第5章 目的基因制取

第五章目的基因制取在已知基因部分核苷酸序列或全部核苷酸序列的情況下，基因的制備方法主要可分為兩大類：

化學合成法生物制備法基因文庫法、

cDNA文庫法

PCR法等。

就化學本質而言，基因是一段具有特定生物功能的核苷酸序列。如果知道了基因的分子結構，就可以進行基因的化學合成。有關DNA的化學合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、亞磷酸酰胺法及固相亞磷酸酰胺法。磷酸二酯法是最初發(fā)明的化學合成基因的方法，而固相亞磷酸酰胺法是目前絕大部分DNA自動合成儀所使用的方法。由于現代科學技術的發(fā)展，DNA的化學合成已經廣泛采用DNA自動合成儀進行。1.化學合成法

基因的化學合成法主要用于PCR擴增引物、核酸測序引物、核酸雜交探針和合成人工接頭等核苷酸片段的合成,隨著合成生物學的發(fā)展，近來也用于全基因合成。1.1磷酸二酯法將二個分別在5′-或3′-末端帶有適當保護基的脫氧單核苷酸連接起來，形成一個帶有磷酸二酯鍵的脫氧二核苷酸將脫氧二核苷酸5′-或3′-末端脫保護，與另一個3′-或5′-末端脫保護的脫氧二核苷酸進行第二次縮合依次進行循環(huán)，直至合成全長的DNA分子A1.2固相亞磷酰胺法原理：將所要合成的寡聚核苷酸鏈的3′-末端先與一個不溶性載體，如多孔玻璃珠（CPG）連接，然后依次從3′-5′的方向將核苷酸單體加上去，所使用的核苷酸單體的活性官能團都是經過保護的，具體的合成和延伸過程：脫去CPG載體上第一個核苷酸的5‘端保護基（DMTrO)第二個核苷酸5‘端被DMTrO保護，3’端被亞磷酰胺保護，隨后3‘端被四氮唑活化劑活化，和第一個核苷酸發(fā)生縮合，脫去四唑基團。沒有參與縮合反應的第一個核苷酸的5’端被乙?；忾]脫氧核苷酸二聚體的3價磷被碘氧化成5價磷，形成穩(wěn)定的二聚體。二聚體5’端脫DMTrO，加入第三個被活化的核苷酸，進行循環(huán)。便于自動化操作，通過計算機控制進行基因合成DMTrO:二甲氧基三苯甲基三氯乙酸亞磷酸三酯磷酸三酯循環(huán)合成結束后脫去P上連的保護基團，并與固相載體脫離，進一步純化化學合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150～200bp，而絕大多基因的大小超過了這個范圍，因此，需要將寡核苷酸適當連接組裝成完整的基因。

方法1是先將寡聚核苷酸激活，帶上必要的5’-磷酸基團，然后與相應的互補寡核苷酸片段退火，形成帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸片段，再用T4DNA連接酶將它們彼此連接成一個完整的基團或基團的一個大片段。

方法2是將兩條具有互補3’末端的長的寡核苷酸片段彼此退火，所產生的單鏈DNA作為模板在大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段作用下，合成出相應的互補鏈，所形成的雙鏈DNA片段，可經處理插入適當的載體上。

其它方法：多片段重疊延伸PCR

序列已知；化學合成的寡核苷酸片段長度有限，經基因組裝才能合成較大的目的基因，而這往往使基因制備難度加大；化學基因合成比較昂貴。（約3元/bp)

