丁二胺與戊二胺的介紹

關(guān)于兩種二元胺微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的介紹李小剛目錄1,5—戊二胺談第二章1,4—丁二胺談第三章胺談第一章第一章胺什么是胺？氨分子中的氫原子被烴基取代后的產(chǎn)物。R=烷基：脂肪胺芳基：芳香胺伯胺(一級胺)仲胺(二級胺)叔胺(三級胺)季胺(四級胺)4第二章戊二胺2.11,5—戊二胺的性質(zhì)1,5—戊二胺又稱為尸胺，是一種多胺,又名1,5一二氨基戊烷,是一種粘稠狀液體,沸點(diǎn)178一180度,折光率為1.463，易溶于水、乙醇、難溶于乙醚,深度冷凍可凝固結(jié)晶,但在常溫下又熔為液體，有六氫吡啶的臭味,在空氣中發(fā)煙,能形成二水化合物。它是生物體內(nèi)廣泛存在的具有生物活性的含氮堿,它在腐爛的尸體中可以分離得到。52.21,5—戊二胺的應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用1在農(nóng)業(yè)上，1，5－戊二胺作為第三信使可用于調(diào)節(jié)植物衰老過程、促進(jìn)雌雄蕊的發(fā)育2在醫(yī)學(xué)上，可作為一種有效治療痢疾的藥物，也是微生物細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)鐵離子濃度的“鐵親和系統(tǒng)”的主要組成成分；3在工業(yè)上，作為一種重要的工業(yè)化工原料，是由可再生原料衍生得到的生物聚酰胺，廣泛應(yīng)用于各種聚酰胺產(chǎn)品；可以替代傳統(tǒng)的由化工方法生產(chǎn)的生物胺———己二胺，與二元酸進(jìn)行聚合反應(yīng)可合成優(yōu)質(zhì)高分子材料———新型尼龍5662.31,5—戊二胺的生產(chǎn)微生物轉(zhuǎn)化法

談微生物直接發(fā)酵法直接提取法談7尸胺是生物體內(nèi)廣泛存在的具有生物活性的含氮堿,它在腐爛的尸體中可以分離得到，但是由于含量較低,不適合大量生產(chǎn)直接提取法8產(chǎn)量72g/L2009年德國學(xué)者學(xué)者M(jìn)artin·費(fèi)爾科特,B·恩斯特等人以C.glutamicum為出發(fā)菌株，經(jīng)發(fā)酵、pH調(diào)控、熱處理、萃取、蒸餾純化等過程，經(jīng)80h發(fā)酵后，最終獲得戊二胺產(chǎn)量可達(dá)72g/L。2005年日本東麗尖端融合研究所通過對賴氨酸工業(yè)生產(chǎn)上所用的谷氨酸棒桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作,把來源于大腸桿菌的賴氨酸脫梭酶基因的表達(dá)單元插入高絲氨酸脫氫酶基因座，發(fā)酵15小時生產(chǎn)出2.5g/L產(chǎn)量2.5g/L2010年天津科技大學(xué)牛濤等通過PCR擴(kuò)增獲得蜂房哈夫尼菌

中的賴氨酸脫羧酶基因ldc，以大腸/谷氨酸棒桿菌

穿梭質(zhì)粒pXMJ19為載體，將目的基因ldc克隆至谷氨酸棒桿菌中，經(jīng)36h發(fā)酵，產(chǎn)量為0.96g/L產(chǎn)量0.96g/L微生物直接發(fā)酵法9產(chǎn)率38%日本學(xué)者Takahshi研究大腸桿菌

的游離細(xì)胞，以D，L－賴氨酸為底物通過LDC不對稱降解L－賴氨酸獲得D－賴氨酸和1，5－戊二胺，經(jīng)過多步驟的產(chǎn)物分離過程，可達(dá)到38%的產(chǎn)率。產(chǎn)物分離過程復(fù)雜,成本高，細(xì)胞無重復(fù)使用性。

