第十七章 病毒基因工程

第十七章病毒基因工程第一節(jié)病毒載體第二節(jié)病毒與基因工程病毒的一般介紹病毒(virus)是一種介于生命與非生命之間的生命形式，是最原始的生命體。病毒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由蛋白質(zhì)外殼和一種核酸(DNA或RNA)組成。病毒粒子的體積極其微小，直徑在10~300nm之間，能通過細(xì)菌濾器，需借助電子顯微鏡才能觀察到它的存在。病毒是一種嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生生物，必須依賴宿主細(xì)胞內(nèi)才能完成自身的復(fù)制增殖；一旦離開宿主細(xì)胞就失去了增殖能力，但保留了對(duì)宿主細(xì)胞的感染能力。10nm50nm50nm25nm煙草花葉病毒腺病毒流感病毒噬菌體圖17-1四種代表性病毒的電子顯微觀察圖電子顯微鏡下的病毒粒子呈球形，卵圓形，桿狀，絲狀和蝌蚪狀等形態(tài)，其中以近球形和桿狀為多。

病毒粒子的形狀病毒在生物系統(tǒng)中是一個(gè)獨(dú)立的界(kingdom),可感染幾乎所有的生物體，在脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌(一般稱細(xì)菌病毒為噬菌體，bacteriophage

或phage)中都有病毒的寄生。有些病毒的宿主范圍寬，可感染多種生物，如禽流感病毒可感染雞、鴨、鳥、豬，其中某些分離株如禽流感病毒H5N1甚至感染人類；有些病毒的宿主范圍窄，只感染一種特定的生物，如桿狀病毒科病毒僅感染某一特定種的昆蟲，但還沒有發(fā)現(xiàn)病毒的宿主范圍超越了原核生物和真核生物的界限。病毒幾乎可以感染所有的生物體自1892年伊萬(wàn)諾夫斯基(Iwanovski)首次煙草花葉病毒(TMV)以來，已發(fā)現(xiàn)各種病毒4千多種。由于對(duì)病毒間的進(jìn)化關(guān)系知之甚少，以至于還沒有一個(gè)獲得一致贊同的病毒分類系統(tǒng)。國(guó)際病毒分類委員會(huì)(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV)對(duì)病毒的分類原則作了規(guī)定，現(xiàn)一般根據(jù)病毒分類依據(jù)有病毒的核酸類型(DNA或RNA，單鏈還是雙鏈)；病毒粒子的大小、形狀、衣殼的對(duì)稱性、有無(wú)囊膜；有時(shí)也根據(jù)它們所引起的疾病、傳播方式等特征進(jìn)行分類。而根據(jù)宿主的不同，把病毒分為脊椎動(dòng)物(包括人類)病毒、無(wú)脊椎動(dòng)物病毒、植物病毒和微生物病毒4大類。病毒的分類病毒與基因工程病毒因其具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可通過感染而大量復(fù)制，易于操作和大量獲得等特點(diǎn)，所以從一開始就成為分子生物學(xué)與基因工程研究的好材料，并對(duì)其發(fā)展起到了積極的推動(dòng)作用。自70年代基因工程興起后，病毒成為基因工程的改造對(duì)象，包括病毒全基因組序列的測(cè)定，基因功能的鑒定，抗病毒藥物的開發(fā)等，為病毒性疾病的預(yù)防、診斷和治療提供先進(jìn)的手段。病毒作為基因工程的優(yōu)良載體，在基因轉(zhuǎn)移與表達(dá)、作物改良、疾病的基因治療中發(fā)揮了巨大作用。真核基因表達(dá)載體質(zhì)粒載體：在真核細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)整合質(zhì)粒載體：將外源基因整合到真核細(xì)胞染色體上持續(xù)表達(dá)病毒載體：病毒攜帶外源基因在細(xì)胞表達(dá)病毒載體的特點(diǎn)病毒的衣殼蛋白能夠識(shí)別細(xì)胞受體(acceptor)，不需要額外添加輔助試劑就可直接將外源基因高效導(dǎo)入寄主細(xì)胞；使用病毒衣殼蛋白、包裝重組質(zhì)粒DNA形成的假病毒顆粒(pseudovirions)，相當(dāng)于構(gòu)成了一種高效的轉(zhuǎn)化體系；病毒具有能夠被宿主細(xì)胞識(shí)別的有效啟動(dòng)子；多數(shù)病毒在其感染周期中都能夠持續(xù)地復(fù)制，使其基因組拷貝數(shù)達(dá)到相當(dāng)高的水平；有些病毒在它們的復(fù)制過程中能高效穩(wěn)定地整合到寄主基因組；病毒載體的安全問題目前，各種病毒載體已經(jīng)廣泛用于蛋白表達(dá)、疫苗制備、基因轉(zhuǎn)移與基因治療。但無(wú)論是何種病毒載體，在構(gòu)建和使用過程中都需要非常重視防止病毒本身的致病性以保證病毒載體的安全性。第一節(jié)病毒載體1.1動(dòng)物病毒載體1.2植物病毒載體1.3噬菌體載體1.1動(dòng)物病毒載體1.1.1SV40載體 1.1.2痘苗病毒載體1.1.3反轉(zhuǎn)錄病毒載體1.1.4慢病毒載體1.1.5腺病毒載體1.1.6單純皰疹病毒載體1.1.7桿狀病毒載體SV40(Simianvacuolatingvirus40,猿猴空泡病毒)是迄今為止研究最為詳盡的乳多空病毒之一，也是第一個(gè)完成基因組DNA全序列分析的動(dòng)物病毒。SV40病毒的基因組是環(huán)狀雙鏈DNA，大小僅為5243bp，與質(zhì)粒大小相似，適于基因操作(圖17-2)。1.1.1SV40載體 圖17-2SV40病毒基因組物理圖譜及轉(zhuǎn)錄示意圖由于SV40病毒包裝十分嚴(yán)格，不能包裝大于SV40基因組的DNA分子，因此外源基因只能通過取代病毒本身的DNA片段進(jìn)行克隆。其克隆外源片段的能力有限，只能達(dá)到約2.5kb。兩種類型的SV40病毒載體：

置換型和穿梭型置換型的重組病毒載體：一種是早期置換型病毒載體，另一種是晚期置換型載體。在早期置換型病毒載體中，早期基因T抗原基因被缺失掉，因此重組后的病毒不能在正常的敏感細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，只能在一種可以持續(xù)表達(dá)T抗原的猴腎細(xì)胞即COS細(xì)胞中才能復(fù)制和繁殖。在晚期取代型載體中，晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)被外源基因取代。由于缺少晚期基因，病毒DNA不能被包裝，因此必須由輔助病毒提供包裝必須的蛋白質(zhì)，而輔助病毒本身由于不能表達(dá)T抗原而不能復(fù)制。重組的病毒-質(zhì)粒載體：這是這一類穿梭載體，該載體中病毒基因組部分只保留下維持在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制所必須的有關(guān)序列，但它融合上了一個(gè)細(xì)菌質(zhì)粒，因而還能夠在大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和增殖，從而避免了從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提SV40-DNA的繁瑣步驟。因?yàn)檩d體上只保留了復(fù)制序列，沒有衣殼蛋白等基因，不能產(chǎn)生病毒粒子，這種穿梭載體只能使外源基因在細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)。但是載體DNA可以進(jìn)行復(fù)制并產(chǎn)生很多拷貝，依然可以高水平表達(dá)外源基因。兩種類型的SV40病毒載體：

