森林動(dòng)植物檢疫學(xué)(08森保)第4章 森林動(dòng)植物檢疫檢驗(yàn)方法與技術(shù)

第四章森林動(dòng)植物檢疫檢驗(yàn)方法與技術(shù)在森林動(dòng)植物檢疫中，以發(fā)現(xiàn)、檢出和鑒定危險(xiǎn)性有害生物為目的，作為出具證明或進(jìn)行檢疫處理的科學(xué)依據(jù)，所進(jìn)行的現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，即為森林動(dòng)植物檢疫檢驗(yàn)。或者使用一定的技術(shù)手段，對(duì)應(yīng)檢的森林動(dòng)植物及其產(chǎn)品等進(jìn)行檢查與檢驗(yàn)，以確定其是否攜帶檢疫對(duì)象，就叫森林動(dòng)植物檢疫檢驗(yàn)。

檢疫檢驗(yàn)的方法與技術(shù)非常重要。因?yàn)檫@將直接決定著結(jié)果的正確與否。一旦出現(xiàn)漏檢或誤檢，很可能就會(huì)造成危險(xiǎn)性有害生物的傳播與擴(kuò)散，給輸入地的林業(yè)生產(chǎn)和林業(yè)生態(tài)系統(tǒng)帶來危害，或者影響貿(mào)易流通，給貨主造成經(jīng)濟(jì)損失。

第一節(jié)檢疫檢驗(yàn)與抽樣一、檢疫檢驗(yàn)的類型、要求及相關(guān)名詞1、類型：按檢疫任務(wù)劃分：內(nèi)檢、外檢；按貨物的流向劃分：前檢（裝運(yùn)前的檢疫）、關(guān)檢（關(guān)卡檢疫）、后檢（引入后的檢疫）；

按檢疫地點(diǎn)劃分：產(chǎn)地檢疫檢驗(yàn)、調(diào)運(yùn)檢疫檢驗(yàn)；按管理體制劃分：農(nóng)業(yè)檢疫檢驗(yàn)、森林檢疫檢驗(yàn)、口岸檢疫檢驗(yàn)。按檢疫對(duì)象劃分：害蟲、病害、雜草的檢疫檢驗(yàn)。但無論哪種檢疫檢驗(yàn)，都要進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。2、檢疫檢驗(yàn)的要求：

準(zhǔn)確、快速、安全（對(duì)環(huán)境、不擴(kuò)散有害生物）3、現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)：

是指按規(guī)定抽取樣本，直接觀察或借助于放大鏡，檢查應(yīng)檢物上有沒有蟲體、表現(xiàn)癥狀等，以確定應(yīng)檢物是否攜帶或感染危險(xiǎn)性有害生物。4、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)：如果現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)不能鑒定出病、蟲、雜草時(shí)，則需要抽取一些有代表性的樣品，或者病、蟲、雜草等，帶回實(shí)驗(yàn)室，做進(jìn)一步的檢驗(yàn)和鑒定。

實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，就是借助實(shí)驗(yàn)室的各種儀器、設(shè)備，對(duì)待檢樣品進(jìn)行有害生物的檢查和鑒定。包括解剖檢驗(yàn)、過篩檢驗(yàn)、比重檢驗(yàn)、染色檢驗(yàn)、分子生物學(xué)檢驗(yàn)等。二、抽樣的基本概念在動(dòng)植物檢疫的實(shí)際工作中，抽樣一般是建立在“批”的基礎(chǔ)上的，是在“批”的范圍內(nèi)展開抽樣的。

“批”的概念，是指來自同一國(guó)家或地區(qū)、同一日期、使用同一運(yùn)輸工具、同一物品名、同一商品標(biāo)準(zhǔn)、有同一收貨人或發(fā)貨人的一批貨物。在一批貨物中，每一個(gè)獨(dú)立的袋、箱、筐、桶、捆、托等稱為“件”。散裝貨物不存在“件”，以100~1000kg為一件計(jì)算。

按規(guī)定的方法，從一批貨物中抽取一定量的代表性部分，即為樣品。樣品又可以分為很多級(jí)：

1、小樣（初級(jí)樣品）：是由一批貨物的不同容器，或散堆的不同層次、部位，分別抽取的樣品。

2、混合樣品（原始樣品）：是指將所抽取的小樣進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕旌希闯苫旌蠘悠贰?/p>

3、平均樣品（送檢樣品）：是指將混合樣品進(jìn)行機(jī)械分樣或?qū)蔷€分樣，以減少樣品的數(shù)量。但足夠檢驗(yàn)檢測(cè)用。

4、試驗(yàn)樣品：從送檢樣品中抽出一部分，進(jìn)行檢驗(yàn)分析，即為試驗(yàn)樣品。

5、試料：投入到檢驗(yàn)中，獲得檢測(cè)值并賴以計(jì)算的那一部分樣品，稱為試料。三、抽樣標(biāo)準(zhǔn)

為使抽樣具有科學(xué)性，各國(guó)都制定了相關(guān)的抽樣標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)的動(dòng)植物檢疫抽樣標(biāo)準(zhǔn)，在《農(nóng)業(yè)植物調(diào)運(yùn)檢疫規(guī)程》（GB15569-1995）、《對(duì)外植物檢疫操作規(guī)程》、《進(jìn)口動(dòng)物產(chǎn)品和飼料檢疫管理工作程序》、《出入境動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品檢疫采樣標(biāo)準(zhǔn)》、《國(guó)內(nèi)森林植物檢疫技術(shù)規(guī)程》等文件中，

都有明確、具體的規(guī)定。（一）森林植物及其產(chǎn)品的抽樣標(biāo)準(zhǔn)森林動(dòng)植物抽樣，常采用百分比法（容量百分比、重量百分比）抽樣，即不論貨物批量大小，均按照相同的比率，從每批貨物中抽取一定數(shù)量的樣本。

根據(jù)《國(guó)內(nèi)森林植物檢疫技術(shù)規(guī)程》的規(guī)定，不同種類的森林植物及其產(chǎn)品的抽樣標(biāo)準(zhǔn)如下：1、種子和果實(shí)（干、鮮果）：按一批貨物的總數(shù)或總件數(shù)抽樣，抽樣數(shù)量為0.5%~5%。2、鮮活繁殖材料：苗木（含試管苗）、塊根、塊莖、球莖、鱗莖、砧木、插條、接穗、花卉等繁殖材料，按一批貨物的總件數(shù)抽樣，抽樣數(shù)量為1%~5%。3、木材類：原木、鋸材、竹材、藤及其制品（含半成品），按一批貨物的總數(shù)或總件數(shù)抽樣，抽樣數(shù)量為0.5%~10%。4、生藥材：5、散裝物：6、其他森林植物及其產(chǎn)品：7、試驗(yàn)樣品的抽取數(shù)量：（二）森林動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品抽樣標(biāo)準(zhǔn)（略）四、抽樣方法抽樣時(shí)，要考慮應(yīng)檢的有害生物的生物學(xué)特性、分布規(guī)律，貨物的種類、包裝、數(shù)量、存放場(chǎng)所及裝載方式等因素，也要考慮抽樣的均勻性及代表性。常用的抽樣方法有對(duì)角線取樣、棋盤式取樣、分層取樣、隨機(jī)取樣等。1、對(duì)角線取樣

調(diào)運(yùn)檢驗(yàn)時(shí)，在每一車廂、船艙、堆垛貨物上，可采用對(duì)角線法進(jìn)行取樣。產(chǎn)地檢疫時(shí)也可用此法。2、棋盤式取樣

在車廂、船艙對(duì)貨物進(jìn)行檢驗(yàn)，或在產(chǎn)地檢驗(yàn)時(shí)，可采用棋盤式取樣。3、分層取樣如果貨物堆垛較高時(shí)，常采用分層取樣。先將貨物分成上、中、下三層，然后，再從各層中分別抽樣。4、隨機(jī)取樣

