內(nèi)毒素及其去除

內(nèi)毒素及其去除內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)和性質(zhì)內(nèi)毒素的危害及檢測內(nèi)毒素去除的方法構(gòu)建生物經(jīng)濟體系打造生物經(jīng)濟旗艦內(nèi)毒素也稱為脂多糖或LPS，是革蘭氏陰性菌胞壁上一種成分（少數(shù)陽性菌也能產(chǎn)生）。其細胞壁外膜的外部脂質(zhì)成分完全由內(nèi)毒素分子組成，死亡時則會釋放大量內(nèi)毒素。一個大腸桿菌細胞約含有200萬個LPS分子內(nèi)毒素是什么構(gòu)建生物經(jīng)濟體系打造生物經(jīng)濟旗艦多糖鏈脂質(zhì)A磷酸基團疏水性，毒性部分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，特異性部分帶負電功能部分構(gòu)建生物經(jīng)濟體系打造生物經(jīng)旗艦結(jié)構(gòu)不同的革蘭氏陰性細菌,其LPS的化學(xué)組成有一定的差別,但都含有內(nèi)脂A部分內(nèi)毒素性質(zhì)極高的熱穩(wěn)定性250℃30分鐘帶負電等電點在2左右親水兼疏水糖親水脂疏水單體膠束囊狀內(nèi)毒素存在形式構(gòu)建生物經(jīng)濟體系造生物經(jīng)濟旗艦構(gòu)建生物經(jīng)濟體系打造生物經(jīng)濟旗艦內(nèi)毒素的危害0.5—1小時冷顫發(fā)熱，頭痛惡心，嘔吐，臉色蒼白血液循環(huán)障礙休克死亡醫(yī)藥制劑本身不合格或放置時間過長輸液器未消毒徹底注射器操作污染2ng/kg體重即能引起發(fā)熱構(gòu)建生物經(jīng)濟體系打造生物經(jīng)濟旗艦藥品、生物制品的細菌內(nèi)毒素限值（L，EU/mg）一般按以下公式確定：

K為人每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，單位EU/（kg·h）M為人每公斤體重每小時的最大供試品劑量，單位mg/（kg·h）生物制品中內(nèi)毒素標準細菌內(nèi)毒素標準在制定時應(yīng)定為計算值的1/3~1/2。我國藥典要求注射劑中細菌內(nèi)毒素＜1EU/ml凝膠法濁度法顯色基質(zhì)法內(nèi)毒素與鱟試劑的凝膠反應(yīng)大于0.03EU/ml范圍緩慢翻轉(zhuǎn)180°，目測終點0.006-300EU/mL濁度變化0.006-15EU/ml顯色基團吸光度變化簡單,經(jīng)濟,不需專用測定設(shè)備特異性不強精密度、定量性差簡單、快速、靈敏度高、檢測范圍寬需精密的專用儀器精度高、靈敏度高儀器和試劑貴,操作比較復(fù)雜部分藥品由于自身特殊性無法通過稀釋法消除干擾，因此鱟試驗還無法完全取代家兔熱原試驗常用內(nèi)毒素檢測方法內(nèi)毒素去除的難點構(gòu)建生物經(jīng)濟體系打造生物經(jīng)濟旗艦自身特點極少的養(yǎng)分G-即可存活，內(nèi)毒幾乎無處不在單體、聚集體種類繁多性質(zhì)不均一熱穩(wěn)定性高180℃3hours相互作用本身帶負電，可以和帶正電的堿性蛋白結(jié)合通過二價陽離子(如Ca2+)的橋接作用和酸性蛋白形成復(fù)合體類脂A的疏水特性導(dǎo)致其和疏水性蛋白結(jié)合內(nèi)毒素去除內(nèi)毒的方法