置換型和穿梭型1.1.2痘苗病毒載體痘苗病毒(vacciniavirus)為感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的雙鏈線性DNA病毒，基因組大小在180kb左右，其中有30kb左右為非必須區(qū)，可以被外源DNA片段取代而不影響病毒的復(fù)制與繁殖。痘苗病毒容易培養(yǎng)、相當(dāng)穩(wěn)定并能在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制繁殖，因此是一種理想的病毒載體。由于其基因組很大，因此只能通過先將目的基因克隆到到轉(zhuǎn)移載體上，然后將重組轉(zhuǎn)移載體與野生型痘苗病毒DNA共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組而獲得重組痘苗病毒。由于痘苗病毒本身是一種高效活疫苗，當(dāng)將一種或者幾種外源基因引入該病毒時(shí)，能夠構(gòu)建出多價(jià)疫苗株，同時(shí)預(yù)防幾種病原微生物引起的傳染病，這是目前痘苗病毒載體最吸引人的特點(diǎn)。反轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)為單鏈RNA病毒，可高效地感染許多類型的宿主細(xì)胞。病毒進(jìn)入細(xì)胞后，其基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞核并整合在細(xì)胞染色體中，且以此為模板合成病毒基因及子代基因組RNA，然后裝配成病毒顆粒。反轉(zhuǎn)錄病毒基因組大約10kb，含有三個(gè)最重要的基因，即gag(編碼核心蛋白)、pol(編碼反轉(zhuǎn)錄酶)和env(編碼病毒外膜蛋白)，并依次由5’向3’方向排列。env基因中含有病毒包裝所必需的序列，同時(shí)兩端存在長(zhǎng)末端重復(fù)區(qū)(LTRS)，用于介導(dǎo)病毒的整合。1.1.3反轉(zhuǎn)錄病毒載體

1.1.3.1反轉(zhuǎn)錄病毒1.1.3.2反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建過程目前使用的反轉(zhuǎn)錄病毒載體主要源于鼠白血病病毒(murine

leukaemiavirus,MLV)，其中病毒的大部分序列，如gag、pol和env缺失，僅保留病毒基因組5’、3’端的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)(包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、整合必需序列)和包裝信號(hào)及其相關(guān)序列(圖17-3)。攜帶外源基因（如圖17-3中的基因A,B）的反轉(zhuǎn)錄病毒載體需要由能提供Gag、Pol和Env

等結(jié)構(gòu)蛋白的包裝細(xì)胞如ProPak(最常用)或PA317等細(xì)胞系才能成為成熟的重組“假病毒粒子”?！凹俨《玖Ｗ印庇懈腥炯?xì)胞的能力，可將外源基因帶入靶細(xì)胞中，但是不能在靶細(xì)胞中復(fù)制“假病毒粒子”通過LTR序列將外源目的基因隨機(jī)整合到靶細(xì)胞染色體上，使外源基因在靶細(xì)胞中穩(wěn)定、持久地表達(dá)。提供反式蛋白的包裝細(xì)胞感染LTRLTRGeneAGeneB反轉(zhuǎn)錄病毒載體env

polyAgagpol

polyA

gagproteinspolproteinsenvproteins重組反轉(zhuǎn)錄病毒LTRLTR整合靶細(xì)胞包裝成熟病毒粒子釋放轉(zhuǎn)染圖17-3反轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建復(fù)制缺陷型重組病毒原理1.1.3.3反轉(zhuǎn)錄病毒載體的安全性評(píng)價(jià)反轉(zhuǎn)錄病毒載體DNA轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞后，能產(chǎn)生有感染能力的復(fù)制缺陷型病毒。這種復(fù)制缺陷型的重組病毒僅僅具備一次感染性，從而避免了在正常細(xì)胞間擴(kuò)散感染，也降低了病毒本身的致癌性與致病性。重組病毒感染靶細(xì)胞，可使外源基因整合入靶細(xì)胞的染色體，穩(wěn)定地表達(dá)。其最大缺點(diǎn)是存在載體與人內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒序列之間發(fā)生重組產(chǎn)生有復(fù)制能力的人反轉(zhuǎn)錄病毒的潛在危險(xiǎn)，也存在原病毒DNA隨機(jī)整合靶細(xì)胞染色體而激活染色體上癌基因或失活抑癌基因的可能性。1.1.4慢病毒載體

1.1.4.1慢病毒的特點(diǎn)慢病毒（Lentivirus）為逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，因在細(xì)胞內(nèi)增殖較慢，故稱慢病毒。慢病毒載體均由人免疫缺陷病毒（HIV）基因組改造而來，與只能感染分裂期細(xì)胞的普通逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，慢病毒載體對(duì)分裂期細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞均具有感染能力，因而具有更廣泛的宿主范圍，并且很少引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)。慢病毒載體介導(dǎo)的外源基因整合入宿主細(xì)胞基因組效率更高，其整合的外源DNA片段更加穩(wěn)定、外源基因的表達(dá)水平更高。慢病毒載體不僅應(yīng)用于常規(guī)的整合型穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系進(jìn)行外源基因表達(dá)和內(nèi)源基因RNA干擾，也常用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究。1.1.4.2慢病毒載體的特點(diǎn)慢病毒載體由輔助質(zhì)粒和目標(biāo)表達(dá)載體兩部分組成。輔助質(zhì)粒能夠提供生產(chǎn)病毒顆粒所必需的蛋白質(zhì)及RNA元件；表達(dá)載體則包括了需要在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的目的基因。通過輔助質(zhì)粒與目標(biāo)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，即可從細(xì)胞上清液中收獲具有感染能力、無(wú)復(fù)制能力、攜帶目的基因的假病毒顆粒。這種一次性感染性病毒顆粒既保留了高效感染和整合的特性，又保證其生物安全性。如由pLp1，pLp2,pLp1/VSVG等3個(gè)包裝質(zhì)粒和1個(gè)pLenti系列表達(dá)質(zhì)粒及相應(yīng)的病毒生產(chǎn)細(xì)胞系293FT組成的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)。1.1.5腺病毒載體

1.1.5.1腺病毒及腺病毒載體腺病毒(adenovirus,Ad)基因組為線狀雙鏈DNA，能廣泛感染各種分化或者未分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。其基因組長(zhǎng)約36kb，兩端各有一個(gè)反向末端重復(fù)序列(invertedterminalrepeat,ITR)，ITR內(nèi)側(cè)為病毒包裝信號(hào)。基因組上分布著四個(gè)承擔(dān)調(diào)節(jié)功能的早期基因(E1、E2、E3和E4)和1個(gè)編碼結(jié)構(gòu)蛋白的晚期基因。腺病毒在自然界分布廣泛，至少存在100種以上的血清型。目前的腺病毒載體大多以2型(Ad2)、5型(Ad5)為基礎(chǔ)。外源基因主要替代E1和／或E3區(qū)。E1區(qū)缺失的腺病毒載體可在包裝細(xì)胞293細(xì)胞(本質(zhì)上為能持續(xù)表達(dá)E1蛋白的人胚胎腎細(xì)胞)中增殖。E3為復(fù)制非必需區(qū)，其缺失擴(kuò)大了載體的插入容量，外源片段容量可達(dá)到8.5kb。這種腺病毒載體被稱為非復(fù)制型腺病毒載體，也叫復(fù)制缺陷型腺病毒載體，因其安全性較好已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因治療的臨床試驗(yàn)中。腺病毒的基因組結(jié)構(gòu)腺病毒的基因可分為立即早期基因(E1A)，早期基因(E1B,E2A,E2B,E3,E4和部分結(jié)構(gòu)蛋白基因)和晚期基因(L,編碼大部分結(jié)構(gòu)蛋白)。圖中箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向。1.1.5.2腺病毒載體的缺點(diǎn)腺病毒由于不整合到宿主細(xì)胞的基因組中，因此難以象反轉(zhuǎn)錄病毒載體那樣較長(zhǎng)時(shí)間地表達(dá)外源基因。外源基因表達(dá)的持續(xù)時(shí)間約2~6周。腺病毒載體主要的缺點(diǎn)在于能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，同時(shí)也存在有安全性問題。即腺病毒載體在包裝細(xì)胞中增殖時(shí)，E1序列間有可能發(fā)生同源重組而產(chǎn)生有復(fù)制能力的野生型腺病毒，以及在已感染野生型腺病毒的宿主體內(nèi)復(fù)制缺陷型腺病毒有可能被拯救。1.1.5.3對(duì)于腺病毒載體的改造目前已從幾方面對(duì)腺病毒載體進(jìn)行改造：①在E1-、E3-載體中，插入一個(gè)勞斯肉瘤病毒(Roussarcomavirus,RSV)長(zhǎng)末端重復(fù)序列啟動(dòng)子控制下的E3區(qū)中g(shù)p19k基因表達(dá)盒。Gp19k可以降低宿主細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)I類分子的表達(dá)，MHCI類分子在膜上的表達(dá)降低能從而減少機(jī)體對(duì)被感染細(xì)胞的免疫監(jiān)視，通過降低免疫反應(yīng)相應(yīng)地延長(zhǎng)了外源基因的表達(dá)時(shí)間。②在E1-、E3-載體中的E2A區(qū)引入點(diǎn)突變，E2A為病毒復(fù)制必需的DNA結(jié)合蛋白，其突變明顯減少病毒早、晚期基因表達(dá)，降低免疫反應(yīng)，同時(shí)也降低了同源重組或標(biāo)記拯救而產(chǎn)生復(fù)制型病毒的可能性。③在E1-、E3-載體中，再缺失E4區(qū)。由于E4為復(fù)制必需區(qū)，所以必須建立能同時(shí)互補(bǔ)E1和E4功能的包裝細(xì)胞。目前腺病毒載體已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達(dá)、RNA干擾、基因治療載體、腫瘤治療和疫苗的研制等。圖17-5利用Ad-Easy系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒1.1.6單純皰疹病毒載體