有時(shí)由于貨物、苗木等分布不均勻，也可采用隨機(jī)取樣法進(jìn)行取樣。

不論哪種取樣方法，在取樣時(shí)，應(yīng)盡量抽取那些懷疑具有有害生物的樣本。

應(yīng)注意，每份樣品必須附有標(biāo)簽，記明樣品的種類、來自何地、批次、件數(shù)、取樣日期、取樣方式及貨物堆放場(chǎng)所。第二節(jié)蟲、螨、雜草種子的檢驗(yàn)一、直接檢驗(yàn)

用眼睛或者借助于放大鏡，直接識(shí)別害蟲（包括為害狀）、螨類及雜草種子的一種方法。直接檢驗(yàn)，多用于現(xiàn)場(chǎng)快速初檢。

主要是檢查動(dòng)植物及其產(chǎn)品，裝載容器、包裝物及墊鋪材料，運(yùn)載工具，堆放場(chǎng)所等各類應(yīng)檢物，是否帶有或混有害蟲的各個(gè)蟲態(tài)及死、活蟲體、是否帶有害蟲的排泄物、蛻皮、繭及其它遺留物，是否有害蟲及螨類的為害狀，是否有雜草籽、葉、莖等。

應(yīng)檢物不同，檢查的側(cè)重點(diǎn)也就有所不同。1、種實(shí)：在檢查種實(shí)的時(shí)候，應(yīng)仔細(xì)觀察種實(shí)的形狀、色澤、表面是否有細(xì)小孔洞，查看種實(shí)間是否混有蟲體、蟲卵、蛻皮、排泄物、雜草的種實(shí)或其他可疑物。2、其他繁殖材料：檢查苗木、花卉、插條、接穗等繁殖材料時(shí)，應(yīng)注意觀察根、莖、葉、芽各部位，特別是皮部的縫隙和孔洞、包卷的葉片和芽苞，更應(yīng)仔細(xì)檢查，看看這些部位是否有蟲體、是否有為害狀等。

對(duì)于塊根、塊莖、鱗莖，應(yīng)特別注意芽眼、凹陷處、傷口和附著的土壤，仔細(xì)檢查是否有害蟲（或螨類）及其為害狀，是否附著有雜草的種子。3、木材類：檢查原木、藤材、竹材時(shí)，應(yīng)仔細(xì)觀察這些木材表面有無蟲孔、蟲糞、蛀屑和蟲體。如果感覺可疑，再進(jìn)行解剖檢查，以便找到蟲體。4、堆放貨物：

對(duì)堆放貨物的四周殘留的碎屑及散遺物，應(yīng)認(rèn)真檢查，不能遺漏。

發(fā)現(xiàn)和檢出害蟲、螨、雜草種子后，應(yīng)根據(jù)形態(tài)特征鑒定到種。若現(xiàn)場(chǎng)不能確定到種類時(shí)，則帶回室內(nèi)，經(jīng)過飼養(yǎng)或分離培養(yǎng)后，再做鑒定。二、染色檢驗(yàn)染色檢驗(yàn)法，是指利用不同種類的化學(xué)藥品，對(duì)森林動(dòng)植物及其產(chǎn)品的某一組織進(jìn)行染色。然后根據(jù)顏色的變化，判斷其是否攜帶有害生物。

染色檢驗(yàn)，主要用于檢驗(yàn)種實(shí)和植物組織中隱藏的害蟲?？蓹z出帶蟲籽粒。

常用的染色檢驗(yàn)方法如下。

1、高錳酸鉀染色法

用于檢查種子中的米象、谷象等害蟲。將樣品去雜后，置于鐵（銅）絲網(wǎng)袋中；在30℃的溫水中浸1min，再移入1％高錳酸鉀溶液中浸1min，取出，用清水沖洗掉附著在種子表面的高錳酸鉀，再將種子放置在白瓷盤或白紙上，用放大鏡仔細(xì)檢查。若種粒上有直徑0.5mm的紫黑色點(diǎn)，再解剖種粒檢查，并鑒定種類。

2、碘或碘化鉀染色法適合于稀有珍貴種子的檢驗(yàn)，能在不破壞被檢種子的前提下，檢查種實(shí)內(nèi)是否帶蟲，主要用于檢查豆象類害蟲。將待檢驗(yàn)種子放入鐵紗網(wǎng)中（或用紗布包裹），浸入1％碘化鉀（或碘酒）溶液中1~1.5min，然后再浸入0.5％氫氧化鉀（氫氧化鈉）溶液中20~30s，顯色后立即取出，用清水沖洗20~30s，然后倒入白瓷盤內(nèi)，用擴(kuò)大鏡觀察。若種粒表面有直徑l~2mm黑色圓點(diǎn)或種皮有異常色變，則其內(nèi)部可能隱藏有豆象；再逐粒解剖檢查異常種粒，并鑒定種類。3、品紅染色法

取樣品適量倒入鐵絲網(wǎng)上，在30℃溫水中浸1min，然后移入酸性品紅溶液中，浸2~5min，取出用清水沖洗干凈，在白色底物上用放大鏡檢查。若表面有0.5mm的櫻桃紅小點(diǎn)，且顏色較深、斑點(diǎn)規(guī)則，即解剖檢查，并鑒定種類。三、過篩檢驗(yàn)

過篩檢驗(yàn)，是指根據(jù)健康種子與蟲體、蟲卵、蟲癭、雜草種子等個(gè)體大小的差異，將應(yīng)檢物品通過不同孔徑的規(guī)格篩、分離檢出的方法。

主要用于現(xiàn)場(chǎng)和室內(nèi)檢驗(yàn)種子、油料、小粒干果、生藥材等當(dāng)中的害蟲、螨類等。

篩選時(shí)，放入樣品的量不宜過多或過少。樣品多時(shí)，種子在篩內(nèi)沒有來回振蕩的余地，要檢查的對(duì)象不宜篩出。篩選振蕩的時(shí)間，也不宜過長(zhǎng)或過短。時(shí)間短，夾雜在種實(shí)間的蟲體不能全部篩出；時(shí)間長(zhǎng)，蟲體的附肢在種實(shí)間反復(fù)摩擦，容易被損壞而不利于鑒定。過篩檢驗(yàn)顆粒狀干果、生藥材等植物產(chǎn)品時(shí)，可在貨物（或種子堆垛）的不同部位，抽取一定數(shù)量的樣品。根據(jù)種粒及蟲體的大小，來選擇相應(yīng)孔徑的標(biāo)準(zhǔn)篩和篩層。按照篩層孔徑的大小（大孔徑的篩層在上，小孔徑的篩層在下）依次套好。然后將樣品放入篩的最上層，樣品以占該篩層容積的2／3為宜。加蓋后，用回旋法篩選。手動(dòng)篩選時(shí)，左右擺動(dòng)20次；機(jī)械篩選時(shí)，振蕩時(shí)間應(yīng)根據(jù)蟲種而定，但一般振蕩篩選0.5min即可（圖4~3）。篩后，將第1層、第2層、第3層…的篩出物，分別倒入白瓷盤內(nèi)成一層，用肉眼或擴(kuò)大鏡仔細(xì)檢查其中的害蟲、害蟲排泄物、繭、植物殘?bào)w、雜草種子等，并分類收集，以備識(shí)別、鑒定和保存。

將最下層篩底的雜物收集，放入黑色玻璃板或培養(yǎng)皿中，用雙目解剖鏡仔細(xì)檢查其中小個(gè)體的害蟲、蟲卵、螨類和雜草種子等。也要分類收集，以備識(shí)別、鑒定和保存。

在氣溫較低時(shí)，部分害蟲有凍僵、休眠、假死習(xí)性，可將各層篩出物置于20~30℃溫箱內(nèi)，處理15~20min，待其復(fù)蘇后再檢查。

所檢查種子當(dāng)中的害蟲、螨類、雜草種子的含量計(jì)算公式：害蟲含量（頭/kg）＝[害蟲頭數(shù)或卵粒數(shù)／代表樣品質(zhì)量（g）]×1000四、比重檢驗(yàn)

