分子實(shí)驗(yàn)操作誤區(qū)

常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作誤區(qū)及經(jīng)驗(yàn)淺析報(bào)告內(nèi)容實(shí)驗(yàn)過程中存在的主要問題1PaulSteven實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn)漫談3實(shí)驗(yàn)室常用材料的成本4PaulSteven實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)2實(shí)驗(yàn)記錄的電子化管理5一實(shí)驗(yàn)過程中存在的主要問題實(shí)驗(yàn)效率低1、實(shí)驗(yàn)前材料準(zhǔn)備不足，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)過程中臨時(shí)配置或購買某些必須材料，導(dǎo)致延誤；2、實(shí)驗(yàn)理論、原理上把握不夠，遇到問題不懂得分析原因，單純地重復(fù)相同的操作，重復(fù)相同的錯誤。3、時(shí)間安排不夠緊湊，實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)大量的“等待”時(shí)間，不懂得合理安排利用，僅僅是在手機(jī)屏幕與手指之間白白流逝掉。4、對實(shí)驗(yàn)不重視，操作過程中粗心隨意，不按照標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗又重新進(jìn)行。5、實(shí)驗(yàn)操作不熟練，動作較慢，錯誤較多。6、其他的一些原因。一實(shí)驗(yàn)過程中存在的主要問題實(shí)驗(yàn)效率低缺乏整體觀念文獻(xiàn)把握不夠1、對自己的研究需要做哪些實(shí)驗(yàn)、做到什么程度可以講出一個故事或者可以發(fā)表什么樣的論文，沒有概念。2、實(shí)驗(yàn)沒有針對性，特別是表型檢測及拿到突變體之后的實(shí)驗(yàn)，見別人在做什么就做什么，沒有根據(jù)自己的材料的特點(diǎn)設(shè)計(jì)有針對性的檢測實(shí)驗(yàn)。3、實(shí)驗(yàn)進(jìn)展與原理把握不夠，不能站在已發(fā)表的文獻(xiàn)資料的原有平臺上進(jìn)一步提升自己研究的高度和深度。4、對自己的研究缺乏興趣，缺乏信心，缺乏成就感，不明白自己課題的意義，缺乏主動探索的精神。一實(shí)驗(yàn)過程中存在的主要問題實(shí)驗(yàn)效率低缺乏整體觀念文獻(xiàn)把握不夠材料浪費(fèi)嚴(yán)重1、酶制劑使用過多、實(shí)驗(yàn)操作中樣品使用過多；2、一次性塑料制品過多使用，導(dǎo)致白色污染；3、實(shí)驗(yàn)操作不規(guī)范，導(dǎo)致大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)；4、不懂得充分利用實(shí)驗(yàn)材料，如KIX板顯色效果差了，可以用來轉(zhuǎn)板而無需直接丟棄。二實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：操作粗獷、過于隨意實(shí)驗(yàn)操作過于隨意，對一切實(shí)驗(yàn)操作抱著無所謂的心理，不按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行。①稱量樣品時(shí)隨意，不擦拭樣品匙，不考慮精確度，不在意樣品的灑落；取瓊脂粉時(shí)不稱量，“大概”式添加。②做凝膠不按時(shí)收膠，凝膠在外面放置太久；電泳時(shí)不根據(jù)自己的樣品大小選擇某種濃度的瓊脂糖凝膠；電泳時(shí)電壓過高；電泳液長期不更換。③制備感受態(tài)的菌直接從-80℃冰箱或長期放置的平板上取出液體培養(yǎng)；制備過程中過多步驟沒有在冰上操作；制備的感受態(tài)不進(jìn)行驗(yàn)證就直接做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。④揮發(fā)性材料沒有在室外通風(fēng)處或者室內(nèi)的通風(fēng)廚中取用。二實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：操作粗獷、過于隨意實(shí)驗(yàn)操作過于隨意，對一切實(shí)驗(yàn)操作抱著無所謂的心理，不按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行。⑤因粗心大意、不認(rèn)真而導(dǎo)致的樣品取錯、溶液配方看錯、實(shí)驗(yàn)樣品混淆（不認(rèn)真做筆記）、加錯試劑、看錯實(shí)驗(yàn)條件等等情況常有發(fā)生，不一而足。