1.3基因芯片法成本可降到0.01美元/bp限制化學法合成基因的因素：、DNAArrayManufacturingProcessVeryLarge-ScaleImmobilizedPolymerSynthesis(VLSIPS)TreatsubstratewithchemicallyprotectedlinkermoleculesSelectivelyexposearraysitestolightFlushchip’ssurfacewithsolutionofprotectedA,C,G,TRepeatlasttwostepsuntildesiredprobesaresynthesized照相平板印刷技術ProbeSynthesisarrayprobesA3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotideDepositionSequenceACGAMask1AAAAAProbeSynthesisarrayprobesA3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotideDepositionSequenceACGCMask2CCCCCCAAAAAProbeSynthesisarrayprobesA3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotideDepositionSequenceACGGMask3CCCCCCAAAAAGGGGGG2.基因組文庫法基因組文庫法是一種直接從基因組中分離目的基因的方法?；蚪M文庫（genelibrary或genebank），是指匯集某一基因組所有DNA序列的重組DNA群體。高等真核生物染色體基因組文庫通常是以λ噬菌體作為載體構建的，有時也可以柯斯質粒作為載體構建。通常基因組DNA被超聲波或內切酶處理成隨機處理成大小不同的片段，這些片段和載體連接后制備成基因組文庫，用于測序、拼裝。也稱為“鳥槍法”。2.1基因文庫的大小一個基因組文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數目：N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫包含了整個基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片斷的平均長度占整個基因組DNA的百分數,其倒數為最低克隆數N：所需的重組載體數（克隆數）,一般為最低克隆數的5~10倍影響因素：基因組規(guī)模、載體容量★利用λ噬菌體載體構建基因組文庫的一般操作程序如下：①選用識別序列均為4個核苷酸的兩種限制性內切核酸酶，對從某一高等真核生物組織細胞中提取的染色體基因組DNA

進行部分酶解，得到10~30kb的DNA限制性片段，利用凝膠電泳法等從中分離出大小為20kb左右的隨機片段群體②選用適當的限制性內切核酸酶酶解λ噬菌體載體DNA。③經適當處理，將基因組DNA限制性片段與λ噬菌體載體進行體外重組。④利用體外包裝系統(tǒng)將重組體包裝成完整的顆粒。⑤以重組噬菌體顆粒侵染大腸桿菌，形成大量噬菌斑，從而形成含有整個DNA的重組DNA群體，即文庫。2.2基因組文庫構建過程★具備了文庫，就可以適當的目的基因片段作探針，利用高密度的噬菌斑或菌落原位雜交技術，從大量的噬菌斑或菌落中篩選出含有目的基因的重組體的噬菌斑或菌落，再經過擴增提取其中的重組體，最后即可獲得所需要的目的基因片段。對于某些營養(yǎng)物質的合成基因的分離，可以將文庫轉化該營養(yǎng)的缺陷型菌株，在基本培養(yǎng)基中進行篩選。高等真核生物基因組DNA文庫比其cDNA文庫大得多，相關工作量同樣大得多。在真核生物基因組中合有大量的間隔序列或內含子，大腸桿菌不能從真核生物基因的初級轉錄本中去除間隔序列，即不能表達真核生物DNA。而在真核生物成熟mRNA中已不存在間隔序列（已在拼接過程中被去除），以真核生物成熟mRNA為模板，逆轉錄而成的cDNA可被大腸桿菌表達。因此，在基因工程中，cDNA文庫法是從真核生物細胞中分離目的基因的常用方法。3cDNA文庫法cDNA文庫:是指匯集以某生物成熟mRNA為模板逆轉錄而成的cDNA序列的重組DNA群體。N=ln(1-p)ln(1-1/n)一個cDNA文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數目：1/n：每種低豐度mRNA分子占總mRNA分子的比值低豐度：不多于14個拷貝/細胞，對于真核細胞，占總mRNA質量的30%，約11000種。則1/n=30%（1/11000)，n為最低克隆數3.1cDNA文庫的大小3.2cDNA基因文庫的構建過程總RNA（totalRNA）提取mRNA分離純化逆轉錄克隆篩選★①總RNA提?。弘饮}-氯化銫密度梯度離心法酸性胍-酚氯仿抽提法

Trizol法（異硫氰酸胍+苯酚）

Trizol處理、氯仿抽提、收集水相、異丙醇沉淀異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的變性解離，使RNA與蛋白質分離，并將RNA釋放到溶液中。（也破壞RNase）酸性苯酚可促使RNA進入水相氯仿可抽提酸性的苯酚，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質。

硅膠膜特異性吸附的離心柱提取法采用一系列裂解液裂解組織、細胞，抑制RNA酶，釋放RNA，調節(jié)結合條件之后，硅膠膜特異性吸附RNA，多次漂洗去除DNA、蛋白質及其他雜質，最后經低鹽溶液洗脫RNA

在高鹽（如3-5M鹽酸胍）低PH值（5.0-6.5）狀態(tài)下，硅膠膜專一性地吸附DNA；而在低鹽（TE或者2.5mMTris-HCL）或水溶液狀態(tài)下，DNA被洗脫下來注意事項：