比重檢驗(yàn)，是根據(jù)健康種實(shí)與被害種實(shí)、有害生物間比重的差異，使用不向濃度的溶液或清水，將它們分離開來的一種方法。

尤其在種子含蟲率較低的情況下更為實(shí)用?？蓹z出混雜在種實(shí)間的害蟲、線蟲的蟲癭、菌核、雜草籽及隱藏在種實(shí)組織內(nèi)部的害蟲。

比重檢驗(yàn)如果與其他檢驗(yàn)方法相結(jié)合，很容易查出要檢查的害蟲，能縮短檢疫檢驗(yàn)的時(shí)間，提高工作效率。1、方法按照種子、溶液1:5的比例，將供試的種子樣品，放入事先準(zhǔn)備好的清水或溶液中。用玻璃捧充分?jǐn)嚢韬笥?jì)時(shí)，按照預(yù)定的靜置時(shí)間，撈出漂浮于上層的種子，分別放在培養(yǎng)皿中，解剖檢查。2、溶液選擇供漂選分離種實(shí)的溶液很多，如清水、糖水、鹽水、酒精、硝酸鐵溶液、硝酸銨溶液等。如果檢查種粒較重的林木種實(shí)，可選用食鹽水（常用濃度為20％）、硝酸鐵溶液；檢查種粒較輕的種實(shí)時(shí)，可選用清水和硝酸銨溶液。3、濃度選擇同一種溶液，濃度越大，浮力越大。若濃度選擇不當(dāng)，健康與被害種實(shí)則不容易分離。檢查種粒較重的種實(shí)時(shí)，可選用高濃度的溶液；檢查種粒較輕的種實(shí)時(shí)，選用的濃度應(yīng)低一些。4、滯留時(shí)間

種實(shí)在溶液中的滯留時(shí)間，因種類不同，差異很大。不論哪類種子，在溶液中浸泡到一定程度，都會(huì)全部下沉。因此，選擇健康與被害種實(shí)在溶液中的滯留時(shí)間時(shí)，應(yīng)因種類而確定。如一般林木種實(shí)，在清水中靜置1min即可；但要利用清水分離漂選落葉松種子小蜂為害的種子時(shí)，必須在水中滯留10h以上。五、形態(tài)檢驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)、室內(nèi)檢驗(yàn)中，要特別注意采集各類害蟲、螨類、雜草的實(shí)物標(biāo)本，然后根據(jù)其特征，與相關(guān)的資料、文獻(xiàn)中記載的檢疫性有害生物的形態(tài)特征進(jìn)行比較，以確認(rèn)其種類，為檢疫處理、簽證和放行提供依據(jù)。

1、害蟲和螨類的形態(tài)檢驗(yàn)使用的工具主要是解剖鏡（體視顯微鏡），需要進(jìn)行細(xì)微特征鑒別的，還要使用掃描電鏡。

進(jìn)行形態(tài)鑒別時(shí)，應(yīng)該將所采集的標(biāo)本的特征，與文獻(xiàn)中記載的特征進(jìn)行仔細(xì)比較。必要時(shí)，請(qǐng)分類學(xué)家或?qū)＜覍?duì)所采集標(biāo)本的鑒定結(jié)果進(jìn)行核實(shí)，以避免誤鑒。

2、病原的形態(tài)檢驗(yàn)

使用的主要工具是顯微鏡，必要時(shí)也使用透視或掃描電鏡。

對(duì)病原進(jìn)行鑒定時(shí)，不應(yīng)只根據(jù)其形態(tài)特征判別病原的種類，必要時(shí)，還應(yīng)參考病原的培養(yǎng)性狀（如菌落特征）、生化特征等，來確定病原的種類。

3、雜草的形態(tài)檢驗(yàn)

在檢疫檢驗(yàn)中，如果收集到可疑的雜草種子，應(yīng)首先對(duì)照有關(guān)資料進(jìn)行鑒定。如果不能確定種類，則應(yīng)進(jìn)行種植鑒定：①外觀形態(tài)（目測(cè)、鏡檢）鑒定。根據(jù)形狀、大小、顏色、斑紋、種臍、附屬物等進(jìn)行鑒定。但也受環(huán)境、成熟度的影響。②解剖特性（浸泡軟化后進(jìn)行）鑒定。根據(jù)內(nèi)部的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、顏色、胚乳質(zhì)地，胚的形狀、大小、位置、顏色、子葉數(shù)目進(jìn)行鑒定。③幼苗鑒定。根據(jù)萌發(fā)方式、胚芽鞘、胚軸、子葉、初生葉的形態(tài)，甚至氣味和分泌物等鑒定。④成株鑒定（在隔離試種圃進(jìn)行）。根據(jù)花、果等鑒定。六、其他檢驗(yàn)方法森林動(dòng)植物檢疫檢驗(yàn)，除上述4種常用的方法外，還有x射線檢驗(yàn)、解剖檢驗(yàn)、誘捕器檢驗(yàn)、螨類分離器檢驗(yàn)等，也較常用。1、x射線檢驗(yàn)x射線檢驗(yàn)，是利用x射線的透視攝影原理，根據(jù)被檢物品在熒光屏、膠片上所產(chǎn)生的影像，判斷被檢物品的組織內(nèi)，是否帶有害蟲的一種檢驗(yàn)方法。

適合檢查潛伏于稀有珍貴的種子、種苗織織內(nèi)部的害蟲，適于用檢查種子、果實(shí)、藥材、木材等。

現(xiàn)用于檢驗(yàn)種子的軟X光機(jī)，主要為HY—35型農(nóng)用x光機(jī)（圖4~4），常用的波長(zhǎng)為0.06-0.09nm的軟x射線。

x光檢查種子、苗木的原理是：

種子、苗木、害蟲的物質(zhì)組成與組織密度不同，所透過的X射線的多少也不一樣。種苗的組織密度較大、透過的x射線較少；害蟲的組織密度較小、透過的射線則較多。在x光機(jī)的熒光屏上，即可顯現(xiàn)出種子、種苗和害蟲的不同圖像。我們就可以清楚地觀察到，潛伏于種子、種苗組織內(nèi)部的害蟲的形態(tài)和位置，從而辨別出種子和種苗組織內(nèi)有無害蟲及為害情況。軟x光檢驗(yàn)，是一種比較簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法，不破壞害蟲的生境，還可用于定期跟蹤檢驗(yàn)。

使用x光機(jī)時(shí)，要根據(jù)供試樣品的結(jié)構(gòu)、密度、厚度和感光材料，選用不同的電壓、電流、曝光時(shí)間進(jìn)行攝影。在攝影過程中，應(yīng)不斷調(diào)整電壓、電流，從膠片上的影像來分析攝影條件，以獲得清晰的圖像為準(zhǔn)。軟X射線檢驗(yàn)的方法有2種：一種是用2、3號(hào)放大紙直接攝影，每次只可得到一幅照片；另一種是利用膠片攝影，1次可得到多張照片，而且可以放大。使用膠片攝影時(shí)，以成本較低的8DN黑白文件反拍片、或者能夠拍攝細(xì)小種粒的8DN電影拷貝片，效果最好。

具體操作方法如下。首先在暗室，將放大紙或黑白文件反拍膠片按照需要的尺寸切好，裝入黑紙袋中，并做好反、正面的標(biāo)記。再將被檢的種苗樣品放在黑紙袋（放大紙或膠片的正面）上，置于HY—35型農(nóng)用軟x光機(jī)載物臺(tái)上，調(diào)好焦距，打開電源，調(diào)好電壓、電流和曝光時(shí)問，開機(jī)拍攝。

然后，在暗室將放大紙或膠片取出，用D—72顯影液顯影、酸性定影液定影，最后根據(jù)照片上的害蟲影像進(jìn)行識(shí)別。種殼、種仁連成一體且白色的，為健康飽滿的種子；種殼輪廓清晰，種殼內(nèi)呈暗灰色的，為空粒種子；種殼輪廓清晰、種殼內(nèi)暗灰色，在暗灰色中央有一個(gè)白色幼蟲的影像的，為被害種子，若暗灰色中央，有幾個(gè)白色幼蟲的影像重疊在一起的，常為寄生天敵的幼蟲。

