第三節(jié) 基因工程的基本操作程序2

一、基因表達(dá)載體的目的（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。二、基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標(biāo)記基因調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶半乳糖苷酶酶酶

RNA聚合酶啟動子RNA聚合酶啟動子：位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。思考1：

表達(dá)載體為什么一定要有啟動子？（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能有利于基因的表達(dá)；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體細(xì)胞無法轉(zhuǎn)錄。思考2：終止子的作用是什么？

終止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來。思考3：標(biāo)記基因有什么作用？用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶相同的黏性末端切口DNA連接酶1.過程:二、構(gòu)建表達(dá)載體——核心質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種過程:真題演練（2012海南）已知甲種植物因受到乙種昆蟲危害而減產(chǎn)，乙種昆蟲食用某種原核生物分泌的丙種蛋白后死亡。因此可以將丙種蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)入到甲種作物體內(nèi)，使甲種農(nóng)作物獲得抗乙種昆蟲危害的能力。據(jù)此，回答下列問題：（2）在利用上述丙種蛋白質(zhì)基因和質(zhì)粒載體構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程中，常需要使用()酶和（）酶思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？（P15）

不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用的受體細(xì)胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。（一）轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①特點(diǎn)：

易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②原理：

Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。③轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。（2）基因槍法適用于單子葉植物（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。適用于被子植物胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊12．（2008山東）為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的_____處，DNA連接酶作用于_______處。（填“a”或“b”）（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和_____________法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用____________________技術(shù)，該技術(shù)的核心是________________和_________________。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的______________做探針進(jìn)行分子雜交檢測，又要用_____________方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。2.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考：為什么要用受精卵而不用體細(xì)胞？（2）操作程序:提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵顯微注射移植到子宮受精卵發(fā)育新性狀動物常用法：Ca2+處理常用菌：大腸桿菌微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞思考：為什么要用Ca2+處理受體細(xì)胞？用Ca2＋處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性受體生物植物動物微生物受體細(xì)胞導(dǎo)入方法受精卵體細(xì)胞受精卵細(xì)胞/個體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)用Ca2+處理成感受態(tài)細(xì)胞采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的作法正確的是（）