1.1.6.1單純皰疹病毒皰疹病毒(Herpesvirus)是一類中等大小的雙鏈DNA病毒，有囊膜，直徑120nm~200nm，外形呈二十面體對(duì)稱。整個(gè)皰疹病毒大家族包括100多種成員，可致多種人和動(dòng)物疾病。I型單純皰疹病毒(Herpessimplexvirus,HSV)HSV-1是嗜神經(jīng)性病毒，主要通過口腔、呼吸道和破損皮膚等多種途徑侵入機(jī)體。人感染HSV-1非常普遍，成年人感染率達(dá)80～90%。在免疫完全(immuno-competent)的宿主中，HSV-1感染引起的疾病通常是有限的。單純皰疹病毒的顯著特點(diǎn)是宿主范圍較寬，可感染非分裂細(xì)胞；具有嗜神經(jīng)性，能在神經(jīng)細(xì)胞中建立長(zhǎng)期穩(wěn)定的隱性感染(逃避免疫監(jiān)視)，作為載體有望用于神經(jīng)性疾病的治療。1.1.6.2單純皰疹病毒載體的優(yōu)點(diǎn)HSV作為載體具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)基因組龐大，并已完成全序列測(cè)定，適于作大范圍基因操作，可插入30kb以上的外源DNA;(2)可感染脊椎動(dòng)物多種類型的細(xì)胞，具有嗜神經(jīng)性，為目前唯一合適于神經(jīng)細(xì)胞的病毒載體；(3)在神經(jīng)元內(nèi)能進(jìn)入潛伏狀態(tài)，此時(shí)病毒DNA以附加體形式存在，部分基因可保持轉(zhuǎn)錄活性而不影響神經(jīng)元的正常功能。將HSV改造成載體有待克服的主要困難就是盡量減少HSV對(duì)細(xì)胞的毒性。1.1.6.3單純皰疹病毒載體分兩種類型：

重組質(zhì)粒型載體和重組病毒型載體重組質(zhì)粒型載體,又稱為擴(kuò)增子(Amplicon)，主要構(gòu)成元件有適于在細(xì)菌中增殖的必需元件，如大腸桿菌DNA復(fù)制起點(diǎn)，氨芐青霉素抗性選擇標(biāo)記等；適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)增殖和包裝的元件，如HSV復(fù)制起點(diǎn)（oriS）和包裝信號(hào)（HSV-1–a-）；轉(zhuǎn)錄單位，包括HSV的啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和串聯(lián)的選擇性標(biāo)記。目前構(gòu)建的重組質(zhì)粒型載體的典型代表是pHSVlac(圖17-7)。將上述重組質(zhì)粒和HSV輔助病毒導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞，重組質(zhì)粒DNA即可作為連接體被包裝進(jìn)毒粒內(nèi)。這一類載體的主要優(yōu)點(diǎn)是構(gòu)建過程相對(duì)簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)是重組質(zhì)粒DNA攜帶外源基因的容量有限，且包裝效率不如病毒DNA。圖17-7重組質(zhì)粒型單純皰疹病毒載體pHSVlac的結(jié)構(gòu)圖重組病毒型載體是直接利用經(jīng)改造的病毒基因組作載體，操作時(shí)通常需采用兩步操作。首先將皰疹病毒基因組適當(dāng)區(qū)段克隆進(jìn)中間轉(zhuǎn)移載體，進(jìn)行體外改造，然后將重組質(zhì)粒與感染性病毒DNA共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞，使其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組，再篩選重組病毒。重組病毒型載體的優(yōu)點(diǎn)是它們?cè)谏窠?jīng)元內(nèi)能真正進(jìn)入潛伏狀態(tài)，能攜帶多個(gè)外源基因，無(wú)需輔助病毒，傳遞效率相當(dāng)高，目前HSV載體是唯一可將外源基因和啟動(dòng)子導(dǎo)入神經(jīng)系統(tǒng)的成功載體。缺點(diǎn)是病毒基因組內(nèi)的毒性元件和轉(zhuǎn)錄因子可能影響細(xì)胞代謝乃至殺死細(xì)胞，外源基因表達(dá)水平低。1.1.6.3單純皰疹病毒載體分兩種類型：