2、解剖檢驗(yàn)

解剖檢驗(yàn)，就是將疑似潛藏有某種害蟲和螨類的森林植物及其產(chǎn)品，用工具剖開，然后進(jìn)行檢驗(yàn)的一種檢驗(yàn)方法。

常在直接、染色、比重、x射線等檢驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上使用；也用于室內(nèi)熏蒸、野外帳幕熏蒸、真空熏蒸、微波加熱等處理效果的檢查。

適用于檢查被害狀明顯，蛀入到森林植物及其產(chǎn)品組織內(nèi)的害蟲、螨類，如鉆蛀種子、果實(shí)、木材害蟲的檢驗(yàn)。解剖種粒時(shí)，為盡量獲取完整的蟲體，便于種類鑒定，要根據(jù)種粒大小，種皮、果皮的堅(jiān)硬程度，選擇相應(yīng)的工具（如鷹嘴剪、手術(shù)剪、大頭針、手指擠壓、鉗子等），按照害蟲在種實(shí)內(nèi)所處的位置，來確定下針、下剪的位置，以免損壞蟲體，不利于種類的鑒定。3、誘捕器檢驗(yàn)

誘捕器檢驗(yàn)，主要是根據(jù)某些害蟲對(duì)某種化學(xué)物質(zhì)有趨性的特點(diǎn)，將對(duì)害蟲有引誘作用的特殊化學(xué)物質(zhì)（性信息素或誘餌）放于誘捕器中，然后將誘捕器掛在適當(dāng)場(chǎng)所，誘集需要檢查的害蟲。

該辦法常用于產(chǎn)地、港口、貨場(chǎng)等地的現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)。

誘芯是誘集劑的負(fù)載材料，可以是塑料、橡膠、脫脂棉、海綿等材料。誘芯不同，負(fù)載能力和釋放速率差異很大，使用時(shí)需仔細(xì)選擇。經(jīng)常使用的誘集劑，主要有信息素和誘餌2類。信息素，是一種靈敏度高、特異性很強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，誘集檢疫性害蟲的效果較好，可以節(jié)省大量的抽樣工作員。例如，白楊透翅蛾信息素，美國(guó)白蛾信息素，松縱坑切梢小蠹、西部松大小蠹、歐洲榆小蠹等由雌蟲分泌的聚集信息素，實(shí)蠅類的信息素等。其成分主要是誘蟲醚、誘蠅酮、實(shí)蠅酯等物質(zhì)。誘餌，則是利用害蟲的趨化性，將害蟲所嗜好的特殊化學(xué)物質(zhì)與食物，按一定比例制成誘餌。例如糖醋液可誘集球果蠅等。捕器的種類很多，常用的有船形、三角形、圓筒形等。誘捕器的設(shè)置方法和掛放數(shù)量，要根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)情況、誘集劑、害蟲種類而定。在苗圃、花圃、果園、種子園等地，可將誘捕器掛在附近的樹枝上，或用支架等架起。在港口、貨場(chǎng)等種苗、原木的集散地，可將誘捕器掛在離地面1~2m高的物體上。

掛放誘捕器后，應(yīng)每天檢查1次。并根據(jù)誘集劑的有效期，及時(shí)更換誘芯。4、螨類分離器檢驗(yàn)

在進(jìn)行種子及其加工品檢驗(yàn)或過篩檢驗(yàn)螨類時(shí)，由于螨類喜濕、怕干、畏熱等習(xí)性，需要用螨類分離器，即以加溫的方法檢出種子中的螨類。

每次可稱取100~200g應(yīng)檢物，將其均勻鋪在分離器的細(xì)金屬絲紗盤上，厚度約5mm，并在金屬網(wǎng)下放置干凈的玻璃片（或黑玻璃板），玻璃板四周預(yù)先涂上一薄層甘油，以防止螨類逃逸。然后加熱，使盤面溫度保持在43~45℃、持續(xù)20~30min。

再詳細(xì)檢查盤下的玻璃板上是否有螨類，并計(jì)算其數(shù)量、收集標(biāo)本（注名樣品來源、日期等），再進(jìn)行形態(tài)鑒定。

亦可結(jié)合過篩檢驗(yàn)，觀察篩下物中是否有螨類。第三節(jié)病原物檢驗(yàn)

種子、苗木、插條、接穗以及動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品攜帶的病原物，遠(yuǎn)距離傳播的風(fēng)險(xiǎn)很大，病原物附著在這些載體上傳入后，常能在很短的時(shí)間內(nèi)定殖，并造成為害和損失。因此，在森林動(dòng)植物檢疫中，病原物的檢驗(yàn)相當(dāng)重要。

不同病原物引起的病害或疾病不同，其檢驗(yàn)方法也不一樣。一、植物病原檢驗(yàn)引起植物病害的病原物，有真菌、細(xì)菌、病毒、植原體、線蟲、螨類、類病毒、寄生性種子植物等。檢驗(yàn)這些病原物常用的方法包括：染色、洗滌、保濕萌芽、分離培養(yǎng)、鑒別寄主檢驗(yàn)、血清學(xué)檢驗(yàn)等。

病原物的檢驗(yàn)，也應(yīng)包括直接檢驗(yàn)。（略）（一）染色檢驗(yàn)

部分植物被病原物感染，或者病原物本身，經(jīng)過特殊的化學(xué)藥品處理，會(huì)呈現(xiàn)特有的顏色。由此可以幫助檢出和區(qū)分不同的病原物。這種方法，即為染色檢驗(yàn)法。

1、鞭毛染色

植物病原細(xì)菌的鞭毛數(shù)量和著生方式各有差異。但細(xì)菌的鞭毛很細(xì)，直徑0.02~0.03μm，在普通光學(xué)顯微鏡下不易觀察。通過染色后，則較容易在顯微鏡下觀察，并進(jìn)行種類的初步鑒定。

鞭毛染色，主要是在媒染劑的作用下，使染色劑沉積在鞭毛上，并使之加粗。

常用的鞭毛染色，有西薩基爾染色法(ceseres-Gill)和銀鹽染色法。

其操作步驟，一般為：涂片后，先用媒染劑處理數(shù)分鐘；用清水沖洗，晾干，再用染液染色數(shù)分鐘；最后經(jīng)水洗，干燥，即可在顯微鏡下觀察。

媒染劑：?jiǎn)螌幩?、ZnCl2、AlCl3、堿性品紅、酒精。自配。

染液：苯酚、堿性品紅。自配。

2、革蘭氏染色

革蘭氏染色反應(yīng)，是鑒定植物病原細(xì)菌的重要依據(jù)。不同的細(xì)菌，其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成不同，染色反應(yīng)也不一樣。

常用的方法是，先用新鮮的培養(yǎng)菌涂片，用結(jié)晶紫染色液染色，通過媒染劑碘液著色處理，用酒精脫色，再經(jīng)番紅復(fù)染。最后在光學(xué)顯微鏡下觀察。如果呈紅色，則為革蘭氏陰性菌；呈深紫色，即為革蘭氏陽性菌。屬鞭毛數(shù)量及著生特征革蘭氏染色反應(yīng)假單胞桿菌屬鞭毛1根或多根，極鞭陰性黃單胞桿菌屬鞭毛1根，極鞭陰性土壤桿菌屬鞭毛1~6根，周鞭陰性歐文菌屬鞭毛多根，周鞭陰性棒形桿菌屬無鞭毛或少數(shù)極鞭陽性

經(jīng)鞭毛染色和革蘭氏染色檢驗(yàn)后，參照下表中的重要植物病原細(xì)菌的鞭毛染色和革蘭氏染色反應(yīng)特點(diǎn)，再結(jié)合癥狀鑒定，便可確診。

3、內(nèi)寄生線蟲染色

染色檢驗(yàn)法，還適用于植物組織中內(nèi)寄生線蟲的檢驗(yàn)。

先在燒杯中，加入酸性品紅乳酸酚溶液，再加入洗凈的植物組織材料，透明染色1~3min，取出用冷水沖洗，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，加入乳酸酚溶液褪色。即可用解剖鏡檢查植物組織中，有無染成紅色的線蟲。（二）洗滌檢驗(yàn)