⑥不認(rèn)真做筆記，無論是各種反應(yīng)的體系、溶劑配方還是某些關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)操作，不做筆記或者僅僅是寫在臨時(shí)的紙片上，之后就遺失或遺忘了。⑦實(shí)驗(yàn)操作的臺面“臟亂差”，只能在“夾縫中”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，可能會使得很多未知的東西從桌面混入反應(yīng)體系，影響實(shí)驗(yàn)。⑧超凈臺滅菌開著風(fēng)機(jī)、不關(guān)死玻璃窗、里面的材料過多，存在較多的死角。⑨不注意某些緩沖液的pH值，感覺差不多就隨意用。二實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：貪婪心理在實(shí)驗(yàn)中總覺得取用的材料不夠，總認(rèn)為多多益善，沒有微量的概念，不能克服貪婪心理，不僅造成不必要的材料浪費(fèi)，還會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，浪費(fèi)大量寶貴時(shí)間。①酶制劑取用過多。②菌體PCR時(shí)菌體取用過多。③電泳時(shí)上樣量過多。④做PCR時(shí)，模板量如總DNA、總RNA添加過多。⑤提取總DNA或質(zhì)粒時(shí)，總認(rèn)為菌體越多越好。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的哲學(xué)：做人勿貪！二實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：總怕染菌有些同學(xué)在做實(shí)驗(yàn)時(shí)總覺得超凈臺不夠干凈，總怕染菌，表現(xiàn)在以下幾個方面。①超凈臺滅菌時(shí)間過長。②每次倒平板重新滅菌。③做感受態(tài)過程中樣品離心過程中超凈臺反復(fù)滅菌。1、滅菌過程中產(chǎn)生的臭氧對人體有害、對馬上進(jìn)行操作的樣品細(xì)胞有害；2、紫外燈壽命縮短，作用變?nèi)?，原?8分鐘可以完成的滅菌，可能需要25分鐘甚至更長。二實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：僥幸心理僥幸心理是分子生物實(shí)驗(yàn)中大家最容易犯的一種錯誤，無論是有經(jīng)驗(yàn)的還是沒經(jīng)驗(yàn)的同學(xué)，都不例外。大家總是想省時(shí)間、省步驟以及對前一步實(shí)驗(yàn)的盲目自信是產(chǎn)生這種心理的主要原因。我們現(xiàn)用的絕多數(shù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法都是在分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論的基礎(chǔ)上，輔以前人大量的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)而建立的，實(shí)驗(yàn)條件的細(xì)小改變，不一定會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，但如果連續(xù)幾個步驟都有細(xì)小的改變，積累起來常會出大錯，而一旦出錯了，往往不能夠找到原因在哪里。所以，我們常常遇到一些莫名其妙的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無法用我們常識的知識去解釋的結(jié)果。二實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：僥幸心理按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范認(rèn)真做好每一步操作，該進(jìn)行檢測和驗(yàn)證的，盡量不要省略。不要盲目、過分地相信經(jīng)驗(yàn)！僥幸心理常有的表現(xiàn)：①質(zhì)粒酶切后不電泳檢測是否酶切完全；②測序時(shí)樣品質(zhì)量不過關(guān)，僥幸認(rèn)為應(yīng)該可以測的出來；③感受態(tài)細(xì)胞制備完以后不檢測轉(zhuǎn)化效率、不檢測是否染菌就直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)材料的轉(zhuǎn)化；④互補(bǔ)時(shí)將基因片段不連接到小載體上測序，而是直接連接到互補(bǔ)的大質(zhì)粒上測序；⑤提總DNA或質(zhì)粒時(shí)不進(jìn)活化的步驟，直接從-80℃冰箱取菌液體培養(yǎng)。⑥設(shè)計(jì)引物時(shí)忽略特異性比對的步驟，忽略二聚體等信息的分析步驟。