1.高溫烘烤熱原的耐熱性能良好，60℃加熱1h不被分解破壞，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使熱原徹底破壞。此法適合玻璃器皿的去內(nèi)毒2.堿消毒（室溫條件下）主要用于玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上內(nèi)毒素的去除4.蒸餾法，超濾法，反滲透，此法一般在生產(chǎn)注射用水時用到，蒸餾需要多級蒸餾并且加隔沫裝置，反滲透成本高。5.吸附法，內(nèi)毒素在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于對蛋白有吸附故不適合用于生物制品。6.層析法，選用合適的層析填料和溶液體系，能夠有效去除產(chǎn)品中的內(nèi)毒素，是目前單抗純化生產(chǎn)中的主流工藝。內(nèi)毒素去除方法存在選擇性差，樣品回收率低等問題。下面主要介紹幾種生產(chǎn)中常用的方法構(gòu)建生物經(jīng)濟體系打造生物經(jīng)濟旗艦7.相分離法、適用于蛋白制品，但各有缺點。相分離法TritonX-114一陰離子交換層析二親和層析四疏水層析與分子篩三相分離法TritonX-114此法用于較大重組蛋白質(zhì)（rCK-bb、Rck-mb）中LPS的去除，經(jīng)過三次相分離后，LPS從104EU/ml降到了幾個EU/ml，去除率超過97%，蛋白的回收率大于90%。適用于親水性蛋白的內(nèi)毒去除，會使一些有毒的TritonX-114殘存在蛋白溶液中構(gòu)建生物經(jīng)濟體系打造生物經(jīng)濟旗艦離子交換層析的速度快、載量高、濃縮效應(yīng)好,在早期下游純化中擔當重要角色。一般而言,內(nèi)毒素比蛋白質(zhì)在陰離子交換介質(zhì)上的結(jié)合強很多,分子量越小的內(nèi)毒素結(jié)合得越強,多數(shù)要在柱再生(1M氯化鈉)或在位清洗(1M氫氧化鈉)時才從介質(zhì)上洗脫下來構(gòu)建生物經(jīng)濟體系打造生物經(jīng)濟旗艦陰離子交換層析內(nèi)毒素在pH〉2時都是帶負電。陰離子層析填料自身帶正電能夠吸附內(nèi)毒?？墒褂昧鞔┠Ｊ?，上樣前樣品PH控制在目的蛋白PI以下，使其帶正電。這樣內(nèi)毒素結(jié)合在填料上，目的蛋白直接流穿如二乙胺乙基（DEAE）陰離子交換介質(zhì)適于從堿性蛋白質(zhì)（即帶正電的蛋白質(zhì)，如尿激酶）中去除內(nèi)毒素，成本低，吸附容量大，但這種方法不適用于帶負電荷的蛋白構(gòu)建生物經(jīng)濟體系打造生物經(jīng)濟旗艦疏水與分子篩疏水層析法利用高鹽增加蛋白疏水性與介質(zhì)結(jié)合，而在高鹽體系中內(nèi)毒素由于脂質(zhì)A部分有很強的疏水性發(fā)凝集，無法與層析介質(zhì)結(jié)合，因此能夠有效去除內(nèi)毒素分子篩是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)根據(jù)分子大小進行分離的一種方法。一般抗體分子量為幾萬道爾頓,而內(nèi)毒素分子量為幾十萬至上百萬道爾頓,常是多聚體,因此利用分子篩可以有效去除內(nèi)毒素,但其處理量小,處理時間較長。構(gòu)建生物經(jīng)濟體系打造生物經(jīng)濟旗艦親和層析以組氨酸、組胺、多粘菌素B、聚陽離子等為配基將內(nèi)毒素底物LAL或多粘菌素B(PMB)偶聯(lián)于CNBr-Sepharose或NHS-Sepharose上,以此介質(zhì)特異性吸附內(nèi)毒素,而讓蛋白通過。親和層析構(gòu)建生物經(jīng)濟體系打造生物經(jīng)濟旗艦親和層析親和配基PMB與內(nèi)毒素之間的作用主要是疏水與靜電作用,而鹽濃度即離子強度的變化會反方向影響這兩種作用:離子強度增大會增強親和配基PMB與內(nèi)毒素之間的疏水作用,同時又會減小兩者之間的靜電作用;離子強度減小會減小親和配基PMB與內(nèi)毒素之間的疏水作用,同時又會增大兩者之間的靜電作用。疏水作用與靜電作用的協(xié)同作用導(dǎo)致了上述結(jié)果。構(gòu)建生物經(jīng)濟體系打造生物經(jīng)濟旗艦在低pH時,內(nèi)毒素分子中磷酸酯基和羧基離子化減小。在分子內(nèi)疏水作用的驅(qū)使下內(nèi)毒素分子趨于更為緊湊的結(jié)構(gòu),從而減少了相互作用的位點,導(dǎo)致去除率的下降。隨著溶液pH的增大,內(nèi)毒素分子的緊湊結(jié)構(gòu)被分子內(nèi)靜電相互作用破壞,舒展的結(jié)構(gòu)使內(nèi)毒素分子與固載于瓊脂糖上的配基產(chǎn)生更為有效的作用,導(dǎo)致去除率的升高。在高pH下內(nèi)毒素去除率的下降可能是因為鍵合于基質(zhì)上的疏水配基的構(gòu)像發(fā)生扭曲變形所致。親和層析多種層析方法組合效果構(gòu)建生物經(jīng)濟體系打造生物經(jīng)濟旗艦生物技術(shù)藥品的純化,主要是采