：ampRterS一旦知道了重組體的位置，可以從最初的氨芐青霉素瓊脂平板上分離樣品。4.2.2插入失活不僅僅針對抗生素抗性一些重要質(zhì)粒載體使用的是不同的篩選系統(tǒng)。pUC8：攜帶有耐氨芐青霉素基因和lacZ'基因。

lacZ'基因編碼β-半乳糖苷酶的一部分。利用pUC8作載體，利用的是lacZ'基因的插入失活，重組體不能合成β-半乳糖苷酶而被鑒別出來。β-半乳糖苷酶：是一系列將乳糖降解成為葡萄糖和半乳糖的酶中的一種。通常由lacZ'基因編碼，該基因位于大腸桿菌染色體上。一些大腸桿菌菌株攜帶有經(jīng)過修飾的lacZ'基因，該基因編碼的蛋白相對于正常的lacZ'基因編碼的β-半乳糖苷酶缺失了α-肽段的一部分。這些突變體只能夠在其俘獲一個攜帶有細(xì)菌基因組缺失的lacZ'基因的質(zhì)粒時，比如說pUC8，才能夠合成β-半乳糖苷酶。判斷β-半乳糖苷酶是否存在：化學(xué)方法：乳糖被分解成葡萄糖和半乳糖；檢測酶所催化的一個反應(yīng)。X-gal是乳糖相似物，該物質(zhì)能夠被β-半乳糖苷酶降解并生成深藍(lán)色的產(chǎn)物。如果X-gal(以及β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)物IPTG)和氨芐青霉素一起被加入到瓊脂平板中：不含重組體的菌落，即能夠產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的細(xì)胞就將被標(biāo)記成藍(lán)色；含有重組體的菌落因為lacZ‘基因被破壞而無法合成β-半乳糖苷酶，將保持白色菌斑。這一系統(tǒng)被稱作乳糖篩選(Lacselection)。4.3將噬菌體DNA引入細(xì)菌細(xì)胞將一個用噬菌體載體構(gòu)建的重組DNA分子引入細(xì)菌細(xì)胞，有兩種不同的方法：

轉(zhuǎn)染；體外包裝。4.3.1轉(zhuǎn)染這一過程與轉(zhuǎn)化是相同的，區(qū)別：使用的質(zhì)粒載體換成了噬菌體。像質(zhì)粒那樣，將純化的噬菌體DNA或重組噬菌體分子與感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞混合，并通過熱休克將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞中。4.3.2體外包裝λDNA分子與成熟的λ噬菌體顆粒相比，對培養(yǎng)中的細(xì)菌細(xì)胞的侵染，沒有那么高效。因此，如果λ分子能夠在試管中被包裝到λ噬菌體的頭尾結(jié)構(gòu)中，將變得非常有用。包裝需要一定數(shù)量的由λ基因組編碼的蛋白質(zhì)，這些蛋白可以從缺陷性λ噬菌體侵染的菌株中高濃度制得。所以，需要用到兩個不同的體系。1.在單菌株體系中，缺陷性λ噬菌體在C0S位點(diǎn)有一個突變，因此內(nèi)切酶不能識別C0S位點(diǎn)，不能切割λ連環(huán)體，造成缺陷性噬菌體無法完成復(fù)制。但它能夠直接合成包裝所需的全部蛋白。從細(xì)菌中收集蛋白并純化，隨后用于重組λDNA分子的體外包裝。2.第二個體系中需要用到兩個缺陷性λ噬菌體株。兩個噬菌體株都在編碼噬菌體蛋白外殼的某一組分基因帶有一個突變位點(diǎn)：一個突變發(fā)生在D基因上；另一個突變發(fā)生在E基因上。由于突變基因造成的產(chǎn)物缺乏，導(dǎo)致完整的噬菌體衣殼結(jié)構(gòu)無法形成，同時其他的噬菌體衣殼蛋白不斷積累。所以，任何一個噬菌體株都無法完成在大腸桿菌中的侵染循環(huán)。如果使用兩種細(xì)胞，一種被缺乏D基因的噬菌體侵染，另一種被缺乏E基因的噬菌體侵染，通過將兩種細(xì)胞的裂解物混合在一起，就制得了體外包裝的混合物?，F(xiàn)在的混合物包含了所有必需的成分，能夠?qū)⒅亟Mλ分子包裝到成熟的噬菌體顆粒中。通過這兩個體系，只需要把包裝后的分子加入到細(xì)菌培養(yǎng)物中，就使得正常的λ侵染過程得以發(fā)生，進(jìn)而可以把重組DNA分子引入到大腸桿菌細(xì)胞中。4.3.3噬菌體侵染的可視化形式噬菌體侵染循環(huán)的最后一個階段是細(xì)胞溶解。如果加入噬菌體后，或在噬菌體DNA侵染發(fā)生后，被侵染細(xì)胞被立刻引入固體瓊脂培養(yǎng)基，細(xì)胞溶解就能夠以噬菌斑(plaque)的形象在菌苔上被觀察到。每個噬菌斑都是一個噬菌體溶解細(xì)胞后留下的空白區(qū)域，能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移并最終消化鄰近的細(xì)胞。λ噬菌體和M13噬菌體都能夠形成噬菌斑。λ噬菌體：真正的噬菌斑，因為細(xì)胞溶解；M13：噬菌斑稍有不同，因為M13無法溶解宿主細(xì)胞，導(dǎo)致被侵染細(xì)胞生長速度下降。這種下降足以在菌苔上產(chǎn)生一個相對空白的區(qū)域，和正常噬菌斑一樣清晰可見。λ和M13載體的最終結(jié)果是得到一塊存在著噬菌斑的瓊脂平板。每個噬菌斑都是由單一的被轉(zhuǎn)染或被侵染細(xì)胞形成，含有相同的噬菌體顆粒。這些噬菌體顆粒可能由自連接的載體分子或重組分子所組成。4.4重組噬菌體的鑒別4.4.1噬菌體載體的lacZ'基因插入失活所有M13克隆載體，以及部分λ克隆載體，攜帶有l(wèi)acZ'基因的拷貝。正如質(zhì)粒載體pUC8那樣，在lacZ'基因內(nèi)插入新的DNA會導(dǎo)致β-半乳糖苷酶合成失效。重組體能夠通過將細(xì)菌細(xì)胞鋪在X-gal瓊脂培養(yǎng)基上鑒別出來：包含正常噬菌體的噬菌斑是藍(lán)色；重組體噬菌斑是無色透明。4.4.2λcI基因的插入失活一些類型的λ克隆載體在cI基因上有獨(dú)一無二的限制性位點(diǎn)(圖2-9上圖譜位置38)。cI基因的插入失活導(dǎo)致噬菌斑形態(tài)上的改變:正常的噬菌斑顯得“混濁”；