重組質(zhì)粒型載體和重組病毒型載體1.1.7桿狀病毒載體桿狀病毒(baculovirus)屬于桿狀病毒科，病毒粒子呈桿狀，其基因組大小為90~180kb雙鏈閉合環(huán)狀DNA，在自然界中僅感染節(jié)肢動(dòng)物，主要感染鱗翅目昆蟲，對(duì)人與哺乳動(dòng)物十分安全，因此常用作生物殺蟲劑及真核表達(dá)載體。1.1.7.1桿狀病毒載體的優(yōu)點(diǎn)第一，載體安全性高。桿狀病毒迄今未發(fā)現(xiàn)對(duì)任何高等動(dòng)物和植物細(xì)胞及個(gè)體有不良影響，相對(duì)其它病毒載體而言，它對(duì)人類的安全性是可以信賴的。第二，具有克隆大片段外源基因能力。桿狀病毒基因組大小差異很大(88~200kb)，病毒可容納大量外源DNA而不影響正常復(fù)制和DNA的包裝，是一種同時(shí)進(jìn)行多基因表達(dá)的首選載體。第三，利用桿狀病毒強(qiáng)大的多角體蛋白基因啟動(dòng)子或晚期蛋白p10啟動(dòng)子，表達(dá)效率高。理論上講外源基因的表達(dá)量應(yīng)當(dāng)和多角體蛋白基因或p10基因表達(dá)量相當(dāng)，但實(shí)際上很難做到這一點(diǎn)。即便如此，該系統(tǒng)中外源基因的表達(dá)量相對(duì)其他真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來說仍是相當(dāng)可觀的，往往可以達(dá)到細(xì)胞蛋白總量的1%~10%或更高。第四，表達(dá)產(chǎn)物具有正確的后加工。大多數(shù)蛋白質(zhì)表達(dá)后須在細(xì)胞中經(jīng)過一定的修飾加工，輸送到細(xì)胞一定的位置或分泌出，才能具有生物活性。昆蟲細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)后修飾加工與哺乳動(dòng)物接近，能識(shí)別并正確地進(jìn)行信號(hào)肽切除、多肽切割、高級(jí)結(jié)構(gòu)形成、蛋白質(zhì)定位、磷酸化和糖基化等等，表達(dá)產(chǎn)物通常具有很高的生物活性.第五，病毒具有自主感染性。具有完整的感染性，不需要輔助病毒。桿狀病毒載體的重組區(qū)域是基因組的非必需區(qū)域，即使缺失也不會(huì)影響病毒的復(fù)制和表達(dá)。第六，能成為蟲體生物反應(yīng)器。帶有外源基因的重組病毒可以直接感染昆蟲幼蟲并在蟲體內(nèi)大量增殖，在幼蟲淋巴液內(nèi)表達(dá)的外源性蛋白性質(zhì)穩(wěn)定，易于分離，其積累濃度比細(xì)胞培養(yǎng)液高出10～100倍。昆蟲如家蠶的幼蟲人工飼養(yǎng)成本極低，易實(shí)行自動(dòng)化控制。研究結(jié)果表明，一條幼蟲所生產(chǎn)的外源性蛋白如用于臨床診斷分析，可提供約100萬(wàn)人次使用，一頭幼蟲相當(dāng)一個(gè)發(fā)酵罐。第七，桿狀病毒表達(dá)載體還可將外源基因投送至各哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并且通過哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子使外源蛋白得到高效穩(wěn)定的表達(dá)，而其自身基因組并不復(fù)制。由于桿狀病毒載體的容量大，感染、表達(dá)效率高，生物安全性好，因而在基因治療、疫苗開發(fā)、藥物篩選等醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。1.1.7.1桿狀病毒載體的優(yōu)點(diǎn)外源基因插入桿狀病毒載體的必須通過轉(zhuǎn)移載體的介導(dǎo)，將轉(zhuǎn)移載體和親本病毒進(jìn)行同源重組成為構(gòu)建重組桿狀病毒的方式為了避免費(fèi)時(shí)費(fèi)力的重組病毒空斑純化過程，1993年發(fā)展了一種全新的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)即Bac-to-Bac系統(tǒng)，意思為從細(xì)菌(bacteria)到桿狀病毒（baculovirus),其本質(zhì)上是將AcMNPV基因組DNA改造成可在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制同時(shí)對(duì)昆蟲細(xì)胞保留感染性的大型穿梭載體。在桿狀病毒基因組中插入大腸桿菌復(fù)制的F因子復(fù)制區(qū)，卡那霉素抗性基因，Tn7轉(zhuǎn)座接觸位點(diǎn)以及l(fā)acZ′盒式結(jié)構(gòu)，由于桿狀病毒基因組為環(huán)狀閉合雙鏈DNA分子，因此這種Bacmid可以象質(zhì)粒一樣在大腸桿菌中以低拷貝形式復(fù)制。而在轉(zhuǎn)移載體中外源基因位于多角體蛋白基因啟動(dòng)子的下游，兩端分別為Tn7轉(zhuǎn)座子的左、右端轉(zhuǎn)座序列。當(dāng)將重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化到含有Bacmid的大腸桿菌中后，在輔助質(zhì)粒提供的轉(zhuǎn)座作用因子的介導(dǎo)下進(jìn)行轉(zhuǎn)座，將重組轉(zhuǎn)移載體上含外源基因的表達(dá)盒式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)座到Bacmid的lacZ′盒式結(jié)構(gòu)中，破壞α-互補(bǔ)，因此重組病毒可以通過簡(jiǎn)單的藍(lán)白斑方法篩選，從白色菌落中分離的重組病毒DNA直接轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞即可以包裝成有感染性的重組病毒(圖17-8，A，B)。1.1.7.2重組桿狀病毒的構(gòu)建：Bac-to-Bac系統(tǒng)圖17-8用Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)型重組病毒示意圖A：Bac-to-Bac構(gòu)建重組桿狀病毒的具體流程。B：供體轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBac1圖譜，在Tn7轉(zhuǎn)座子左右長(zhǎng)臂之間有一個(gè)慶大霉素抗性基因和多角體蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒式結(jié)構(gòu)。B1.1.7.3MultiBac系統(tǒng)在Bac-to-Bac系統(tǒng)基礎(chǔ)上，通過對(duì)轉(zhuǎn)移載體和Bacmid的進(jìn)一步改造，建立了新的桿狀病毒多基因表達(dá)系統(tǒng)即MultiBac系統(tǒng)。該系統(tǒng)由2個(gè)供體載體pFBDM、pUCDM和改造過的受體Bacmid

組成，受體Bacmid

保留了原有的Tn7轉(zhuǎn)座受體位點(diǎn)，又引入了1個(gè)loxp位點(diǎn)，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)8個(gè)基因表達(dá)。1.2植物病毒載體由于植物病毒多為RNA病毒，同時(shí)植物細(xì)胞的特殊性造成細(xì)胞培養(yǎng)不如動(dòng)物細(xì)胞方便，使得載體構(gòu)建比較困難，因此植物病毒載體的研究開展得較晚。直到1984年才產(chǎn)生第一例由植物病毒—花椰菜花葉病毒(Cauliflowermosaicvirus,CaMV)構(gòu)建的載體。植物病毒載體用于植物基因工程可以利用植株或者植物組織快速生產(chǎn)大量成本低廉的外源蛋白，滿足醫(yī)藥及工業(yè)用蛋白日益增加的需求，因此人們嘗試了多種植物病毒載體的構(gòu)建。植物病毒載體主要有三種類型：

置換型載體、插入型載體和互補(bǔ)型載體置換型載體即用外源基因置換對(duì)植物病毒基因組復(fù)制和繁殖的非必須區(qū)。置換型載體一般用于轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，用于驗(yàn)證構(gòu)建載體的可行性，較少接種于植株系統(tǒng)表達(dá)外源基因。置換型載體轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體時(shí)，通常不必考慮病毒的組裝，所以可攜帶較大的外源基因。但在植株系統(tǒng)表達(dá)外源基因時(shí)，就必須考慮病毒的包裝限制，因?yàn)榻^大多數(shù)植物病毒侵染時(shí)都需要組裝成完整的病毒粒子。第一例植物病毒載體是用大腸桿菌二氫葉酸還原酶基因(dihydrofolate

reductase,DHFR)置換CaMV編碼蚜蟲傳播蛋白因子的基因II構(gòu)建而成。插入型載體的構(gòu)建方式是將外源編碼序列插入病毒基因組不重要的非編碼區(qū)，以避免對(duì)病毒的復(fù)制或移動(dòng)造成不利影響。對(duì)于球狀或二十面立體等軸對(duì)稱病毒來說，包裝限制決定了插入的外源編碼序列不能太大。絲狀或桿狀植物病毒，如煙草花葉病毒（TMV）、馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY)和桿狀DNA病毒(Badnavirus)等因不存在包裝限制，適于構(gòu)建插入型載體。植物病毒載體主要有三種類型：

置換型載體、插入型載體和互補(bǔ)型載體互補(bǔ)型載體是將外源基因插入缺陷型病毒或用外源基因置換病毒的某個(gè)基因構(gòu)建而成，在構(gòu)建互補(bǔ)型載體時(shí)，一些重要的基因也被外源基因置換或插入。對(duì)于互補(bǔ)型載體，為了得到感染性病毒則必須反式提供失活基因的表達(dá)產(chǎn)物，一種是由轉(zhuǎn)基因植株反式提供失活基因產(chǎn)物，另一種是將構(gòu)建的植物病毒載體與輔助病毒一起接種，由輔助病毒提供失活基因產(chǎn)物。植物病毒載體主要有三種類型：