二實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：不愿思考為什么很多同學(xué)在做實(shí)驗(yàn)時(shí)，容易出現(xiàn)兩種情況：一是按照自己的意愿隨意更改經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)操作，二是盲目相信往屆畢業(yè)生的畢業(yè)論文中的實(shí)驗(yàn)方法。這兩種情況的出現(xiàn)都是缺少必要的思考：該實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵點(diǎn)是什么？別人為什么這么操作？如果不這么操作會出現(xiàn)什么后果？哪些步驟是可以改良的？針對自己的具體實(shí)驗(yàn)，哪些步驟是不同的？二實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)2、常見的不規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作—A①不知道哪些藥品需要滅菌，哪些不需要滅菌，如SDS溶液、NaOH溶液；不知道哪些可以高壓滅菌，哪些需要低壓滅菌。②PCR時(shí)不做正對照和負(fù)對照。③驗(yàn)證性PCR循環(huán)數(shù)過多。推薦25個循環(huán)。④PCR產(chǎn)物電泳上樣量過多。推薦1ul-2ul。⑤電泳時(shí)很多泳道都加DNAmarker。⑥膠回收用的凝膠過厚。推薦使用80ml的打膠。⑦膠回收時(shí)用酒精燈燒切膠刀。推薦使用多個切膠刀。⑧膠回收用的凝膠中加入過多的GelRed。推薦0.8ulGelRed/100ml凝膠。⑨提質(zhì)粒均用氯仿抽提。PCR驗(yàn)證、酶切驗(yàn)證用無需抽提。二實(shí)驗(yàn)室存在的實(shí)驗(yàn)誤區(qū)2、常見的不規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作—B①使用PCR儀時(shí)，隨便更改他人的程序；②使用水浴鍋后不關(guān)閉，特別是高溫水浴；③使用各類儀器時(shí)，不看貼在旁邊的使用操作說明。④倒平板時(shí)，不論各類平板，均倒13塊。對于普通的轉(zhuǎn)板、藍(lán)白篩選等操作用的平板，推薦倒15-17塊板/300ml培養(yǎng)基。三實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn)質(zhì)粒的提取常見問題與對策提質(zhì)粒電泳顯示應(yīng)該幾條帶？哪種情況較好？質(zhì)粒在電泳時(shí)會出現(xiàn)三種情況的圖譜：1）三條帶，按照電泳泳動速度（快到慢）排列為：超螺旋、缺口閉環(huán)、開環(huán)。經(jīng)常會出現(xiàn)。2）兩條帶，超螺旋/閉環(huán)/開環(huán)任意兩種。3）一條帶，超螺旋。出現(xiàn)不同的結(jié)果都是由抽提質(zhì)粒時(shí)的操作手法造成的。如果嚴(yán)格按照操作步驟，超螺旋的質(zhì)粒會較多。至于那種情況好，要看我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的目的了，進(jìn)行分子克隆的操作，構(gòu)建載體。這隨便那種情況都可以，不會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和測序，必須要超螺旋，所以它們的質(zhì)量好壞順序是：3）、2）、1）三實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn)質(zhì)粒的提取常見問題與對策質(zhì)粒大小如何在電泳中的鑒定？酶切將質(zhì)粒線性化以后，才可以用marker判斷大小。如果有三種構(gòu)像，可以用中間那條帶與marker比較判斷大小。商品化的質(zhì)粒估計(jì)應(yīng)該大部分是超螺旋構(gòu)像。酶切后線性化條帶電泳時(shí)所處的位置就指示質(zhì)粒的大小。三實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn)質(zhì)粒的提取常見問題與對策在保存或抽提DNA過程中，一般采用什么緩沖液？為什么？一般采用TE緩沖液。在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。如下游有特殊需要也可用水保存DNA。我們一般直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作，無需考慮樣品的存儲問題，為避免可能帶來的各類離子的干擾，常選用滅菌的去離子水溶解DNA。三實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn)質(zhì)粒的提取常見問題與對策抽提質(zhì)粒DNA時(shí)，用酚、氯仿、異戊醇有什么作用？酚與氯仿是非極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，沉淀在水相下面與水相中的DNA分開。酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器，易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1，同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。三實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn)質(zhì)粒的提取常見問題與對策在提取質(zhì)粒時(shí)，是否可以不抽提蛋白質(zhì)？我們常用的質(zhì)粒或者重組質(zhì)粒，基本都是在DH5α這類蛋白質(zhì)較少的大腸桿菌中的，如果是需要送樣測序，或者酶切后進(jìn)行連接操作，建議用酚：氯仿進(jìn)行抽提，如果僅僅是為了酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒，則無需進(jìn)行抽提。在加完溶液III后，離心取上清，再次離心，重新取上清加無水乙醇沉淀。兩次離心可以去除絕大部分的不溶性蛋白質(zhì)，在最后所得的質(zhì)粒DNA中基本沒有不溶性的物質(zhì)出現(xiàn)。這種沒有抽提的質(zhì)粒完全可以滿足膠回收、酶切驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)的要求。三實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn)質(zhì)粒的提取常見問題與對策在使用堿裂解法提取質(zhì)粒時(shí)，加溶液III離心后出現(xiàn)一層白色的蛋白質(zhì)漂浮物怎么辦？兩種解決方法：一是在加完溶液III后放在-20℃冰箱冰上10分鐘，可以有效減少和杜絕蛋白質(zhì)漂浮物；二是將這些上清液取出后再次離心，再次取上清，基本可以完全去除這些蛋白質(zhì)漂浮物。三實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn)其他方面的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)制備感受態(tài)的菌每次從-80℃冰箱取出活化，活化后再轉(zhuǎn)接一次，然后再進(jìn)行液體培養(yǎng)。菌體PCR，對于大腸桿菌只需用尖頭的牙簽碰一點(diǎn)點(diǎn)菌體便可。菌體PCR的體系，推薦10ul的體系，比20ul的體系減半。酶切的樣品如重組質(zhì)粒，不要一次性全部切完，要留一部分防止此次酶切失敗而又要重新制備材料。三實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn)其他方面的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)連接時(shí)，可以使用10ul的連接體系，使用不超過0.5ul的連接酶，不僅可以比使用5ul連接體系省酶，還可以在轉(zhuǎn)化步驟有多余的連接體系備用。做轉(zhuǎn)化時(shí)可以使用5ul的連接液轉(zhuǎn)化，剩余的連接液放到-20℃冰箱暫存；如果因某些不確定性因素導(dǎo)致轉(zhuǎn)化失敗，可以用剩余的連接液再次轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化時(shí)如果轉(zhuǎn)化液不完全涂布的話，最好剩余的轉(zhuǎn)化液放到4°冰箱保存，直至確定本次轉(zhuǎn)化可以挑選到自己所需的轉(zhuǎn)化子；如果沒有獲得或者因某些因素導(dǎo)致本次涂布失敗，可以用剩余的轉(zhuǎn)化液重新涂布。三實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)驗(yàn)其他方面的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)做PCR時(shí)8連管的標(biāo)記做藍(lán)白篩選時(shí)，37℃下培養(yǎng)17小時(shí)以上便可顯色。顯色后將平板置于4℃兩小時(shí)，藍(lán)色會加深。用試劑盒提取質(zhì)?；蛘呒兓疍NA、膠回收時(shí)，最后一步加水或TEBuffer溶解和收集DNA時(shí)，可以將收集到的溶液再次放回柱子中離心一次，可以大大增加樣品的濃度；也可以再次加新的水離心一次。普通的酶切驗(yàn)證，重組質(zhì)粒取3ul，總體系用10ul，電泳時(shí)根據(jù)需要看看是否需要稀釋，一般電泳1-2ul酶切體系便可，過多上樣會導(dǎo)致電泳不整齊，不能準(zhǔn)確地判斷酶切片段的大小。四

常用到的部分材料成本試劑材料類瓊脂糖1.5元/gGelRed1.2元/ul100bpMarker160元/支，0.3元/ul連接酶5元/ul

測序成本生工生物22元/反應(yīng)華大基因20元/反應(yīng)Invitrogen