分子實驗操作誤區(qū)

常規(guī)分子生物學實驗操作誤區(qū)及經(jīng)驗淺析報告內容實驗過程中存在的主要問題1PaulSteven實驗操作的經(jīng)驗漫談3實驗室常用材料的成本4PaulSteven實驗室存在的實驗誤區(qū)2實驗記錄的電子化管理5一實驗過程中存在的主要問題實驗效率低1、實驗前材料準備不足，導致實驗過程中臨時配置或購買某些必須材料，導致延誤；2、實驗理論、原理上把握不夠，遇到問題不懂得分析原因，單純地重復相同的操作，重復相同的錯誤。3、時間安排不夠緊湊，實驗過程中出現(xiàn)大量的“等待”時間，不懂得合理安排利用，僅僅是在手機屏幕與手指之間白白流逝掉。4、對實驗不重視，操作過程中粗心隨意，不按照標準操作進行，導致實驗失敗又重新進行。5、實驗操作不熟練，動作較慢，錯誤較多。6、其他的一些原因。一實驗過程中存在的主要問題實驗效率低缺乏整體觀念文獻把握不夠1、對自己的研究需要做哪些實驗、做到什么程度可以講出一個故事或者可以發(fā)表什么樣的論文，沒有概念。2、實驗沒有針對性，特別是表型檢測及拿到突變體之后的實驗，見別人在做什么就做什么，沒有根據(jù)自己的材料的特點設計有針對性的檢測實驗。3、實驗進展與原理把握不夠，不能站在已發(fā)表的文獻資料的原有平臺上進一步提升自己研究的高度和深度。4、對自己的研究缺乏興趣，缺乏信心，缺乏成就感，不明白自己課題的意義，缺乏主動探索的精神。一實驗過程中存在的主要問題實驗效率低缺乏整體觀念文獻把握不夠材料浪費嚴重1、酶制劑使用過多、實驗操作中樣品使用過多；2、一次性塑料制品過多使用，導致白色污染；3、實驗操作不規(guī)范，導致大量的重復實驗；4、不懂得充分利用實驗材料，如KIX板顯色效果差了，可以用來轉板而無需直接丟棄。二實驗室存在的實驗誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：操作粗獷、過于隨意實驗操作過于隨意，對一切實驗操作抱著無所謂的心理，不按照標準實驗操作進行。①稱量樣品時隨意，不擦拭樣品匙，不考慮精確度，不在意樣品的灑落；取瓊脂粉時不稱量，“大概”式添加。②做凝膠不按時收膠，凝膠在外面放置太久；電泳時不根據(jù)自己的樣品大小選擇某種濃度的瓊脂糖凝膠；電泳時電壓過高；電泳液長期不更換。③制備感受態(tài)的菌直接從-80℃冰箱或長期放置的平板上取出液體培養(yǎng)；制備過程中過多步驟沒有在冰上操作；制備的感受態(tài)不進行驗證就直接做轉化實驗。④揮發(fā)性材料沒有在室外通風處或者室內的通風廚中取用。二實驗室存在的實驗誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：操作粗獷、過于隨意實驗操作過于隨意，對一切實驗操作抱著無所謂的心理，不按照標準實驗操作進行。⑤因粗心大意、不認真而導致的樣品取錯、溶液配方看錯、實驗樣品混淆（不認真做筆記）、加錯試劑、看錯實驗條件等等情況常有發(fā)生，不一而足。⑥不認真做筆記，無論是各種反應的體系、溶劑配方還是某些關鍵實驗操作，不做筆記或者僅僅是寫在臨時的紙片上，之后就遺失或遺忘了。⑦實驗操作的臺面“臟亂差”，只能在“夾縫中”進行實驗操作，可能會使得很多未知的東西從桌面混入反應體系，影響實驗。⑧超凈臺滅菌開著風機、不關死玻璃窗、里面的材料過多，存在較多的死角。⑨不注意某些緩沖液的pH值，感覺差不多就隨意用。二實驗室存在的實驗誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：貪婪心理在實驗中總覺得取用的材料不夠，總認為多多益善，沒有微量的概念，不能克服貪婪心理，不僅造成不必要的材料浪費，還會導致實驗失敗，浪費大量寶貴時間。①酶制劑取用過多。②菌體PCR時菌體取用過多。③電泳時上樣量過多。④做PCR時，模板量如總DNA、總RNA添加過多。⑤提取總DNA或質粒時，總認為菌體越多越好。分子生物學實驗中的哲學：做人勿貪！二實驗室存在的實驗誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：總怕染菌有些同學在做實驗時總覺得超凈臺不夠干凈，總怕染菌，表現(xiàn)在以下幾個方面。①超凈臺滅菌時間過長。②每次倒平板重新滅菌。③做感受態(tài)過程中樣品離心過程中超凈臺反復滅菌。1、滅菌過程中產(chǎn)生的臭氧對人體有害、對馬上進行操作的樣品細胞有害；2、紫外燈壽命縮短，作用變弱，原本18分鐘可以完成的滅菌，可能需要25分鐘甚至更長。二實驗室存在的實驗誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：僥幸心理僥幸心理是分子生物實驗中大家最容易犯的一種錯誤，無論是有經(jīng)驗的還是沒經(jīng)驗的同學，都不例外。大家總是想省時間、省步驟以及對前一步實驗的盲目自信是產(chǎn)生這種心理的主要原因。我們現(xiàn)用的絕多數(shù)分子生物學實驗方法都是在分子生物學基礎理論的基礎上，輔以前人大量的實驗經(jīng)驗而建立的，實驗條件的細小改變，不一定會導致實驗失敗，但如果連續(xù)幾個步驟都有細小的改變，積累起來常會出大錯，而一旦出錯了，往往不能夠找到原因在哪里。