RNase酶在環(huán)境中普遍存在，要嚴格防止污染：全程需戴手套操作玻璃器皿200℃處理2小時以上不耐高溫物品（槍頭、離心管等）用DEPC（0.1%焦碳酸二乙酯）浸泡處理，然后沖凈或煮沸去除DEPC。（包括試劑）破碎細胞需使用強變性劑：胍、酚等★RNA流經利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。②

mRNA的分離純化纖維素柱層析法原理：當RNA流經oligo(dT)纖維素柱時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上，然后逐漸降低鹽濃度洗脫，在低鹽溶液或蒸餾水中，mRNA被洗下。經過兩次oligo(dT)纖維素柱，可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上★原核細胞mRNA分純

polyA加尾，釀酒酵母的polyA多聚酶可以特異性的對mRNA加尾，而對sRNA無法加尾逆轉錄23/16sRNA,加入RNase，DNaseI處理雜交鏈，23/16sRNA及DNA均被破壞，過柱富集mRNA分子磁珠法原理：

生物素標記OligoT，親和素標記磁珠（生物素和親和素間具有高度親和力）。實驗時生物素標記的OligoT與mRNA的polyA高效雜交形成復合體，此復合體又與標有親和素的磁珠結合。用磁性分離架就可以將這堆復合物分離出來。最后用無RNase去離子水將mRNA從復合物中洗脫下來即☆③逆轉錄自身引導法（S1核酸酶降解法）

置換合成法（RNaseH處理）cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’mRNAcDNA第一鏈3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’5’DNAligase去引物★AMV:鳥類成髓細胞白血病病毒的逆轉錄酶MLV:莫洛尼鼠的白血病病毒的逆轉錄酶隨機引物法

6聚核苷酸隨機引物引發(fā)cDNA第二鏈合成末端轉移法（同聚物引導法）利用末端轉移酶在cDNA第一鏈3‘端加同聚核苷酸尾巴（如多聚G），以多聚C為引物合成第二鏈（在多聚C的5’端可以加入酶切位點，利于后續(xù)克隆操作）?？寺『Y選方法：同基因組文庫缺點：由于克隆過程經多步分離、純化，低豐度cDNA可能損失，被克隆的幾率很?。ń柚鶳CR解決，P177圖）

mRNA容易被部分降解，很難得到全長cDNA.（合成全長cDNA)★3.3全長cDNA文庫的構建及cDNA克?。?）RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是基于PCR技術由已知的一段cDNA序列,通過往兩端延伸擴增從而獲得完整的3'端和5'端的方法.又被稱為錨定PCR(anchoredPCR)和單邊PCR(onesidePCR)。

PCR全長序列★以oligo(dT)l7和一個35bp的接頭(dT17-adaptor,錨定引物)為引物進行反轉錄，接頭序列中稀有限制酶的酶切位點。這樣就在未知cDNA的3’末端接上了一段特殊的接頭序列。利用已知的部分cDNA序列設計基因特異引物GSP，它)與少量(-)cDNA退火并延伸，產生互補的第二鏈(+)cDNA。利用GSP和接頭引物進行PCR循環(huán)即可擴增得到cDNA雙鏈。擴增的特異性取決于特異引物與目標cDNA分子互補能力．而用接頭引物來取代dT17一adaptor則可阻止長(dT)堿基引起的錯配?？稍O計嵌套引物進行PCR擴增，以提高低豐度cDNA擴增的特異性（見P179圖）GSP:genespecificprimerGSP★3’RACE設計了一個用于逆轉錄的基因特異引物GSP-RT，進行逆轉錄，合成（-）cDNA。用RNase降解RNA，然后用末端轉移酶在（-）cDNA的3‘端加poly(A或C)尾再用錨定引物合成第二鏈(+)cDNA,接下來與3’RACE過程相同。用接頭引物和位于延伸引物上游的基因特異性引物GSP進行PCR擴增。5’RACE★CIAP(牛小腸磷酸酶)除去5’磷酸，非全長mRNA的5‘端無法進行連接，而全長分子有5’-cap的保護TAP（煙草酸焦磷酸酶）去除5’-cap，加入錨定引物，在RNA連接酶作用下將其連在全長mRNA5‘端嵌套PCR進行5’RACE連接酶介導的RACE★通常的克隆方法是同時使用一個切點位于接頭序列上的限制性內切酶和一個切點位于擴增區(qū)域內的內切酶。由于大多數非特異性擴增的cDNA產物不能被后一個限制性內切酶酶切，因而也就不會被克隆．從而增加了克隆的選擇效率。也可在基因特異性引物的5’端摻人一個限制性內切酶的酶切位點的方法來克隆。最后，從兩個有相互重疊序列的3’和5’RACE產物中獲得全長cDNA。最后通過分析RACE產物的3’和5’端序列，合成相應引物來擴增mRNA的反轉錄產物，從而獲得全長cDNA。優(yōu)點：無需提純mRNA,可直接從總RNA中得到目的基因全長序列,無需做克隆文庫，只需做5‘端目的產物和3’端目的產物的亞克隆缺點：5’端的編碼區(qū)經常會由于反轉錄過程的不徹底而丟掉,特別是由于有大的轉錄物或者存在復雜的二級結構時連接反應通常效率很低,不能保證PCR的高成功率經常出現非特異性擴增產物★（2）載體引物法