當(dāng)檢查附著在種子等受檢材料表面的各種真菌孢子（如黑粉菌的冬孢子、霜霉菌的卵孢子、銹菌的夏孢子、以及多種半知菌的分生孢子等）、細(xì)菌、或者穎殼上的病原線蟲時(shí)，由于病原物個(gè)體小、數(shù)量少，肉眼或放大鏡不易檢出，一般可用洗滌檢驗(yàn)。檢驗(yàn)時(shí)，可將定量的種子放在三角瓶?jī)?nèi)，加定量無菌水振蕩，制成懸浮液。將懸浮液用離心機(jī)濃縮，然后，取沉淀液滴于載玻片上，置于顯微鏡下，觀察有無病菌。

以種子檢驗(yàn)為例，其操作程序加下。1、洗脫孢子將一定數(shù)量的種子樣品放入三角瓶?jī)?nèi)，并加入一定量蒸餾水或其他洗滌液，振蕩5~10min，使孢子脫離種子、轉(zhuǎn)入洗滌液。在洗滌時(shí)，可在蒸餾水中加入0.1％的潤(rùn)濕劑（如0.1％肥皂液或磺化二羧酸），以減少表面張力，使種子表面的病原物洗得更徹底。2、離心將孢子液移入離心管，2500~3000r／min低速離心10~15min，使孢子沉積在離心管底部。3、鏡檢鑒定

棄去離心管內(nèi)的上層清液，取沉淀液滴在載玻片上，置顯微鏡下觀察有無病原菌，并進(jìn)行病原物種類的鑒定。

當(dāng)需要計(jì)算每粒種子的孢子負(fù)荷量時(shí)，可以采取血細(xì)胞計(jì)數(shù)法，或用每視野平均孢子數(shù)法推算。

在洗滌檢驗(yàn)時(shí)，每個(gè)樣品至少要洗滌檢驗(yàn)2次，至少鏡檢5片玻片，每個(gè)玻片檢查10個(gè)視野。（三）保濕萌芽檢驗(yàn)由于植物種子體積小，運(yùn)輸和攜帶方便，國(guó)際及地區(qū)間交流十分頻繁、數(shù)量巨大。因此，種子帶菌很容易通過試種或繁育向外擴(kuò)散，是遠(yuǎn)距離傳播植物病害的最有效途徑之一。

適用于種子帶菌、苗期發(fā)病的病害

黏附在種子表面、或者潛伏在種子內(nèi)部的病原菌，在適當(dāng)?shù)臏貪穸葪l件下，當(dāng)種子萌發(fā)后，常會(huì)在幼苗早期產(chǎn)生明顯的病害癥狀。因此，可采用種子保濕萌芽進(jìn)行檢驗(yàn)。

這種檢驗(yàn)方法，操作簡(jiǎn)單，不需要特殊的設(shè)備，應(yīng)用廣泛。

如果種子所帶病菌，在萌發(fā)期或苗期又不表現(xiàn)癥狀時(shí)，則不宜用這種方法進(jìn)行檢驗(yàn)。種子保濕萌芽檢驗(yàn)，主要有沙培養(yǎng)法、標(biāo)準(zhǔn)的土壤培養(yǎng)法和試管培養(yǎng)法。

其原理是，將種子播種在滅菌的沙、土壤、腐殖質(zhì)或者其他類似的基質(zhì)中，在一定的溫、濕度條件下，培養(yǎng)。若種子和幼苗發(fā)病，并產(chǎn)生與在自然條件下相似的癥狀，則證明了種子帶菌。

但若為種子內(nèi)部帶菌，檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)先將種子表面消毒，以殺死黏附在種子表面的其他雜菌；然后再進(jìn)行萌芽檢驗(yàn)，確定其帶菌率。

1、沙培養(yǎng)將滅菌的細(xì)沙濕潤(rùn)后作為基質(zhì)，在種子上覆蓋2~3cm厚的粗沙，當(dāng)種子較小時(shí)，覆蓋1cm即可。然后加適量水。培養(yǎng)約2周，即可觀察。

2、標(biāo)準(zhǔn)的土壤培養(yǎng)法采用多營(yíng)養(yǎng)缽的塑料盤，將滅菌的土壤填入小缽。播種后，在適當(dāng)?shù)臏囟龋ㄒ蚣闹髦参锖湍繕?biāo)病菌而異）條件下培養(yǎng)。但應(yīng)在塑料盤上面覆蓋一層塑料薄膜，以保持濕度。培養(yǎng)2~4周后，即可觀察幼苗的癥狀。

這種方法的測(cè)驗(yàn)條件與田間條件相近，對(duì)幼苗的評(píng)價(jià)比在人工基質(zhì)上更準(zhǔn)確。但這種方法僅能觀察到幼苗的寄生病原菌癥狀。

3、試管培養(yǎng)法在無菌操作條件下，采用直徑為16mm的試管，每管加入l0ml水瓊脂培養(yǎng)基。放入1粒種子，封好試管口，放在20℃條件下直立培養(yǎng)。并提供光照與黑暗交替12h／12h的人工光照周期。待幼苗生長(zhǎng)達(dá)到管頂部時(shí)，將蓋子取掉；一般培養(yǎng)10~15d，癥狀表現(xiàn)后，即可統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況及種子帶菌率。

其中，培養(yǎng)溫度因病原和寄主材料的不同可調(diào)節(jié)，培養(yǎng)時(shí)間依幼苗發(fā)育和癥狀表現(xiàn)而定。所用基質(zhì)也可用營(yíng)養(yǎng)液或選擇性培養(yǎng)基代替，或在培養(yǎng)一定時(shí)間后再加入營(yíng)養(yǎng)。

該法雖然需要準(zhǔn)備培養(yǎng)基和大量的無菌試管，操作起來也較其他培養(yǎng)方法繁瑣。但幼苗癥狀表現(xiàn)明顯，容易觀察幼苗根部和綠色部分的癥狀，也可避免鄰近植株間的相互感染。保濕萌芽培養(yǎng)也有局限。例如，寄主生長(zhǎng)發(fā)育不良時(shí)，某些腐生菌可能變成萌芽階段的寄生菌，使幼芽發(fā)生病變。

另外，萌芽檢驗(yàn)主要依靠肉眼檢查，由于多種病害可以產(chǎn)生類似的病癥；就是同一病害，也可以發(fā)生不同的癥狀。這些情況，常會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。要克服這些缺點(diǎn)，必須與其他輔助辦法相結(jié)合進(jìn)行檢驗(yàn)。

（四）分離培養(yǎng)檢驗(yàn)

分離培養(yǎng)，是常用的鑒定病原菌的方法，也是植物病原檢疫上常用的檢驗(yàn)方法。不同的病原物有不同的分離方法。真菌、細(xì)菌和線蟲的分離方法如下。1、病原真菌的分離培養(yǎng)檢驗(yàn)

（除專性寄生菌如白粉菌類、銹菌和霜霉菌外，）許多植物病原真菌都能在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，從植物組織中分離出來，在人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)物。然后，觀察病菌的生長(zhǎng)特性，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，就能較快地對(duì)某些病原真菌進(jìn)行種類鑒定。植物病原真菌的分離培養(yǎng)，特別適用于檢驗(yàn)潛伏在種子、苗木或其他植物組織病斑內(nèi)部的病原菌。

常用的培養(yǎng)基，是馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)，或者馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。但在分離某些較難培養(yǎng)的病原真菌時(shí)，必須用特殊的選擇性培養(yǎng)基。

另外，分離培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵，是選擇培養(yǎng)材料。應(yīng)選擇新發(fā)病的器官或組織作為分離材料，以剪取病健交界處的組織最好，可以減少腐生菌的污染。

當(dāng)選好培養(yǎng)材料后，應(yīng)先進(jìn)行組織的表面消毒，殺死表面的腐生菌。常用的消毒劑，有0.1％氯化汞溶液、3％~5％次氯酸鈉水溶液和70％乙醇。（1）組織分離法