蔣麗麗等研究了4種固定化蜂房哈夫尼菌菌體細(xì)胞的材料和方法,包括海藻酸鈣包埋法，半透膜透析袋法,海藻酸鈣一明膠交聯(lián)包埋法和明膠包埋法，其中海藻酸鈣包埋法穩(wěn)定性最好。用該方法轉(zhuǎn)化測得酶活可達(dá)1028.9U/mL，重復(fù)性佳:第一批固定化細(xì)胞酶活可達(dá)游離菌體的98.62%,第四批為第一批的38.68%海藻酸鈣包埋法朱婧在《微生物轉(zhuǎn)發(fā)L-賴氨酸為尸胺》的碩士論文中優(yōu)化了產(chǎn)酶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，經(jīng)過20h的反應(yīng),細(xì)胞的酶活基本比較穩(wěn)定,20h時還能保持起始酶活的91%,投入底物賴氨酸160g,應(yīng)得尸胺111.1g,實(shí)際得到尸胺105.11g,尸胺收率為94.61%。收率94.61微生物轉(zhuǎn)化法10采用游離細(xì)胞進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)戊二胺，雖然能夠富集賴氨酸脫羧酶，無重復(fù)使用性較差，并且由于菌種不能積累賴氨酸，需要外加賴氨酸作為酶的反應(yīng)底物，故仍無法解決原料成本過高的問題。112.4戊二胺的代謝機(jī)理研究L—賴氨酸脫羧反應(yīng)機(jī)理12L一賴氨酸脫羧酶(L一lysinedecarboxylase,簡稱LDC),是可逆的將賴氨酸脫C02生成尸胺(1,5一戊二胺)的酶，此酶是誘導(dǎo)性胞內(nèi)酶,需磷酸毗哆醛為輔酶促進(jìn)脫羧反應(yīng)。LDC存在于E.coli、尸桿菌(Bacteriumcadaveris)、Hafniaalvei等大多數(shù)微生物中，其也存在于高等植物中，如黃瓜等。其中細(xì)菌來源的賴氨酸脫羧酶有2種:cadA和

ldcC，ldcC是功能基因，在任何時候表達(dá)量都很弱。此外，在攜帶ldcC多拷貝量的菌株中，賴氨酸脫羧酶酶活會增加。賴氨酸脫羧酶（LDC）131,5—戊二胺在E.coil中的代謝圖譜14目前，在工程菌的研究改造方面多集中于C.glutamicum,

C.glutamicum

的最佳生長pH條件為中性，而ldc在中性條件下更有利于提高其表達(dá)量；因此，一方面有構(gòu)建攜帶ldc基因或賴氨酸—戊二胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)基因cadB的穿梭質(zhì)粒，在C.glutamicum中復(fù)制表達(dá)蛋白;另一方面或?qū)dc基因插入到C.glutamicum的基因組中進(jìn)行表達(dá)。15高濃度的尸胺不僅具有反饋抑制作用，還可導(dǎo)致細(xì)胞膜孔蛋白的關(guān)閉，影響細(xì)菌的正常生長，戊二胺代謝系統(tǒng)不僅包括其生物合成系統(tǒng)，還包括其轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、降解等代謝系統(tǒng)，我們需要深入研究微生物中1，5－戊二胺代謝途徑、關(guān)鍵酶、代謝流動分配和控制因素等。改造思路：①主要通過過量表達(dá)賴氨酸脫羧酶基因，通過構(gòu)建攜有l(wèi)dc基因的多拷貝質(zhì)粒；②用強(qiáng)啟動子增強(qiáng)賴氨酸脫羧酶基因的轉(zhuǎn)錄水平；增加賴氨酸代謝支路的流量；③增加1,5—戊二胺的排泄或篩選解除產(chǎn)物反饋抑制突變株以解除1,5—戊二胺對賴氨酸脫羧酶的反饋抑制；④敲除壓力反饋調(diào)節(jié)基因rpoS，降低戊二胺對菌體生長代謝的抑制作用。16技術(shù)手段：

