第二章 工業(yè)微生物4

（五）分子育種1.過量表達（overexpression)目的：（1）直接生產(chǎn)酶（2）強化代謝途徑方法：（1）游離載體，自主復制，拷貝數(shù)高，不穩(wěn)定（2）整合型載體，整合到染色體，穩(wěn)定，整合如何做到高拷貝？重復順序，核糖體RNA基因(rDNA)、轉座子。2.基因敲除（knockout）（基因缺失，破壞）（1）基因功能分析（2）菌種選育3.基因定點突變（site-directedmutation)

（1）替換（2）插入（3）缺失4.Knockin;knockoutandknockin定點突變5.基因的直接進化(directedevolution)突變

易錯PCR（errorpronePCR

），正突變庫的建立重組

DNAshuffling

，將多個正突變集合到一起篩選

highthrough-put，基因突變庫的篩選

步驟：

在分子水平上，對目標基因直接處理，然后通過高通量的篩選方法，提高目標蛋白的性能。易錯PCRXXXX

XXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXXXXXXXXXXXXXXX

FragmentReassembleSelectbestwithDNAseIfragmentsrecombinantsRepeatformultiplecyclesDNAshufflingDNAShuffling:指DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上進行有性重組(SexualRecombination)。項目進化速度進化對象進化周期影響對象突變效率常規(guī)定向進化緩慢進化整個基因組多年完整基因組低DNAShuffling快速進化特定基因/操縱子/病毒幾天部分基因組高DNAShuffling與常規(guī)定向進化的比較類型示例特性活性增加倍數(shù)潛在應用領域抗體人源抗體親和性400生物制藥酶天冬氨酸轉氨酶催化特異性10，000生物制藥β-內酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草桿菌蛋白酶E耐熱性65℃耐熱時間17200工業(yè)酶細胞因子人類干擾素抗病毒285，000基因治療腫瘤抑制因子P5337℃半衰期12基因治療代謝途徑砷酸鹽代謝途徑砷酸鹽解毒40生物制藥汞代謝途徑汞解毒12生物制藥部分DNAShuffling技術的研究成果脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPLA光學拆分選擇性(%)231577581905次錯位PCR2次定點突變Reetz(1997)Liebeton(2000)6.基因組重排（genomeshuffling）多親株多輪原生質體融合篩選的有效性二、微生物代謝工程的進展遺傳修飾設計策略代謝分析出發(fā)菌株高效生產(chǎn)菌株代謝工程的基本思路

設計策略是基礎遺傳修飾是關鍵設計策略：正向(Constructive)代謝工程

1991年在Science上正式提出，基本思想是：根據(jù)已有的遺傳和生化知識，找出限速步驟，進行遺傳操作正向代謝工程：重新分配中心途徑代謝流PyruvateLactateSugarldhNADHNAD+XNADHNAD+L-alaninealadfromBacillusNH4+AlanineracemaseX乳酸乳球菌以同型發(fā)酵方式，將95%以上的葡萄糖轉化為L-乳酸將乳酸脫氫酶（LDH）敲除，然后再表達丙氨酸脫氫酶，并敲除丙氨酸消旋酶，可以將原來到L-乳酸的碳流重新分配到L-丙氨酸（甜味劑）實現(xiàn)同型乳酸發(fā)酵到同型丙氨酸發(fā)酵。設計策略：反向(Inverse)代謝工程1996年首次提出，三個步驟：1.獲得預期的表型2.確定其基因型3.選擇工業(yè)菌株并對其相應基因進行遺傳操作，以期獲得同樣的表型反向代謝工程：基因組測序發(fā)現(xiàn)新靶點日本學者對兩株谷氨酸棒桿菌（一株是生長較差但能高產(chǎn)賴氨酸的突變株、另一株為生長良好的野生型）進行全基因組測序找出突變株與野生型不同、且有可能影響賴氨酸生產(chǎn)的突變基因然后將這些突變導入野生型，結果獲得了迄今為止最高水平的賴氨酸生產(chǎn)率3gL-1h-1這是利用組學進行反向代謝工程研究的第一個例子設計策略：進化(Evolutionary)代謝工程