組織分離法，即從分離材料的病健交界處，切取大小為4~5mm的塊狀組織，然后，進(jìn)行表面消毒，并用無菌水沖洗。在適宜的溫度下，用PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)。待病原菌長(zhǎng)出后，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，或進(jìn)一步純化后鑒定。

其中，表面消毒時(shí)間的長(zhǎng)短，常對(duì)分離能否成功有很大影響。時(shí)間不足容易出現(xiàn)腐生菌的污染，時(shí)間過長(zhǎng)可能殺死組織內(nèi)部的病原菌。（2）稀釋分離法

用于某些能產(chǎn)生大量孢子的病原真菌的分離。操作方法是，先從發(fā)病部位挑取少量孢子，放入試管的無菌水中，制成孢子懸浮液，并稀釋成不同的濃度，再與冷卻并呈熔化狀態(tài)的PDA培養(yǎng)基混合后，倒入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)。待病原菌長(zhǎng)出后，再進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，或進(jìn)一步純化后鑒定。

使用這種方法，因病原菌孢子附著在植物的表面，旦未經(jīng)消毒處理，很容易出現(xiàn)雜菌污染。故應(yīng)及時(shí)觀察判斷真正的病原菌，并及時(shí)純化培養(yǎng)。此外，各種病害的發(fā)病部位和病原所在的植物組織不同，選用分離方法時(shí)應(yīng)區(qū)別對(duì)待。

如分離潛伏于種子表層或深層的病菌，可先將種子表面消毒、滅菌水沖洗，將整?；蚱扑楹蟮姆N子置于培養(yǎng)基上；

如果需要確定病菌的潛伏部位，可將種子表面消毒、滅菌水沖洗，放入消毒過的培養(yǎng)皿內(nèi)；在無菌條件下，用解剖刀分切，再移植于培養(yǎng)基上培養(yǎng)。或先將種子分成不同部分，再表面消毒，然后培養(yǎng)。

在分離塊莖、塊根及苗木、接穗等繁殖材料所帶的病菌時(shí)，可先將病部用酒精或氯化汞液作表面消毒、沖洗，再挑取內(nèi)部組織進(jìn)行培養(yǎng)；或各切取病健交界組織，進(jìn)行表面消毒和洗滌，然后再培養(yǎng)。（3）土壤帶菌檢驗(yàn)

土壤帶菌，或真菌的菌絲體、菌核、休眠孢子等，可以在土壤中存活很長(zhǎng)時(shí)間，也能成為重要的傳播和侵染源。但分離土壤中的病原真菌時(shí)，應(yīng)根據(jù)病菌種類、繁殖體類型，采用不同的方法與選擇性培養(yǎng)基。

例如，有些病原真菌以休眠孢子囊在病殘?bào)w和土壤中越冬，可采用如氯仿漂浮法、二溴乙烷漂浮法、油漂浮法等進(jìn)行分離；土壤中的菌核可用過篩方法分離，即采用不同孔徑的篩子進(jìn)行篩選，然后用放大鏡檢查篩下物。

所有這些從土壤中分離得到的菌核或休眠孢子，都應(yīng)經(jīng)消毒處理后在培養(yǎng)基上培養(yǎng)、純化、鑒定。2、細(xì)菌的分離培養(yǎng)法

植物病原細(xì)菌的檢驗(yàn)，常需要進(jìn)行分離培養(yǎng)。然后，根據(jù)培養(yǎng)特性或生理生化測(cè)定指標(biāo)、致病性等，進(jìn)行鑒定。

植物病原細(xì)菌的分離，一般采用稀釋分離法。

通過稀釋培養(yǎng)，可以使植物組織中的各種細(xì)菌分離，形成分散的菌落。根據(jù)所培養(yǎng)的菌落的形狀、大小及顏色等，即可初步鑒別或純化培養(yǎng)。

分離病原細(xì)菌常用的有普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)、馬鈴薯葡萄糖（或蔗糖）培養(yǎng)基。

在鑒別性培養(yǎng)基上，目標(biāo)細(xì)菌的菌落有明確的鑒別特征。選擇性培養(yǎng)基則促使目標(biāo)菌生長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)。（1）培養(yǎng)皿稀釋分離

培養(yǎng)皿稀釋分離法，就是將分離的組織切成小塊，經(jīng)表面消毒和無菌水沖洗后，在無菌條件下，放于培養(yǎng)皿中，加少量無菌水研碎，使組織中的細(xì)菌釋放到水中，（細(xì)菌液的制備）然后用移植環(huán)取2~4環(huán)，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)盛有少量無菌水的培養(yǎng)皿中，混合均勻，（細(xì)菌液的移植環(huán)轉(zhuǎn)移、稀釋）以同樣的方法從第二個(gè)培養(yǎng)皿移到第三個(gè)培養(yǎng)皿中。然后，在各培養(yǎng)皿中，倒入冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基。凝固后，在適宜的溫度下培養(yǎng)、觀察。（分離組織的表面消毒）（2）平板畫線分離采取與上述相同的方法，制備含有細(xì)菌的組織浸液，用滅過菌的移植環(huán)蘸取組織浸液，在瓊脂平板上畫平行線

3~5條，再在第二條線上畫出3~5條垂直線，然后培養(yǎng)。

不同病原細(xì)菌要求的培養(yǎng)條件不同。如黃單胞菌要求培養(yǎng)溫度較高，應(yīng)選擇較高的溫度培養(yǎng)。各種病原菌生長(zhǎng)速度不同，出現(xiàn)菌落所需時(shí)間也不一樣。如假單胞菌屬和歐文菌屬的細(xì)菌生長(zhǎng)較快，1~2d即出現(xiàn)菌落；黃單胞菌屬的細(xì)菌3~4d出現(xiàn)菌落。在獲得細(xì)菌的純培養(yǎng)物后，有時(shí)還需要進(jìn)行生化測(cè)定，才能準(zhǔn)確鑒定。常見的測(cè)定，包括測(cè)定其對(duì)碳源的利用和分解，對(duì)氮素化合物的利用和分解，以及產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、顏色變化等。

例如，檢測(cè)甘藍(lán)黑腐病的病原細(xì)菌時(shí)，植物組織提取液在含淀粉牛肉浸膏蛋白胨的培養(yǎng)基上，產(chǎn)生黃色菌落；當(dāng)在培養(yǎng)物上滴加魯戈?duì)柕庖簳r(shí)，菌落周邊的培養(yǎng)基不被染色，說明培養(yǎng)基中的淀粉已被水解，即該菌落可能為甘藍(lán)黑腐病的病原細(xì)菌。

3、植物病原線蟲的分離檢驗(yàn)

植物病原線蟲大多用口針刺吸寄主植物的營(yíng)養(yǎng)，受害植物的癥狀，如根結(jié)、根腐、地上部分似缺素癥等，常與一般的病害癥狀相似。只有在分離鑒定的基礎(chǔ)上，才能進(jìn)行準(zhǔn)確的檢驗(yàn)。

常用的植物病原線蟲分離法（貝爾曼漏斗分離法、淺盤分離法），主要是依據(jù)線蟲在水中的密度大于水，當(dāng)待檢的植物材料被適當(dāng)破碎，在室溫條件下浸泡一定時(shí)間，線蟲通過自身的活動(dòng)到達(dá)水中后，即沉入水底。然后收集浸泡液，離心濃縮，即可在顯微鏡下觀察、鑒定。（1）貝爾曼漏斗分離法

將直徑10~15cm的玻璃漏斗置于漏斗架上，下面接上長(zhǎng)約10cm的橡皮管，并裝上止水夾（圖4-5）。取適量適當(dāng)粉碎的植物分離材料，用兩層紗布包好，然后，放入漏斗中，并向漏斗中注入清水，水量剛好浸沒分離材料。靜置4~24h，線蟲即離開植物組織，并在水中游動(dòng)，最后沉降到漏斗底部的橡皮管中。打開止水夾，取底部5~15ml的水樣，在解剖鏡下檢查。如果水樣中線蟲的數(shù)量少，可用離心機(jī)在1500r／min離心2~3min，沉淀后再檢查。