①進(jìn)行有效基因定向改造，利用易錯PCR、DNA改組、雜合酶、交錯延伸等酶的體外定向進(jìn)化的方法對賴氨酸脫羧酶進(jìn)行基因改造；②應(yīng)用生物信息學(xué)和代謝組學(xué)等知識構(gòu)建完善的代謝模型和計算模型，對產(chǎn)物代謝流進(jìn)行分析；③采取單因素、響應(yīng)面法和正交設(shè)計法等方法，優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基條件，從而達(dá)到提高酶活、進(jìn)一步提高1，5－戊二胺產(chǎn)量的目的；④采用恒溫等離子誘變技術(shù)（ARTP）對現(xiàn)有高產(chǎn)賴氨酸工程菌進(jìn)行等離子誘變，篩選正突變菌株。172.5簡述德國巴斯夫公司有關(guān)戊二胺的提取工藝技術(shù)1，去除發(fā)酵液中的細(xì)胞；2，堿化發(fā)酵液——通過加入堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物將發(fā)酵液調(diào)整到PH=11，或者更高，依據(jù)乙酰基DAP的量；3，熱處理發(fā)酵液——將堿化的發(fā)酵液通過加熱到回流溫度進(jìn)行熱處理；4，采用偶極質(zhì)子性有機(jī)溶劑璉烷醇或環(huán)烷醇作為萃取劑（在升高的溫度下進(jìn)行）；5，通過蒸餾提純或在相中沉淀從取出的有機(jī)相中分離DAP18易錯PCR是在采用DNA聚合酶進(jìn)行目的基因擴(kuò)增時，通過調(diào)整反應(yīng)條件，如提高M(jìn)g離子濃度，加入錳離子，改變體系中四種dNTPs濃度或運(yùn)用低保真度DNA聚合酶，來改變擴(kuò)增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機(jī)引入突變，獲得蛋白質(zhì)分子的隨機(jī)突變體。其關(guān)鍵在于對合適突變頻率的選擇，突變頻率太高會導(dǎo)致絕大多數(shù)突變?yōu)橛泻ν蛔?，無法篩選到有益的突變，頻率太低則會導(dǎo)致文庫中全是野生型群體。理想的堿基置換頻率和易錯的最佳條件主要依賴于突變的DNA片段的長度。連續(xù)易錯PC策略（sequentialermr-PronePCR）：將一次擴(kuò)增得到的有益突變基因作為下一次擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)的隨機(jī)誘變，讓有益的正突變不斷的積累。DNAshuffling：目前最方便，有效的一種分子水平的體外定向進(jìn)化技術(shù)，通過對單基因或相關(guān)基因家族的靶序列進(jìn)行多輪隨機(jī)誘變、重組和高通量篩選，可以有效富集正突變，去除負(fù)突變，提高突變文庫的豐度。2.6詞條：易錯PCR及DNA重組19第三章丁二胺分子式：C4H12N2，分子量為88.15，白色結(jié)晶，熔點(diǎn)27—28℃，沸點(diǎn)為158—159℃，相對密度為0.8777，易溶于水，能吸收二氧化碳，有強(qiáng)烈的氨臭味。用途：有機(jī)合成中間體，用于制藥和生化研究；制備表面活性劑，以及農(nóng)用化學(xué)品；是合成新型材料尼龍46的原料。制備方法：由吡咯和鹽酸羥胺反應(yīng)得丁二肟(wo),經(jīng)還原得丁二胺；也有通過丁二氰脫氫反應(yīng)來制備丁二胺。3.11,4—丁二胺的性質(zhì)203.2大腸桿菌中1,4—丁二胺的代謝圖21E.colipossessestwoformsofODC:oneisaconstitutiveoneencodedbythespeCgene,andtheotherisaninducible(可誘導(dǎo))oneatlowpH,whichisencodedbythespeFgene.Inanearlierstudy,recombinantE.coliDR112strainoverexpressingthespeCgeneproduced25mg/Lofputrescine(KashiwagiandIgarashi,1988).Morerecently,Eppelmannetal.(2006)reportedproductionofputrescineupto5.1g/Lbyfedbatchculture（補(bǔ)料分批培養(yǎng)）ofE.coliLJ110overexpressingthespeFgene.Eventhoughthisconcentrationisrelativelyhigh,itisnothighenoughtobeconsideredtobecompetitivewiththeexistingchemicalprocess.Also,theuseofratherexpensiveisopropyl-b-D-thiogalactopyranoside(IPTG)asaninducerintheabovestudyisnotencouragedforrealindustrialapplication.223.3改造思路3.4改造方法①構(gòu)建含有speC基因的低拷貝p15speC質(zhì)粒；②敲除染色體基因；③用trc啟動子替換原基因啟動子23其中實(shí)心正方形曲線圖為XQ52菌株并攜帶p15speC?？招那€為XQ43菌株并攜帶p15speC質(zhì)粒。atoC基因跟短鏈脂肪酸的代謝有關(guān)；rpoS壓力調(diào)控基因,是大腸桿茵RNA聚合酶的一個亞基。在壓力情況下，如高溫、酸、滲透沖擊、營養(yǎng)缺陷和生長進(jìn)入穩(wěn)定期等能夠被誘導(dǎo)，并在一定程度上能夠取代σ70與核心酶結(jié)合形成全酶，從而激活多數(shù)σs依賴的基因的轉(zhuǎn)錄243.5學(xué)習(xí)與總結(jié)質(zhì)粒構(gòu)建易錯PCR酶工程

學(xué)習(xí)什么？啟動子替換rpoS代謝流25[1]蔣麗麗,劉均忠,沈俞,等.用固定化L一賴氨酸脫梭酶細(xì)胞制備1,5一戊二胺[s].精細(xì)化工,2007,11:1079一1084.[2]牛濤，黎明，張建中等.一步法生產(chǎn)1,5—戊二胺谷氨酸棒桿菌基因工程菌的構(gòu)建[J].中國生物工程雜志，2010,93-99.[3]朱婧.微生物轉(zhuǎn)化L－賴氨酸為尸胺的研究[D].天津:天津科技大學(xué).2009．[4]黃云雁黎明劉萌，等.賴氨酸-尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cadB基因谷氨酸棒桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化[J].生物技術(shù)通報,2012,8[5]M·弗爾科特，O·策爾德爾，B·恩斯特，等.發(fā)酵生產(chǎn)1,5—二氨基戊烷的方法[P].200980110562.9,2009,1,23.[6]劉玉芳.尼龍54的改性[