基因組重排于2002年正式提出引發(fā)NatureBiotechnol.評論進化代謝工程：泰樂菌素菌種改良自然適應和進化代謝工程遺傳修飾：基因敲除DNAGene1Gene2Gene3Enzyme1Enzyme2Enzyme3ABCDADNAXXX遺傳修飾：基因表達DNAGene1Gene2Gene3Enzyme1Enzyme2Enzyme3ABCDADNAXXXGene4Enzyme4E代謝分析：代謝網(wǎng)絡模型和代謝組學JochenForsteretal.GenomeRes.2003;13:244-253代謝分析：代謝通量分析E’??????A?C?EABCDEv1v2v3v4v5v6v7ABCDEMetaboliteidentificationPathwayreconstructionMetabolicfluxanalysisv1?v3??v6v7其基本原理是假設胞內代謝物濃度都處于擬穩(wěn)態(tài)，根據(jù)物質平衡得到一系列關于通量的數(shù)學方程，然后通過測定其中一些通量的變化，來獲得整個代謝網(wǎng)絡的通量分布[5]。MFA已在許多微生物的代謝工程中得到應用。代謝分析：互相作用關系綜合設計策略：1,3-丙二醇3-磷酸甘油醛丙酮酸葡萄糖TCA循環(huán)磷酸二羥丙酮3-磷酸甘油甘油酵母的甘油途徑大腸桿菌自身的代謝途徑1,3-丙二醇3-羥基丙醛肺炎桿菌的1,3-丙二醇途徑

修飾了>70個基因，最后工程菌中有18個基因被敲除或過量表達

1,3-丙二醇產(chǎn)量135g/L，生產(chǎn)率3.5g/L，h1A（1）B（2）2A（1）B（2）C（3）通用轉錄機器工程第三節(jié)工業(yè)生產(chǎn)菌種的復壯與保藏一、退化現(xiàn)象及原因二、復壯三、菌種的保藏一、工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化現(xiàn)象及原因什么是菌種退化?表現(xiàn)：產(chǎn)量性狀及與產(chǎn)量性狀相關的形態(tài)上和生理上的變化抗不良條件能力的下降，如抗噬菌體，耐溫性能等量變到質變的逐漸演化過程（一）菌種退化的原因基因突變（回復突變）分離現(xiàn)象Letter:Genome-widenon-mendelianinheritanceofextra-genomicinformationinArabidopsisSusanJ.Lolle,JenniferL.Victor,JessicaM.YoungandRobertE.Pruittdoi:10.1038/nature03380回復突變（二）菌種退化的防治1.菌種選育方面：使用孢子或單核菌株，避免對多核菌株進行處理較高的誘變劑量，減少回復突變充分的中間培養(yǎng)及分離純化2.控制傳代次數(shù)3.創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件4.利用不易衰退的細胞傳代，孢子5.有效的菌種保藏方法傳代次數(shù)每代斜面保存時間/d回復子比例