土壤中線蟲的分離，使用改良的貝爾曼分離法，即先在漏斗內(nèi)加一只不銹鋼或塑料的篩網(wǎng)，將紗布鋪在篩網(wǎng)上；再放入土樣和水，線蟲即從土壤中游離到水中，并沉降于漏斗末端的乳膠管中。漏斗紗布包裹的含有線蟲的材料（適當(dāng)粉碎）止水夾鐵架臺(tái)橡皮管貝爾曼分離法實(shí)驗(yàn)裝置圖示

洗凈植物材料（如系土壤樣品，不洗）；

將材料切成0.5cm長(zhǎng)的小段，用雙層紗布包裹（土壤樣品約50~100g）；

浸入加水的漏斗中；（浸泡12h）線蟲從材料中游出，穿過紗布，聚集于漏斗下的乳膠管中；打開止水夾，取管底線蟲液3~5ml，鏡檢線蟲及數(shù)量。

貝爾曼分離法分離線蟲的步驟（2）淺盤分離法（不講）

該裝置由兩只不銹鋼淺盤組成，其中略小、底部具粗網(wǎng)篩的篩盤，疊套在大盤上面（圖4—6）。先將兩層紗布打濕，鋪于篩盤上。再將粉碎的樣品置于紗布上，慢慢注入清水，使其浸沒樣品，然后靜置、分離。分離結(jié)束后，移去篩盤，將大盤內(nèi)的分離液集中于小燒杯內(nèi)，經(jīng)自然沉降，或1500r／min離心2~3min，濃縮至適量后鏡檢。（五）鑒別寄主檢驗(yàn)主要用來鑒別病毒。一種病毒可以侵染多種寄主，進(jìn)而表現(xiàn)多種癥狀。

而有的植物被病毒侵染后，可以快速表現(xiàn)出穩(wěn)定的特異性癥狀。

我們就可以根據(jù)這種穩(wěn)定的特異性癥狀，來鑒別特定的病毒。這就是鑒別寄主檢驗(yàn)。這樣的植物就叫鑒別寄主，或者敏感植物、指示植物。

鑒別寄主一般都是草本植物，如藜科、茄科、豆科植物等。因?yàn)椴荼局参镏仓晷?，接種病毒后，癥狀表現(xiàn)快而早。有些種子或繁殖材料，檢疫現(xiàn)場(chǎng)不易發(fā)現(xiàn)病癥或病原體。例如潛育期長(zhǎng)的病毒類、植原體類等。它們只能通過隔離試種，根據(jù)在生長(zhǎng)期間（階段）所表現(xiàn)的癥狀，才能進(jìn)行病原物的檢疫檢驗(yàn)。對(duì)經(jīng)過分離培養(yǎng)檢驗(yàn)后，仍不產(chǎn)生病原特征的可疑受檢材料，可通過人工誘發(fā)接種試驗(yàn)，用鑒別寄主來進(jìn)行檢驗(yàn)。

鑒別寄主植物，常能夠檢驗(yàn)癥狀不明顯的病毒和細(xì)菌。通過汁液摩擦接種和嫁接（傳染）接種后，許多病毒和細(xì)菌在敏感的鑒別寄主上，常能表現(xiàn)出特殊的癥狀。這些癥狀，即成為判斷應(yīng)檢物是否攜帶某種病原物的指標(biāo)。1、汁液摩擦接種檢驗(yàn)

進(jìn)行草本的病毒檢驗(yàn)鑒別時(shí)，常用汁液摩擦接種法。所用的鑒別寄主，包括藜科、茄科、豆科等植物。檢驗(yàn)時(shí)，先制備緩沖液。常用的緩沖液，有0.02mol／L、PH7.2~7.8的磷酸緩沖液(PB)，或PH8.2的Tris-HCl緩沖液。當(dāng)待檢測(cè)樣品為木本植物時(shí)，緩沖液中應(yīng)加一定量的抗氧化劑，以降低寄主植物中多酚及單寧類物質(zhì)的氧化產(chǎn)物對(duì)病毒的鈍化作用，以提高接種的成功率。Tris：三羥甲基氨基甲烷。汁液摩擦接種的步驟為：先從待檢草本植株的葉片、花瓣、根和皮上，取一定量的組織，加2~5倍的緩沖液，在低溫條件下研磨。（病毒液的制備）然后，將提取的汁液，噴灑在撒有金剛砂的供試鑒別植物葉片上；洗凈手指，在葉片上輕輕摩擦接種。（病毒液的噴灑、接種）操作完畢后，立即用蒸餾水沖洗干凈葉片上殘留的汁液。將接種后的植物，放在22~28℃、半遮陽條件下培養(yǎng)。

定期觀察、并記錄鑒別植物上的癥狀反應(yīng)。

2、嫁接檢驗(yàn)多數(shù)果樹和林木上的病毒、植原體，不能通過種子傳帶、傳播，但能通過嫁接傳染。

因此，可以用其實(shí)生苗作為砧木，將待檢果樹、林木的接穗，嫁接到對(duì)病原敏感的木本鑒別植物上進(jìn)行鑒定。①雙重芽接法檢驗(yàn)。一般是在8月中、下旬，或者翌年春季苗木發(fā)芽前，在砧木的基部，嫁接1~2個(gè)待檢樣本的芽片，然后在其上方嫁接一個(gè)鑒別寄主的芽片，兩芽間相距l(xiāng)~2cm。將鑒別寄主接芽的上方約1cm處，剪除砧干。苗木發(fā)芽后，摘除帶檢芽的生長(zhǎng)點(diǎn)，以促進(jìn)鑒別寄主植物生長(zhǎng)。并在生長(zhǎng)過程中，注意觀察和鑒別。②雙重切接法檢驗(yàn)。

是在休眠期，剪取鑒別寄主植物及待檢樹的接穗，砧木萌發(fā)后，將帶有2個(gè)芽的待檢樹的接穗嫁接在砧木上，然后，將鑒別寄主植物嫁接到待檢接穗的上部。為促進(jìn)傷口愈合，可在嫁接后套上塑料膜保濕保溫。雙重切接法嫁接成活率低，操作時(shí)應(yīng)盡量仔細(xì)。3、試管內(nèi)離體微嫁接法試管內(nèi)離體微嫁接法，是檢測(cè)果樹病毒時(shí)常用的方法。該法比用木本指示植物檢測(cè)病毒所需的時(shí)間短、檢出率可靠。

該法是以帶病毒材料的試管苗做砧木，指示植物試管苗為接穗。嫁接成活后，試管苗生根，移栽到田間。根據(jù)指示植物上的癥狀，來判斷所檢植物是否帶有病毒。（六）血清學(xué)檢測(cè)名詞：

抗原：一種能刺激人或動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體，并能與抗體在體內(nèi)或體外，發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。細(xì)菌、病毒、毒素，都可以是抗原。

抗體：人或動(dòng)物受抗原（物質(zhì)）刺激后，由漿細(xì)胞（來源于淋巴細(xì)胞）合成和分泌的一種特異性蛋白質(zhì)?？贵w是人體抵抗外界感染的一種重要武器。

血清：指血液凝固后，在血漿中除去血纖蛋白分離出的淡黃色透明液體，或指血纖蛋白已被除去的血漿。

抗血清：

血清學(xué)檢驗(yàn)方法快速、靈敏，操作簡(jiǎn)便，可同時(shí)進(jìn)行大量樣品檢測(cè)，在動(dòng)植物病毒、細(xì)菌檢驗(yàn)中，應(yīng)用廣泛。

其原理是，抗原與其對(duì)應(yīng)的抗體發(fā)生特殊結(jié)合，形成“抗原—抗體”復(fù)合物。復(fù)合物特有的沉淀現(xiàn)象及其理化檢測(cè)特征，是鑒定病毒的有效手段。