置換型載體、插入型載體和互補(bǔ)型載體1.3噬菌體載體噬菌體是一類專一感染細(xì)菌的病毒，又稱為細(xì)菌病毒。利用噬菌體載體可以應(yīng)用于疾病治療、基因工程疫苗、研究蛋白質(zhì)相互作用以及藥物設(shè)計(jì)與開發(fā)等領(lǐng)域。由于抗生素的過度使用，許多細(xì)菌對(duì)抗生素藥物產(chǎn)生了抗性，因此人們開始利用噬菌體溶解細(xì)胞的作用來治療人和動(dòng)物的病原細(xì)菌的臨床感染，即所謂噬菌體治療(bacteriophagetherapy)。近年來發(fā)展起來的稱為噬菌體表面展示系統(tǒng)的體外篩選技術(shù)，通過將外源基因克隆到噬菌體衣殼蛋白pVIII或pIII的N-端編碼區(qū)可以將該基因融合表達(dá)并展示在噬菌體表面。通常使用抗原去淘洗抗體或隨機(jī)多肽構(gòu)成的噬菌體展示文庫(kù)，根據(jù)抗原—抗體反應(yīng)原理，可以將與抗原緊密結(jié)合的抗體或多肽片段篩選出來，該技術(shù)已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)相互作用的有力工具和多肽藥物篩選的一種重要手段，世界上有很多著名的制藥公司都將噬菌體展示系統(tǒng)作為高通量藥物篩選的技術(shù)平臺(tái)。第二節(jié)病毒與基因工程病毒與宿主細(xì)胞的密切關(guān)系使得病毒成為有效的基因克隆與表達(dá)載體，此外病毒的某些特殊元件如高效啟動(dòng)子、終止子和加尾信號(hào)等已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種非病毒載體的構(gòu)建。通過對(duì)病毒進(jìn)行基因工程改造后可以獲得滿足人們需要的特殊“人工病毒”，達(dá)到為人類健康與生活服務(wù)的目的，如病毒在基因工程疫苗與基因治療以及生物防治方面的都有應(yīng)用。第二節(jié)病毒與基因工程2.1基因工程病毒疫苗2.2病毒與基因治療2.3溶瘤病毒與癌癥治療2.4病毒與生物防治2.1.1通過刪除野生型病毒中毒性基因制備弱毒疫苗2.1.2活體重組疫苗2.1.3病毒樣顆粒疫苗2.1基因工程病毒疫苗2.1基因工程病毒疫苗許多病毒都因?yàn)槟芤饎?dòng)、植物或人類的嚴(yán)重疾病而倍受關(guān)注，如人的天花、流感、愛滋病、麻疹、肝炎、脊髓灰質(zhì)炎、腮腺炎、皰疹、流行性乙腦炎、SARS(severeacuterespiratorysyndrome)和一些腫瘤；動(dòng)物的口蹄疫、豬瘟、雞瘟、牛痘、狂犬??；植物的煙草花葉病、水稻矮縮病、黃化病等。目前，對(duì)病毒性疾病的治療遠(yuǎn)不如控制細(xì)菌感染那樣駕輕就熟,用于細(xì)菌治療的各種抗生素類藥物對(duì)病毒分子不起作用。病毒疫苗(vaccine)依然被公認(rèn)為預(yù)防和控制病毒性疾病的最好甚至唯一的出路。隨著對(duì)病毒及其與宿主關(guān)系認(rèn)識(shí)的不斷深入，已運(yùn)用基因工程的方法生產(chǎn)出比傳統(tǒng)的病毒疫苗毒力更低、效果更好、使用更安全的基因工程疫苗。傳統(tǒng)的疫苗主要是滅活或減毒的病原物，這種疫苗因具有病原物的所有抗原成分，能激發(fā)很強(qiáng)的免疫保護(hù)力。滅活疫苗有脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、風(fēng)疹、腮腺炎、甲肝、乙腦等病毒疫苗，減毒疫苗有牛痘、動(dòng)物(牛、豬、羊和猴)輪狀病毒等病毒疫苗。盡管傳統(tǒng)疫苗在疾病的預(yù)防中功不可沒，但有其局限性：(1)不管是滅活的還是減毒的病毒疫苗，它們都必須經(jīng)過培養(yǎng)動(dòng)物或細(xì)胞來生產(chǎn)，產(chǎn)量低，成本高，生產(chǎn)人員需要防護(hù)；(2)生產(chǎn)出的死疫苗存在滅活不徹底的危險(xiǎn)，而減毒疫苗有回復(fù)突變的危險(xiǎn)存在；(3)有些疾病如艾滋病，用傳統(tǒng)的疫苗預(yù)防效果收效甚微。從20世紀(jì)80年代中期開始，DNA重組技術(shù)的日益成熟為制造新一代重組疫苗提供了嶄新的方法，研究人員可用基因工程技術(shù)改造、設(shè)計(jì)和生產(chǎn)理想的疫苗。2.1.1基因工程弱毒疫苗傳統(tǒng)的弱毒疫苗制備往往通過將野生型的病毒在不適宿主或不適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)而獲得?，F(xiàn)在采用基因工程的方法，定向地敲除某些有毒基因，制成減毒疫苗?？谔阋呤钱?dāng)今世界上最為嚴(yán)重的家畜傳染病，危害牛、豬、羊等偶蹄類動(dòng)物，國(guó)際獸疫局(OIE)將其列為A類傳染病之首。通常用甲醛滅活口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)作為疫苗。FMDV屬于小RNA病毒科，運(yùn)用基因工程技術(shù)先反轉(zhuǎn)錄出FMDV的全長(zhǎng)cDNA，構(gòu)建感染性克隆，研究者用SGSNPGSL氨基酸序列取代病毒衣殼蛋白VP1上的SGSGVRGDFGSL序列，缺失了對(duì)病毒吸附宿主細(xì)胞受體來說至關(guān)重要的RGD氨基酸序列。缺失病毒不能在宿主內(nèi)復(fù)制。而這種病毒可使海福特牛產(chǎn)生中和抗體，在刺激機(jī)體免疫應(yīng)答、動(dòng)物保護(hù)等方面與滅活疫苗一致，甚至優(yōu)于滅活疫苗，而且不會(huì)構(gòu)成感染威脅。偽狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)可引起家畜和多種野生動(dòng)物的偽狂犬病，臨床上以仔豬的神經(jīng)癥狀、嚴(yán)重的呼吸道疾病以及種豬發(fā)生流產(chǎn)、死產(chǎn)和產(chǎn)仔數(shù)下降等癥狀為特征。PRV基因組中的TK、gC、gI、PK和CP(衣殼蛋白)等與PRV毒力相關(guān)。TK基因缺失株病毒的毒力顯著下降，當(dāng)再缺失其它毒力基因時(shí)，這種多基因缺失的PRV即成為病毒弱毒疫苗株。世界上第一個(gè)獲得批準(zhǔn)使用的基因工程缺失疫苗就是偽狂犬病TK缺失疫苗株BUK-d13，它就是TK與gE基因雙缺失的基因工程病毒疫苗。我國(guó)研究者通過在基因組中插入LacZ表達(dá)盒構(gòu)建的雙基因缺失PRV疫苗(TK-/gG-/LacZ+)已經(jīng)完成了中試與區(qū)域試驗(yàn)，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和中試應(yīng)用證明該疫苗產(chǎn)品刺激接種動(dòng)物產(chǎn)生抗體的時(shí)間和保護(hù)效果優(yōu)于目前的國(guó)內(nèi)外同類產(chǎn)品。該基因工程疫苗為當(dāng)前我國(guó)控制豬偽狂犬病提供了強(qiáng)有力的措施。單純皰疹病毒主要感染皮膚、粘膜和神經(jīng)組織，引起的多種疾病，并有潛伏感染的趨向，威脅人類健康。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，缺失神經(jīng)毒性基因r34.5的病毒RAV9395具有免疫原性，可保護(hù)動(dòng)物抵抗病毒的攻擊。另外，缺失gH基因的HSV可在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，但失去了進(jìn)一步感染細(xì)胞的能力。這種病毒能很好地刺激機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫，有效地阻止原發(fā)和復(fù)發(fā)性感染，安全可靠。2.1.2活體重組疫苗直接將抗原基因重組到一種更安全的病毒載體上，將重組后的病毒用作疫苗，這樣的疫苗叫活體重組疫苗(liverecombinantvaccine)?；铙w重組疫苗所表達(dá)的抗原構(gòu)象與來源病毒中的完全一致或非常相似，因此具有更高的免疫原性，能激發(fā)很強(qiáng)的免疫應(yīng)答，起到很好的免疫防護(hù)作用?；铙w重組疫苗中所用的病毒載體是被實(shí)踐證明的確很安全的常見病毒，如痘病毒，腺病毒，水痘-帶狀皰疹病毒，腺相關(guān)病毒等?；钶d體疫苗利用載體自身的免疫激活作用，增強(qiáng)了機(jī)體對(duì)亞單位疫苗的反應(yīng)，所以活載體疫苗兼具減毒疫苗的強(qiáng)免疫原性及亞單位疫苗的安全性，還可以達(dá)到“一針治兩病”的目的。目前研究者已經(jīng)將艾茲病毒(HIV)的gag基因重組到復(fù)制缺陷型腺病毒載體中，這種攜帶gag基因的重組腺病毒免疫后的小鼠顯示出對(duì)HIV良好的免疫能力，目前已經(jīng)進(jìn)入II期臨床實(shí)驗(yàn)。2.1.3病毒樣顆粒疫苗病毒具有自我組裝成顆粒的特性，在病毒增殖或者傳代培養(yǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生一類沒有包裝病毒基因組的顆粒，這類病毒顆粒被形象地稱為“空殼病毒”或“假病毒”或者“病毒樣顆粒（Viruslikeparticles，VLPs）”。VLP通常由病毒結(jié)構(gòu)蛋白自我組裝形成，不包含病毒基因組，其形態(tài)構(gòu)相和真實(shí)病毒顆粒非常接近。因此這種缺乏核酸物質(zhì)的VLPs大分子聚合體正成為一種高效安全的新型疫苗，將在病毒疾病的預(yù)防與控制方面發(fā)揮巨大作用。VLPs