腺苷產(chǎn)量/(g/L)1（147）1/4.5×10613.22（133）（14）1/2.4×10614.96（47）（3）（9）（3）（71）（14）1/2.2×10510.77（47）（3）（9）（3）（13）（58）（14）1/3.5×10613.19（47）（3）（9）（3）（13）（8）（3）（47）（14）1/5.3×1038.112(47)（3）（9）（3）（13）（8）（3）（4）（14）（6）（6）（31）1/1.0×1037.4二、生產(chǎn)菌種的復壯純種分離淘汰已衰退的個體選擇合適的培養(yǎng)條件三、工業(yè)生產(chǎn)菌種的保藏保藏的意義：存活健在避免退化，保證高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)保證研究結果良好的重現(xiàn)性基本措施降低營養(yǎng)成分，低溫，干燥，缺氧等條件，使其處于生長停滯或休眠狀態(tài)常用保藏方法斜面保藏和穿刺保藏（好氣性）沙土管干燥保藏產(chǎn)孢子的絲狀真菌或放線菌，或產(chǎn)芽孢的細菌真空冷凍干燥保藏方法安瓿管的處理保護劑的使用，目前國內常用脫脂乳和蔗糖，國外尚有運用動物血清等的。低溫保藏普通冷凍保藏技術(-20℃)超低溫冷凍保藏技術(-60一-80℃)液氮冷凍保藏技術保護劑的的使用，甘油，二甲基亞砜不同保藏方法的比較菌種保藏的注意事項菌種在保藏前所處的狀態(tài)菌種保藏所用的基質操作過程對細胞結構的損害國內外菌種保藏機構國外：ATCC（AmericanTypeCultureCollection）

ATCCisaglobalbioresourcecenterthatstoresanddistributesbiologicalmaterialssuchascelllines,bacteria,animalandplantvirusesandantisera,fungi,protozoa,algae,clonesandothermoleculargenomicmaterialsATCC(AmericanTypeCultureCollection）美國典型菌種保藏中心

ATCC主要從事農業(yè)、遺傳學、應用微生物、免疫學、細胞生物學、工業(yè)微生物學、菌種保藏方法、醫(yī)學微生物學、分子生物學、植物病理學、普通微生物學、分類學、食品科學等的研究。

該中心保藏有藻類111株，細菌和抗生素16865株，細胞和雜合細胞4300株，絲狀真菌和酵母46000株，植物組織79株，種子600株，原生動物1800株，動物病毒、衣原體和病原體2189株，植物病毒1563種。

另外，該中心還提供菌種的分離、鑒定及保藏服務。該中心保藏的菌種可出售。ARSCultureCollection-NRRL/WelcometothenewARS(NRRL)CultureCollectionwebsite.TheCollectionishousedwithintheMicrobialGenomicsandBioprocessingResearchUnitattheNationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch(NCAUR)inPeoria,Illinois.ThiswebsitecontainsinformationspecifictotheARSCultureCollection,butadditionalinformationregardingtheResearchUnitandNCAUR---NorthernRegionalResearchLaboratoryAgriculturalResearchServiceCultureCollection

NationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch

Peoria,IllinoisUSANRRL(AgriculturalResearchServiceCultureCollection)美國農業(yè)研究菌種保藏中心

NRRL是由美國農業(yè)部農業(yè)研究中心支持的政府性質的菌種保藏中心。主要從事農業(yè)、應用微生物、基因工程、工業(yè)微生物、菌種保藏方法、環(huán)境保護、分子生物學、食品安全、普通微生物、分類學的研究。

該中心保藏有細菌10500株，真菌45000株，酵母14500株，放線菌9500株。

另外，該中心還提供細菌、真菌、酵母的鑒定服務。

CBS(CentraalbureauvoorSchimmelcultures)荷蘭微生物菌種保藏中心網(wǎng)址：www.cbs.knaw.nl/.CBS是半政府性質的主要保藏真菌、酵母菌種保藏中心。

該中心主要從事菌種保藏方法、分類學、分子生物學、醫(yī)學微生物學等的研究。

該中心保藏有真菌35000株、酵母5500株。該中心保藏的菌種可出售。NBRC33023

AspergillusnigervanTieghemSynonym:Aspergilluscinnamomeus,Aspergillusnigervar.altipes,Aspergillusschiemanni

←IFO33023←CBS554.65

=ATCC16888=BCRC31130=CBS554.65=IAM15058=IMI50566=IMI50566ii=JCM10254=JCM1864=NRRL326=RIB2641

Source:tannin-gallicacidf