RNA經CIAP,TAP,RNA連接酶處理連上5‘端錨定引物后，加入具有多聚T尾巴的載體引物（即整個載體作為銜接體）反轉錄后用5’端錨定引物合成第二鏈，直接酶切處理進行自連接，轉化宿主細胞得到全長cDNA文庫。P183圖（3）固相支持物法高碘酸鈉處理5’cap后，可以在5’cap接上生物素，因此全長mRNA全部有生物素標記逆轉錄后用RNaseI水解單鏈核酸（RNA-DNA雜交雙鏈不被水解）用親和素包裹的磁性珠作為固相支持物，結合雜交鏈，得到全長cDNA第一鏈

184圖8.18☆☆(4).SMART技術SMART(SwitchingMechanismAt5‘endoftheRNATranscript)，模板轉換機制原理：逆轉錄酶以mRNA為模板合成cDNA，在到達mRNA的5‘帽子時會在cDNA3‘末端加上幾個C，在逆轉錄時加入3’末端帶Oligo（dG）的SMART引物，它與合成cDNA末端突出的幾個C配對后形成cDNA的延伸模板，逆轉錄酶會自動轉換模板，以SMART引物作為延伸模板繼續(xù)延伸cDNA單鏈直到引物的末端，這樣得到的所有cDNA單鏈的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二鏈后可以利用通用引物進行擴增。由于只有5'帽子結構的mRNA才能利用這個反應得到能擴增的cDNA，因此擴增得到的cDNA就是全長cDNA。★★capcapPolyCPolyG利用逆轉錄酶內源的末端轉移酶活性，只要單管，一步即可完成，不需要額外的cDNA抽提純化或者沉淀，或者額外的酶反應，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的TotalRNA就可以得到高質量、高產量的cDNA庫，更重要的是得到的cDNA能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度，可以應用于直接擴增基因、構建cDNA文庫、已知序列釣全長cDNA（RACE），和用于芯片檢測的cDNA探針的擴增等。3.4差示文庫和消減文庫（1）mRNA差別顯示mRNA差別顯示技術也稱為差示反轉錄PCR（DifferentialDisplayofreverseTranscriptionalPCR）簡稱為ddRT-PCR。它是將mRNA反轉錄技術與PCR技術二者相互結合發(fā)展起來的一種RNA指紋圖譜技術，廣泛應用于分離鑒定組織特異性表達的基因。差別基因表達（differentialgeneexpress）是細胞分化的基礎。mRNA差別顯示技術正是對組織特異性表達的基因進行分離的一種快速而行之有效的方法?；驹恚禾崛】俁NA進行反轉錄，引物為Oligo（dT12）MN，其中M稱為錨定堿基，為A，C，G中的任意一種。N稱為分類堿基，為A，C，G或T中的任意一種，共有12種MN引物，用這12種引物分別對同一總RNA樣品進行進行12次不同的反轉錄反應，從而使反轉錄的cDNA具有12種類型，也就是對cDNA進行12種歸類。在此基礎上用隨機引物和反轉錄引物對每一類cDNA進行PCR擴增，然后進行凝膠電泳分析，從而確定不同樣品間基因在時間和空間上特異性的表達?！飪?yōu)點：簡單、快速、可檢測表達的所有基因(包括低豐度），需要的總RNA量少；同時檢測基因的上、下調表達、展現所有差異、比較多種細胞類型；缺點：檢測全部mRNA的PCR工作量很大；PAGE分離的cDNA大于500bp時會漏檢，出現差別條帶太多，假陽性率高達70%左右一般得到mRNA3‘端非翻譯區(qū)序列不同條帶有可能重合（2）差別雜交法與差示文庫差別雜交：分別制備兩種細胞群體的mRNA提取物，其中一個群體含有目的基因mRNA，另一個群體不含。分別反轉錄制備總mRNA的cDNA探針，兩類探針分別與表達目的基因的細胞群體構建的cDNA克隆文庫雜交，從而篩選到含有目的基因的克隆。缺點：由于差別雜交中所使用的雜交探針是mRNA反轉錄成的cDNA群體，真正能與目的基因核苷酸序列完全互補的探針僅占很低的比例，以至于那些低豐度的mRNA的cDNA克隆很難用此法檢測出來。其次，差別雜交需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量的噬菌斑或克隆片段，因此是十分耗費時間和金錢的工作。兩套平行轉移的濾膜之間，DNA的保有量往往是有差別的，這樣所得的雜交信號的強度也就不會一致，需要重新進行點雜交，以作進一步的陽性鑒定工作。所以說重復性差是差別雜交篩選法的又一個缺點?！锊顒e雜交法（3）消減雜交法消減雜交法：將A細胞總mRNA制備的cDNA與過量的B細胞的總mRNA雜交，經過羥基磷灰石柱層析可以分離純化出未雜交的cDNA，合成第二鏈后用其構成cDNA文庫，該文庫含有只在A細胞中表達的cDNA克隆和一些低豐度mRNA的cDNA