使用劑量與傳統(tǒng)疫苗接近，在刺激B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的同時(shí)還能有效地刺激CD4增生反應(yīng)（proliferative）和T淋巴細(xì)胞毒性反應(yīng)（CTL）。VLPs

還可通過口服感染腸胃系統(tǒng)而獲得粘膜免疫反應(yīng)。因此病毒樣顆粒疫苗被認(rèn)為是具有完全免疫原性的最安全的基因工程疫苗。與傳統(tǒng)減毒或者滅活病毒疫苗不同的是,VLPs在高效誘發(fā)細(xì)胞和體液免疫同時(shí),不存在有病毒未完全滅活,病毒復(fù)活甚至成為強(qiáng)毒株,病毒基因組交換重組等潛在風(fēng)險(xiǎn)。而單個(gè)基因工程亞單位疫苗則存在使用劑量大,免疫原性不強(qiáng)等缺點(diǎn),如果蛋白不組裝成VLPs的話，幾乎很難成為有效疫苗。目前已經(jīng)獲得30多種動(dòng)物病毒的VLPs，包括常見的人乳頭瘤病毒（HPV），乙型肝炎病毒（HBV）,丙型肝炎病毒（HCV）,人免疫缺陷病毒（HIV）,流感病毒(IFV)，輪狀病毒（RV）等，而HPV和HBV的VPLs疫苗最先被美國(guó)FDA所認(rèn)證。除此之外，目前還有數(shù)十種VLPs正進(jìn)入III期臨床即將上市，其中包括季節(jié)性流桿病毒VLPs,腸道病毒諾如病毒（Norovirus）及輪狀病毒VLPs,細(xì)小病毒

（parvovirus）

Vlps,以及一些由幾種亞型嵌和病毒VLPs。通過桿狀病毒－昆蟲細(xì)胞來表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白是獲得VLPs最主要的方法，尤其在需要表達(dá)2個(gè)或者多個(gè)結(jié)構(gòu)基因才能組裝成VLPs或者需要通過動(dòng)物細(xì)胞膜參與形成VLPs的情況下，該系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)明顯。如完整的三層輪狀病毒樣顆粒需要通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP2，VP6，VP7三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，VLPs在宿主昆蟲細(xì)胞內(nèi)形成。而完整的流感病毒樣顆粒則通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)同時(shí)H1,NA,M1三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，VLPs需要整合昆蟲細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，分泌生產(chǎn)。2.2病毒與基因治療基因治療是一種基于核酸的治療，將遺傳物質(zhì)(DNA或RNA)轉(zhuǎn)入機(jī)體的目的細(xì)胞中以實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的治療，其實(shí)質(zhì)是利用正常基因更換人體內(nèi)有缺陷或變異基因的治療方法。目前用于基因治療的載體可分為病毒載體(利用治病基因取代天然病毒某些基因)和非病毒載體(基于DNA的人工復(fù)合物或微粒)兩種。病毒載體相對(duì)于非病毒載體而言具有轉(zhuǎn)染效率高、基因持續(xù)表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，但免疫原性通常較強(qiáng)，有一定的危險(xiǎn)性。非病毒載體包括裸DNA和脂質(zhì)體包埋DNA等方法，盡管安全性及免疫源性方面的問題較少，但是基因轉(zhuǎn)化效率低，基因穩(wěn)定性差，表達(dá)時(shí)間較短。一個(gè)理想的基因治療載體應(yīng)具備的特征包括，能靶向性轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞；轉(zhuǎn)染效率高，作用的宿主范圍廣；包裝容量大；可調(diào)控性表達(dá)；免疫原性弱；容易生產(chǎn)及運(yùn)輸，有一定的保質(zhì)期等。然而，目前還沒有完全符合上述條件的理想載體系統(tǒng)。由于腫瘤的基因治療需要高轉(zhuǎn)染率的載體，因此目前仍以病毒載體為主(表17-1)，其中腺病毒載體應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域最為廣泛和成熟。表17-1用于基因治療的病毒載體病毒載體生物學(xué)特性適用范圍反轉(zhuǎn)錄病毒載體

單鏈RNA病毒

8~10kb可感染分裂細(xì)胞整合到染色體中表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)有致癌的危險(xiǎn)Exvivo基因治療腫瘤基因治療腺病毒載體

雙鏈DNA病毒

36kb可感染分裂和非分裂細(xì)胞不整合到染色體中外源基因表達(dá)水平高表達(dá)時(shí)間較短免疫原性強(qiáng)Invivo基因治療腫瘤基因治療疫苗腺相關(guān)病毒載體單鏈DNA病毒~5kb

可感染分裂和非分裂細(xì)胞整合到染色體中無(wú)致病性免疫原性弱可長(zhǎng)期表達(dá)外源基因在骨骼肌、心肌、肝臟、視網(wǎng)膜等組織中表達(dá)較高Invivo

基因治療Exvivo基因治療遺傳病基因治療獲得性慢性疾病的基因治療HSV病毒載體雙鏈DNA病毒

152kb具有嗜神經(jīng)性可逆軸突傳遞可潛伏感染容量大可感染分裂和非分裂細(xì)胞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療腫瘤的基因治療2.3溶瘤病毒與癌癥治療通過基因工程手段構(gòu)建出一類只能在癌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制與繁殖，不能在正常細(xì)胞內(nèi)繁殖的重組病毒，病毒在癌細(xì)胞內(nèi)繁殖并釋放子代病毒而特異性裂解癌細(xì)胞，達(dá)到癌癥治療的目標(biāo)，這類重組病毒被稱為溶瘤病毒(oncolyticvirus,OV)。在臨床應(yīng)用中，溶瘤病毒治療既可作為單一治療手段，也可與傳統(tǒng)的化療和放療等手段相結(jié)合治療腫瘤。用于構(gòu)建溶瘤病毒的種類較多，由于DNA病毒的可操作性更強(qiáng)，因此主要集中在使用腺病毒（Ad），單純皰疹病毒(HSV)以及痘病毒（poxvirus）進(jìn)行溶瘤病毒的構(gòu)建，其中HSV因其嗜神經(jīng)性而更多用于腦瘤等治療。目前已經(jīng)有許多溶瘤病毒處于臨床研究階段，而世界上第一個(gè)被批準(zhǔn)上市的商業(yè)化產(chǎn)品為2005年我國(guó)生產(chǎn)的重組人5型腺病毒（H101）溶瘤病毒，主要用于治療晚期鼻咽癌（商品名為安柯瑞），當(dāng)然也可用于治療其他腫瘤如肝癌，胰腺癌，肺癌等。溶瘤病毒H101為缺失了E1-B55KD基因的重組人5型腺病毒，主要通過p53分子信號(hào)途徑來實(shí)現(xiàn)特異性殺死腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生溶瘤治療作用;同時(shí)刪除E3區(qū)78.3～85.8mu基因片段，使腫瘤抗原信息能通過樹突狀細(xì)胞(DC)的傳遞而激活T細(xì)胞產(chǎn)生全身免疫，從而通過局部應(yīng)用產(chǎn)生全身性的抗腫瘤效應(yīng)。在正常細(xì)胞中，腺病毒感染后表達(dá)的早期蛋白（E1A和E1B），與病毒復(fù)制有關(guān)；E1B-55KD還可以降解P53蛋白，有利于病毒的復(fù)制。當(dāng)E1-B55KD被刪除后，一方面與野生型病毒相比復(fù)制能力減低，另一方面不能有效降解P53，所以在正常細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制。而在P53缺陷的腫瘤細(xì)胞內(nèi)，由于P53的缺陷不能誘發(fā)細(xì)胞本身的應(yīng)對(duì)機(jī)制，同時(shí)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的不可控性，從而有利于改建病毒的復(fù)制。不僅僅P53本身的突變，只要涉及P53通路的缺陷都有利于溶瘤病毒H101的選擇性復(fù)制。溶瘤病毒H101HSV-1溶瘤病毒HSV-1病毒載體是另外一種被廣泛使用重組溶瘤病毒的載體，其中一種缺失γ134.5基因的溶瘤病毒被研究最多，該病毒通過干擾素/dsRNA依賴型磷酸激酶途徑（PKR）實(shí)現(xiàn)在癌細(xì)胞繁殖。γ134.5蛋白有兩個(gè)作用，其一是