常用的血清學(xué)方法，包括沉淀反應(yīng)、凝聚反應(yīng)、免疫電鏡和酶聯(lián)免疫吸附等。1、沉淀反應(yīng)測(cè)定

含有抗原的植物汁液與抗血清（已知）在試管中等量混合，培育后即可發(fā)生沉淀反應(yīng)。在黑暗的背景下，如果可以見到絮狀或致密顆粒狀沉淀，即表明該植物攜帶有病毒。2、凝聚反應(yīng)（瓊脂擴(kuò)散法）熔化的瓊脂凝膠平板打孔打孔待測(cè)植物、種子的提取液（抗原）抗血清沉淀帶抗原和抗體在擴(kuò)散、相遇處

如果提取液中有抗原存在，則在抗原和抗體擴(kuò)散、相遇處，形成沉淀帶。該法靈敏度高，是常用的病毒檢驗(yàn)方法。3、免疫電鏡法該法是將病毒粒體的電鏡觀察和血清反應(yīng)的特異性相結(jié)合，進(jìn)行病毒的檢測(cè)。可檢測(cè)多種種傳病毒。4、酶聯(lián)免疫吸附法在血清學(xué)檢驗(yàn)中，應(yīng)用最廣泛的是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。該方法尤其適合植物病毒和細(xì)菌的檢驗(yàn)。

酶聯(lián)免疫吸附法有6種，即直接法、間接法、夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、酶抗體法和雙抗體夾心法。其中以雙抗體夾心法（DAS—ELISA）應(yīng)用最廣泛。直接酶聯(lián)法1、先將待測(cè)抗原加入微量反應(yīng)板的凹孔中，在抗原被吸附后，洗滌，清除雜質(zhì)，保留抗原。2、加入特異性酶標(biāo)記抗體。3、形成“抗原—抗體（酶標(biāo)記）”復(fù)合物，同時(shí)洗滌，清除掉未與抗原相結(jié)合的酶標(biāo)記抗體。4、加入底物有色產(chǎn)物。5、通過底物的顏色反應(yīng)，來判斷有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)。顏色的深淺，則與相應(yīng)“抗體—抗原”的量呈正比?？捎萌庋鄱ㄐ耘袛嗷蛴妹笜?biāo)儀定量測(cè)定。酶酶聯(lián)免疫吸附法的關(guān)鍵，是制備抗體（抗血清）。常用的抗體有多克隆抗體(PAb)和單克隆抗體(MAb)。多克隆抗體制備較簡(jiǎn)單，應(yīng)用普遍，但除了與檢測(cè)目標(biāo)反應(yīng)外，有時(shí)也會(huì)與非目標(biāo)蛋白產(chǎn)生反應(yīng)；而單克隆體制備較復(fù)雜，?；暂^強(qiáng)。大多數(shù)植物病毒都有商品化抗體試劑盒出售，并附有病毒樣品的制備、血清學(xué)操作程序和結(jié)果判定及注意事項(xiàng)等。國(guó)內(nèi)也已制備了多種單克隆抗體，成功地用于檢測(cè)柑梧潰瘍病菌等多種植物病毒。（七）光學(xué)顯微鏡與電鏡形態(tài)檢驗(yàn)根據(jù)所觀察的病菌形態(tài)，參閱相關(guān)的形態(tài)描述，進(jìn)行形態(tài)鑒別，基本上可以確診到屬，甚至具體的種類。1、光學(xué)顯微鏡檢驗(yàn)將檢疫檢驗(yàn)中的真菌、細(xì)菌、線蟲、病毒等病原物，制成各種玻片（如細(xì)菌涂片、真菌水片等），在光學(xué)顯微鏡下，分別用低倍、高倍、油鏡進(jìn)行觀察鑒定。這是森林動(dòng)植物檢疫檢驗(yàn)中最常用的形態(tài)鑒別方法。

2、電鏡檢驗(yàn)

有些病原物（如細(xì)菌、病毒等），由于個(gè)體十分微小，在光學(xué)顯微鏡下不能準(zhǔn)確鑒定，需要借助于電鏡才能進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

根據(jù)性能不同，電鏡有透射電鏡和掃描電鏡兩類：①透射電鏡。

透射電鏡，是由入射電子束穿過樣品直接成像，放大倍數(shù)可達(dá)80萬倍。但因其電子透射力較弱，要求樣品厚度在50—l00nm的范圍內(nèi)。

樣品制備技術(shù)和過程比較復(fù)雜。一般的制備程序，包括取材（組織或細(xì)胞）、固定、漂洗、脫水、浸透、修整定位、超薄切片及染色。也可用負(fù)染法、投影法及冰凍復(fù)型法等方法，制備樣品。

最后，將制備好的樣品裝入樣品臺(tái)上進(jìn)行觀察。觀察時(shí)，應(yīng)選擇標(biāo)本上最佳區(qū)域進(jìn)行拍照、觀察和形態(tài)記錄。②掃描電鏡。

掃描電鏡的電子束，在樣品表面作光柵掃描運(yùn)動(dòng)，然后激發(fā)出樣品淺表的電子（稱二次電子）。二次電子經(jīng)過二次電子檢測(cè)器檢出，再經(jīng)視頻放大，然后在顯像管上顯示成像。

其樣品制備方法比較簡(jiǎn)單，步驟為取樣、固定、脫水、干燥、在真空裝置中噴鍍碳和金，最后進(jìn)行電鏡掃描觀察。二、動(dòng)物病原檢驗(yàn)（不講）

第四節(jié)分子生物學(xué)檢測(cè)與診斷

即用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測(cè)與鑒定檢疫性有害生物。（DNA分子鑒定）特點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)。常用的分子生物學(xué)技術(shù)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、核酸雜交等。一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即生物體外無限擴(kuò)增核酸片段，又叫無細(xì)胞

分子克隆系統(tǒng)。

其原理，類似于細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制。

該方法可將極微量的目標(biāo)DNA片段，在4h左右特異性地?cái)U(kuò)增上百萬倍，從而大大提高了對(duì)DNA分子的分析和檢測(cè)能力。理論上，此法可以檢測(cè)到單分子的DNA樣品。PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有5類，即：1、目標(biāo)DNA片段，2、引物[即一小段單鏈DNA（寡核苷酸鏈），與目標(biāo)DNA片段兩端的、一定長(zhǎng)度的堿基序列互補(bǔ)]，3、DNA聚合酶（Taq酶），（從水生棲熱菌Thermusaquaticus（Taq）中分離出

的、具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶）4、4種單核苷酸（dNTP），5、緩沖液。

PCR步驟：

PCR由“變性——退火——延伸”三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

①目標(biāo)DNA的變性（92℃-95℃）：目標(biāo)DNA經(jīng)高溫變性，DNA雙鏈解開成單鏈，以便與引物結(jié)合。②目標(biāo)DNA的退火（復(fù)性）（40℃-60℃）：降低溫度，加入引物，引物與目標(biāo)DNA單鏈一端的堿基序列結(jié)合，形成局部雙鏈。③引物的延伸（72℃）：

“目標(biāo)DNA——引物”結(jié)合物，在DNA聚合酶（Taq酶）的作用下，以單個(gè)核苷酸（dNTP）為原料，以目標(biāo)DNA的堿基序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理，合成一條新的、與目標(biāo)DNA鏈互補(bǔ)的復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)“變性——退火——延伸”過程，目標(biāo)DNA含量便增加一倍。而且每次循環(huán)的產(chǎn)物，又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需要2~4分鐘，2~3小時(shí)就能將目標(biāo)DNA擴(kuò)增幾百萬倍。PCR檢測(cè)：用電泳技術(shù)分離PCR產(chǎn)物，在熒光下鑒定其片段。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）

核酸中核苷酸的排列順序。

一個(gè)核苷酸分子的3’-位羥基與另一個(gè)核苷酸分子的5’-位磷酸基，通過脫水，可形成3’,5’-磷酸二酯鍵，從而將兩個(gè)核苷酸分子連接起來

核苷酸鏈的方向是5’－3’。5′端3′端CGA（一）常用方法1、普通PCR技術(shù)

2、M-PCR技術(shù)（multiplex-PCR