cI基因被破壞的重組體形成的噬菌斑“清澈”。對于有經(jīng)驗的觀察者來說，這種不同是相當(dāng)明顯的。4.4.3使用Spi表型的篩選在正常情況下，λ噬菌體不能夠侵染那些已經(jīng)整合了噬菌體P2的大腸桿菌細(xì)胞。因此λ被稱作Spi(P2prophageinhibition)。一些λ克隆載體被設(shè)計成，外源DNA的插入會把載體從Spi+轉(zhuǎn)變成Spi-，使得重組體能夠侵染攜帶P2前噬菌體的細(xì)胞。在克隆實驗中，攜帶P2前噬菌體的細(xì)胞作為這些載體的宿主；只有重組體是Spi-，因此也只有重組體才能夠產(chǎn)生噬菌斑。4.4.4基于入基因組大小的篩選組裝成熟噬菌體顆粒的包裝體系，只能夠?qū)⒋笮?7到52kb的DNA分子插入到噬菌體頭部結(jié)構(gòu)中。任何小于37kb的DNA分子都不被包裝。許多λ載體通過刪除λ噬菌體DNA分子上大的部分而構(gòu)建出來，因此長度小于37kb。這些載體只有在額外DNA插入，使整個基因組長度達(dá)到或超過37kb后，才能夠被包裝到成熟噬菌體顆粒中。因此，只有重組的噬菌體才能夠進(jìn)行復(fù)制。4.5非細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化如果酵母、真菌、動物和植物細(xì)胞被用作基因克隆的宿主，那么有必要開發(fā)出將DNA引入這些細(xì)胞的方法。盡管用氯化鋰或醋酸鋰處理會增強(qiáng)酵母細(xì)胞對DNA的吸收，并被頻繁地使用在釀酒酵母的轉(zhuǎn)化中，但通常來說，浸入鹽水促進(jìn)轉(zhuǎn)化只對少數(shù)細(xì)菌有效。因而，對絕大多數(shù)更高等的生物來說，需要使用更加復(fù)雜的方法。4.5.1單個細(xì)胞的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后的動物細(xì)胞，可以很容易的被轉(zhuǎn)化，尤其當(dāng)DNA在磷酸鈣作用下在細(xì)胞表面沉淀時更是如此。對于其他類型的細(xì)胞，解