產(chǎn)生HSV的神經(jīng)毒性主要成分，其二是能阻止由病毒感染所造成的宿主細(xì)胞誘導(dǎo)的蛋白合成下降反應(yīng)，維持病毒繁殖。當(dāng)正常細(xì)胞被γ134.5缺陷性HSV-1病毒感染時(shí)，細(xì)胞會(huì)激發(fā)由磷酸激酶途徑介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)通路，抑制被感染的正常細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，從而抑制溶瘤病毒繁殖。但是癌細(xì)胞內(nèi)能高水平表達(dá)MAPK激酶（MPK），該酶能夠有效促進(jìn)γ134.5缺陷性HSV-1溶瘤病毒的復(fù)制，從而裂解癌細(xì)胞。已有多種基于HSV-1的溶瘤病毒處于臨床研究階段，預(yù)計(jì)很快就有商品面市。通過重組其它免疫增強(qiáng)因子增強(qiáng)溶瘤病毒的溶瘤效果單純使用溶瘤病毒在癌細(xì)胞內(nèi)特異性繁殖裂解癌細(xì)胞用于癌癥治療的效果并非最佳，因此可用通過對(duì)溶瘤病毒進(jìn)行進(jìn)一步改造，如表達(dá)一些促進(jìn)殺滅癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)細(xì)胞因子。一種被命名為M002的HSV-1溶瘤病毒，在缺失γ134.5基因的基礎(chǔ)上同時(shí)插入2拷貝的白介素12（IL-12）表達(dá)盒，以實(shí)現(xiàn)在癌細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)IL-12。IL-12既是一個(gè)前炎癥因子，也具有抗血管生成作用，能夠誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。高表達(dá)IL-12促進(jìn)HSV-1溶瘤病毒對(duì)未感染細(xì)胞的抗腫瘤活性，從而顯著增加了抗腫瘤效果。高表達(dá)IL-12HSV-1溶瘤病毒M002對(duì)治療乳腺癌腦轉(zhuǎn)移具有明顯效果，這種整合溶瘤治療與免疫治療的癌癥方法將是未來發(fā)展方向之一。溶瘤病毒使用時(shí)面臨免疫排斥問題與其他利用病毒載體的進(jìn)行治療一樣，溶瘤病毒作為一個(gè)大的抗原分子，非常容易引起免疫系統(tǒng)的識(shí)別，能產(chǎn)生相應(yīng)抗體及免疫細(xì)胞來清除溶瘤病毒，造成治療效果下降，尤其在多次注射治療情況下，更為嚴(yán)重。因此如何逃避免疫系統(tǒng)清除將是提高溶瘤病毒治療癌癥效果所必須解決的問題之一。2.4病毒與生物防治

生物防治是指利用有益生物及其代謝產(chǎn)物和基因產(chǎn)品等控制有害生物的方法。它具有不污染環(huán)境、對(duì)人和其它生物安全、防治作用比較持久、易于同其它植物保護(hù)措施協(xié)調(diào)配合并能節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)，已成為植物病蟲害和雜草綜合治理中的一項(xiàng)重要措施。除害蟲天敵外，許多昆蟲病源微生物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于害蟲生物防治中，包括特異性感染昆蟲的病原真菌、細(xì)菌與病毒，目前在世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛微生物殺蟲劑是一種名為蘇云金芽胞桿菌的昆蟲病原性細(xì)菌。同時(shí)，人們也一直在開發(fā)昆蟲病毒進(jìn)行害蟲的生物防治，其中殺蟲專一性極強(qiáng)的桿狀病毒是一類很有發(fā)展前途的生物農(nóng)藥之一。桿狀病毒生物殺蟲劑昆蟲桿狀病毒用于防治害蟲始于上世紀(jì)初，目前已有大量桿狀病毒被用于防治果樹，棉花、蔬菜和大豆等作物上的害蟲。桿狀病毒作為生物殺蟲劑,其顯著優(yōu)點(diǎn)是安全性，流行性和持久性,在某些地區(qū)一年使用可多年受益，不破壞生態(tài)平衡，但它也有潛伏期長(zhǎng),殺蟲譜窄的缺點(diǎn)。目前世界上已經(jīng)有數(shù)十種野生型桿狀病毒殺蟲劑注冊(cè)或者商品化生產(chǎn)。我國(guó)自1993年第一個(gè)病毒殺蟲劑產(chǎn)品棉鈴蟲核型多角體病毒(HaSNPV)可濕性粉劑登記以來，已先后有10多種病毒殺蟲劑登記入市。比較成功的實(shí)例有在巴西利用梨豆夜蛾核型多角體病毒(Anticarsia

gemmatalisNPV)防治大豆害蟲大豆螟，以及在南太平洋地區(qū)利用棕櫚獨(dú)角仙病毒防治危害椰子樹的害蟲棕櫚獨(dú)角仙(Oryctesrhinoceros)。我國(guó)使用棉鈴蟲核型多角體病毒大面積防治棉鈴蟲，取得了很好的防治效果?；蚬こ虠U狀病毒作為殺蟲劑野生型桿狀病毒殺蟲譜窄、殺蟲速度慢、時(shí)間長(zhǎng)，施用后4~14天才表現(xiàn)出殺蟲活性。與化學(xué)農(nóng)藥接觸致死不同的是,桿狀病毒殺蟲劑只有當(dāng)昆蟲進(jìn)食足夠量的病毒粒子，通過病毒的復(fù)制增殖來破壞昆蟲組織和器官之后才能起到殺蟲效果。這是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的過程,它與桿狀病毒的施用率、穩(wěn)定性,靶標(biāo)害蟲的生理、遺傳特性及害蟲群體的組成高度相關(guān)。目前主要從3個(gè)方面進(jìn)行進(jìn)行基因改造：一是通過修飾或去除與宿主范圍相關(guān)的基因來拓寬病毒的殺蟲譜，二是插入某些昆蟲選擇性毒素基因以提高殺蟲速度;三是通過缺失某些非必需基因來增加殺蟲效果。（1）將AcMNPV

基因組中DNA復(fù)制所必須的p143

基因用家蠶核型多角體病毒(BmNPV)中的同源片段取代之后,重組病毒就能在不敏感的家蠶細(xì)胞系中復(fù)制，但遺憾的是不能有效地感染家蠶幼蟲。這可能是因?yàn)闂U狀病毒包涵體的口服感染機(jī)制不同于芽生型病毒粒子感染離體細(xì)胞機(jī)制造成的。隨著對(duì)決定桿狀病毒宿主域分子基礎(chǔ)研究的深入，完全有可能研究出殺蟲譜擴(kuò)大到多種害蟲的基因工程病毒。基因工程桿狀病毒殺蟲劑（1）（2）在桿狀病毒基因組中插入外源基因提高殺蟲速度

