凝膠過濾層析

代謝調節(jié)實驗帶教:實驗報告的書寫一、實驗目的二、實驗原理三、操作步驟四、實驗結果五、分析討論實驗一凝膠過濾層析法分離蛋白質1.掌握凝膠過濾層析法的基本原理；2.掌握凝膠過濾層析法分離蛋白質的過程。一、實驗目的二、實驗原理1.常用生化分析技術

分光光度技術電泳技術離心技術生物大分子制備技術層析技術2.層析技術（色譜技術）

是利用混合物中各組分的理化性質差異（吸附力、溶解度、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力等）建立起來的技術。（1）層析系統(tǒng)的基本組成

固定相+流動相固體物質/固定于固體物質的成分可以流動的物質：如水和各種溶媒待分離混合物（A、B）隨流動相通過固定相

由于理化性質差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對比）不同與固定相相互作用力越弱的組分，隨流動相移動時受到的阻滯作用小，移動速度快分步收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，從而達到將各組分分離的目的（2）層析法的分類

按兩相所處狀態(tài)分類

流動相液體氣體固定相液體液—液層析法氣—液層析法固體液—固層析法氣—固層析法

按層析原理分類

名稱原理吸附層析法固定相為固體吸附劑，利用各組分在吸附劑表面吸附能力不同而分離分配層析法各組分在流動相和固相中的分配系數不同離子交換層析法固定相是離子交換劑，各組分與離子交換劑親和力不同而分離親和層析法固定相只能與一種待分離組分專一結合，以此和無親和力的其它組分分離凝膠層析法固定相是多孔凝膠，各組分的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同

按操作形式不同分類

名稱操作形式柱層析法固定相裝于層析柱內，使樣品沿著一個方向前移而達分離的層析法，包括一般柱層析法、毛細管層析法和微粒填充柱層析法平面層析法層析過程在固定相構成的平面層內進行的層析法，包括紙層析法、薄層層析法和薄膜層析法（3）層析技術的優(yōu)點

分離效率高分析速度快具有極高的靈敏度應用范圍廣適用：雜質多、含量少的復雜樣品分析，尤其適用于生物樣品的分離分析3.凝膠過濾層析法

（gelfiltrationchromatography）（1）原理：

根據分子大小的差別進行分離。每個凝膠顆粒好象一個篩子，小分子物質可以進入顆粒內部，大分子物質被排阻在外。

又名分子篩過濾，排阻層析（2）凝膠的特點

屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件較溫和，可在相當廣的溫度范圍內進行，不需要有機溶劑，對于高分子物質有很好的分離效果。

交聯葡聚糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠瓊脂糖凝膠（3）凝膠的選擇葡聚糖凝膠(商品名:Sephadex，Dextran)

型號:G-10–G-200多孔網孔結構數字愈小,交聯度越大,被篩分物質的分子量也愈小吸水能力，每g干膠吸水量的10倍SephadexG-50：對多肽及蛋白質的篩分范圍(分子量)為:1500–30000SephadexG-200：對多肽及蛋白質的篩分范圍(分子量)為:5000–80000例：B.瓊脂糖凝膠

(商品名:Sepharose,Bio-gel–A)

對實驗條件要求高(溫度,pH)

＜40℃4.5-9.0

工作的下限是葡聚糖凝膠工作的上限,

用于大分子物質的分離C.聚丙烯酰胺凝膠商品名:Bio–gel–P（生物膠P）三、實驗操作1.柱的選擇直徑：1~5cm

一般長度：直徑=10：1~20：1

本實驗玻柱：直徑0.8~1.5cm

長度17~20cm2.凝膠選擇、制備

血紅蛋白溶菌酶分離（64500）（11400）選擇SephadexG-50SephadexG-50：對多肽及蛋白質的篩分范圍(分子量)為:1500–30000制備：將干膠顆粒懸浮于5~10倍的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉出去3.凝膠裝柱①柱固定于架子上，垂直放置，關住出口②自頂部緩緩加入葡聚糖懸液，使G-50開始下沉，至1~2cm時，打開出口③凝膠逐層上升，至頂部2-3cm時，關閉出口注意點：

垂直放置防止氣泡產生防止柱的分層4.平衡放置一段時間，約40分鐘（使凝膠更好的壓實）注意：防止床面干涸，可適當補充蒸餾水5.加樣①加樣前打開出口，使床面的蒸餾水流出，正好露出床面時，立即關閉出口（將干未干）②用滴管將混合樣品(0.6ml，即血紅蛋白和溶菌酶各0.3ml)緩緩沿柱內壁小心加于床表面③打開出口，使樣品進入床內，直到床面重新露出,

立即加入1~2倍于樣品體積的蒸餾水6.洗脫當此少量蒸餾水接近流干時，反復多次加入蒸餾水，進行洗脫，直到兩帶分開檢查Hb在層析床中色帶位置，待Hb洗脫完后，用試管分步收集洗脫液③10d/管，每管加NaOH2d，CuSO42d④