克隆，稱為消減文庫。也可反過來得到B細胞中的特異表達基因。該方法是差別雜交法的改進。★T細胞B細胞用固相支持物法、SMART等方法制備全長cDNAcDNA長度可能不全cDNA豐度過低PCR擴增后構建文庫（4）代表性差異顯示（RAD)代表性差示分析(representialdisplayanalysis)

：充分發(fā)揮了PCR以指數形式擴增雙鏈模板，而以線性形式擴增單鏈模板的特性，通過消減和富集，使得差異基因片段得到特異性擴增。將待測cDNA（Tester）和驅離cDNA（Driver）分別用同一種識別4堿基序列的限制性內切酶切割形成的平均長度為256bp的cDNA片段分別接上寡聚核苷酸接頭（adaptor），并以接頭為引物進行PCR擴增將接頭切除，并只在Tester片斷末端接上新接頭，然后將Tester與大大過量的Driver混合雜交。Driver過量的目的是使Ｔ群體中特異性序列沒有遺漏的可能；復性，補平末端，并以新接頭為引物進行PCR擴增，形成的3種雜交體中只有自身退火形成的Tester/Tester兩端均能和引物配對，產物呈指數遞增。Tester/Driver雜交體只能是單引物擴增，產物為單鏈DNA分子，其數量呈線性遞增。Driver/Driver雜交體由于分子兩端沒有與新引物配對區(qū)而無法進行擴增；用MungBeanNuclease去除單鏈DNA分子，差異雙鏈cDNA便完成第一輪富集。重復第2、3輪富集。

（P193圖）★優(yōu)點：可重復性好；假陽性少；mRNA用量少、特異性高。缺點：Tester組低豐度的分子自身雜交的幾率很低(混合體系中有10%的單鏈分子），所以被擴增的幾率仍很低；酶切連接步驟太多，cDNA會損失很多，所以可能漏掉關鍵基因；得到的不是cDNA全長而是其酶切片段。

實驗中使用過量DriverDNA目的是充分使TesterDNA中與DriverDNA序列相同的片段雜交，酶解去除，只有差異雙鏈cDNA經PCR幾輪循環(huán)得以有效富集。（5）抑制性消減雜交（SSH）1996年建立了在抑制PCR與消減雜交技術上的差異基因檢測方法――抑制性消減（扣除）雜交（SSH，suppressionsubtractivehybridization）。該方法運用了雜交二級動力學原理：即豐度高的單鏈cDNA在退火時產生同源雜交速度快于豐度低的單鏈cDNA，從而使原來在豐度上有差別的單鏈cDNA相對含量達到基本一致。而所謂抑制PCR，則是利用鏈內退火優(yōu)先于鏈間退火，從而使非目的序列片段兩端反向重復序列在退火時產生類似發(fā)卡的互補結構，無法與引物配對，從而選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增?！锱cRAD相同，酶切后得到Tester與Driver樣本的cDNA片段，將Te