①表達(dá)蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白的重組病毒。近來，將Bt殺蟲晶體蛋白基因cry1Ab與桿狀病毒多角體基因進(jìn)行融合后，Bt殺蟲晶體蛋白直接包進(jìn)多角體蛋白晶體中，當(dāng)包涵體在昆蟲中腸中堿解后直接釋放出殺蟲晶體蛋白，從而發(fā)揮出毒性功能，使殺蟲時(shí)間縮短了2/3，半數(shù)致死時(shí)間(LT50)從92.8小時(shí)減少到33.9小時(shí)。這是一種極其有應(yīng)用前景的重組病毒（圖17-8）。②表達(dá)昆蟲特異性神經(jīng)毒素的重組病毒。AaIT是來自北非蝎子(Androctonus

australis)的神經(jīng)毒素，在AaIT基因5’端連接一種叫GP64蛋白基因的信號(hào)肽序列,在p10基因啟動(dòng)子控制下可表達(dá)分泌型毒素蛋白。重組病毒對(duì)昆蟲的半致死時(shí)間(LT50)減少25%~40%，被重組病毒感染的昆蟲對(duì)白菜葉面的損害減少50%，是一種有希望用作殺蟲劑的重組病毒。③表達(dá)昆蟲病毒增效蛋白基因。昆蟲病毒增效蛋白能增強(qiáng)多種昆蟲病毒的感染力,縮短殺蟲時(shí)間,也能增強(qiáng)蘇云金芽胞桿菌的殺蟲毒力。如能將增效蛋白直接融合進(jìn)病毒多角體晶體之中，將是一種很有應(yīng)用前景的重組病毒。最近有將幾種方法整合應(yīng)用的例子，如將截短的Bt毒蛋白（cry1-5）與多角體蛋白融合，同時(shí)表達(dá)昆蟲神經(jīng)毒性因子（AaIT）的雙重重組病毒。基因工程桿狀病毒殺蟲劑（2）圖17-8融合蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白、綠色熒光蛋白和多角體蛋白并能形成包涵體的基因工程病毒。

上為重組病毒構(gòu)建圖，PH指多角體基因，Cry1Ac為一種Bt殺蟲晶體蛋白基因，GFP為綠色熒光蛋白報(bào)道基因，箭頭代表啟動(dòng)子，其中P10代表P10基因啟動(dòng)子，Pph代表多角體基因啟動(dòng)子。下圖為重組病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)形成的包涵體(直線所指代表一個(gè)包涵體)，右圖為光學(xué)顯微鏡照片，左圖為熒光顯微鏡照片，綠色代表每個(gè)包含體結(jié)構(gòu)中含有綠色熒光蛋白。

（3）去除病毒非必須基因增加殺蟲效果桿狀病毒的基因組中存在某些與病毒DNA復(fù)制無(wú)關(guān)的非必需基因，如蛻皮激素UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(ecdysteroidUDP-glucosyltransferase,egt)，它促使昆蟲蛻皮和化蛹,缺失egt

的重組病毒可引起幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育失調(diào),加速死亡。缺失egt基因的重組AcMNPV病毒感染草地夜蛾(Spodoptera

frugiperda)幼蟲時(shí)，幼蟲的死亡速度比野生型感染快30%。以缺失egt

基因的AcMNPV

感染粉紋夜蛾(Trichoplusia

ni)幼蟲時(shí),食物消耗減少77%。然而遺憾的是田間試驗(yàn)中重組病毒對(duì)作物保護(hù)程度的提高并沒有實(shí)驗(yàn)室和溫室中的那么明顯。我國(guó)學(xué)者通過將由棉鈴蟲核型多角體病毒(HaNPV)的多角體蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的蝎神經(jīng)毒素基因AaIT插入HaNPV的egt位點(diǎn)，獲得一種既能高表達(dá)AaIT又缺失了egt基因的重組HaNPV。該重組病毒殺二齡棉鈴蟲幼蟲的半致死時(shí)間縮短了32%，是一種很有借鑒意義的基因工程病毒的構(gòu)建模式之一?；蚬こ虠U狀病毒殺蟲劑（3）野生型桿狀病毒無(wú)論是對(duì)生態(tài)環(huán)境,還是對(duì)人和哺乳動(dòng)物都十分安全。但是當(dāng)桿狀病毒基因組中插入諸如昆蟲神經(jīng)毒素等外源基因或異源啟動(dòng)子時(shí),人們擔(dān)心它們是否會(huì)對(duì)其它非靶目標(biāo)造成不利影響甚至威脅。最近研究發(fā)現(xiàn),桿狀病毒雖然不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制和繁殖，但是其病毒粒子可以通過病毒囊膜與哺乳動(dòng)物細(xì)胞融合而進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞（即所謂“感染”哺乳動(dòng)物細(xì)胞），從而介導(dǎo)那些哺乳動(dòng)物細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(如CMV啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)的外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)。這說明重組桿狀病毒有可能是用于基因治療的新途徑，同時(shí)也引起科學(xué)家和大眾的對(duì)基因工程桿狀病毒安全性的更加廣泛的關(guān)注和研究?；蚬こ滩《練⑾x劑的生物安全性目前的實(shí)驗(yàn)研究表明，基因工程桿狀病毒無(wú)論是對(duì)非靶目標(biāo)鱗翅目昆蟲、非鱗翅目節(jié)肢動(dòng)物,還是對(duì)脊椎動(dòng)物均是安全的。雖然許多研究表明重組桿狀病毒能在某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中代肝癌細(xì)胞和傳代肝細(xì)胞中表達(dá)外源基因,但是病毒基因組不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，重組病毒更加不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中繁殖,因此表達(dá)外源產(chǎn)物逐漸被降解,不會(huì)對(duì)受試細(xì)胞產(chǎn)生感染性病理效應(yīng)。基因工程病毒是安全的（1）基因工程桿狀病毒的安全性的另一問題是插入的外源基因的轉(zhuǎn)移或與其它有機(jī)體的遺傳重組，尤其是當(dāng)這種病毒被釋放到環(huán)境中以后，某些被插入的毒素基因(如神經(jīng)毒素基因)是否會(huì)轉(zhuǎn)移到其它生物體中并經(jīng)過長(zhǎng)期進(jìn)化后會(huì)在合適啟動(dòng)子下進(jìn)行表達(dá)，這是令許多人擔(dān)憂的事情。評(píng)價(jià)這種風(fēng)險(xiǎn)時(shí),有兩點(diǎn)需要考慮,一是重組病毒與其它有機(jī)體進(jìn)行遺傳交換的可能性,二是這種事件的后果。在自然界中,有機(jī)體間遺傳交換時(shí)有發(fā)生，但遺傳交換并不總能發(fā)生。種的遺傳完整性受到基因運(yùn)動(dòng)屏障的保護(hù),這種屏障限制遺傳交換的可能性和類型。一個(gè)重要的屏障是供體和受體需要具有共同的復(fù)制部位。對(duì)桿狀病毒而言,遺傳交換必須在受感染昆蟲的細(xì)胞內(nèi),所以桿狀病毒和潛在的受體有機(jī)體必須在受感染昆蟲的細(xì)胞內(nèi)中復(fù)制增殖。同時(shí),在亞細(xì)胞水平上,交換受到細(xì)胞區(qū)域化限制,由于桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞核中復(fù)制,與之交換潛在對(duì)象的遺傳物質(zhì)必須存在于細(xì)胞核中才可能發(fā)生。另一屏障是供體和受體遺傳物質(zhì)的性質(zhì),即便是兩種病毒感染同一宿主并在同一宿主的細(xì)胞器中復(fù)制,但兩者基因組組成和復(fù)制方式的差別也將限制其交換遺傳信息。此外,供體和受體的同源程度高直接影響遺傳交換的可能性。基因工程病毒是安全的（2）第