所以，我們常常遇到一些莫名其妙的實驗結果，無法用我們常識的知識去解釋的結果。二實驗室存在的實驗誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：僥幸心理按照標準規(guī)范認真做好每一步操作，該進行檢測和驗證的，盡量不要省略。不要盲目、過分地相信經(jīng)驗！僥幸心理常有的表現(xiàn)：①質粒酶切后不電泳檢測是否酶切完全；②測序時樣品質量不過關，僥幸認為應該可以測的出來；③感受態(tài)細胞制備完以后不檢測轉化效率、不檢測是否染菌就直接進行實驗材料的轉化；④互補時將基因片段不連接到小載體上測序，而是直接連接到互補的大質粒上測序；⑤提總DNA或質粒時不進活化的步驟，直接從-80℃冰箱取菌液體培養(yǎng)。⑥設計引物時忽略特異性比對的步驟，忽略二聚體等信息的分析步驟。二實驗室存在的實驗誤區(qū)1、思想觀念上的誤區(qū)：不愿思考為什么很多同學在做實驗時，容易出現(xiàn)兩種情況：一是按照自己的意愿隨意更改經(jīng)典的實驗操作，二是盲目相信往屆畢業(yè)生的畢業(yè)論文中的實驗方法。這兩種情況的出現(xiàn)都是缺少必要的思考：該實驗成敗的關鍵點是什么？別人為什么這么操作？如果不這么操作會出現(xiàn)什么后果？哪些步驟是可以改良的？針對自己的具體實驗，哪些步驟是不同的？二實驗室存在的實驗誤區(qū)2、常見的不規(guī)范實驗操作—A①不知道哪些藥品需要滅菌，哪些不需要滅菌，如SDS溶液、NaOH溶液；不知道哪些可以高壓滅菌，哪些需要低壓滅菌。②PCR時不做正對照和負對照。③驗證性PCR循環(huán)數(shù)過多。推薦25個循環(huán)。④PCR產(chǎn)物電泳上樣量過多。推薦1ul-2ul。⑤電泳時很多泳道都加DNAmarker。⑥膠回收用的凝膠過厚。推薦使用80ml的打膠。⑦膠回收時用酒精燈燒切膠刀。推薦使用多個切膠刀。⑧膠回收用的凝膠中加入過多的GelRed。推薦0.8ulGelRed/100ml凝膠。⑨提質粒均用氯仿抽提。PCR驗證、酶切驗證用無需抽提。二實驗室存在的實驗誤區(qū)2、常見的不規(guī)范實驗操作—B①使用PCR儀時，隨便更改他人的程序；②使用水浴鍋后不關閉，特別是高溫水??；③使用各類儀器時，不看貼在旁邊的使用操作說明。④倒平板時，不論各類平板，均倒13塊。對于普通的轉板、藍白篩選等操作用的平板，推薦倒15-17塊板/300ml培養(yǎng)基。三實驗操作的經(jīng)驗質粒的提取常見問題與對策提質粒電泳顯示應該幾條帶？哪種情況較好？質粒在電泳時會出現(xiàn)三種情況的圖譜：1）三條帶，按照電泳泳動速度（快到慢）排列為：超螺旋、缺口閉環(huán)、開環(huán)。經(jīng)常會出現(xiàn)。2）兩條帶，超螺旋/閉環(huán)/開環(huán)任意兩種。3）一條帶，超螺旋。出現(xiàn)不同的結果都是由抽提質粒時的操作手法造成的。如果嚴格按照操作步驟，超螺旋的質粒會較多。至于那種情況好，要看我們進一步實驗的目的了，進行分子克隆的操作，構建載體。這隨便那種情況都可以，不會影響后續(xù)實驗。進行細胞轉染和測序，必須要超螺旋，所以它們的質量好壞順序是：3）、2）、1）三實驗操作的經(jīng)驗質粒的提取常見問題與對策質粒大小如何在電泳中的鑒定？酶切將質粒線性化以后，才可以用marker判斷大小。如果有三種構像，可以用中間那條帶與marker比較判斷大小。商品化的質粒估計應該大部分是超螺旋構像。酶切后線性化條帶電泳時所處的位置就指示質粒的大小。三實驗操作的經(jīng)驗質粒的提取常見問題與對策在保存或抽提DNA過程中，一般采用什么緩沖液？為什么？一般采用TE緩沖液。在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。如下游有特殊需要也可用水保存DNA。我們一般直接進行下一步實驗操作，無需考慮樣品的存儲問題，為避免可能帶來的各類離子的干擾，常選用滅菌的去離子水溶解DNA。三實驗操作的經(jīng)驗質粒的提取常見問題與對策抽提質粒DNA時，用酚、氯仿、異戊醇有什么作用？酚與氯仿是非極性分子，當?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質的密度比水的密度為大，沉淀在水相下面與水相中的DNA分開。酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器，易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1，同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質，此時一起將酚帶走。三實驗操作的經(jīng)驗質粒的提取常見問題與對策在提取質粒時，是否可以不抽提蛋白質？我們常用的質?；蛘咧亟M質粒，基本都是在DH5α這類蛋白質較少的大腸桿菌中的，如果是需要送樣測序，或者酶切后進行連接操作，建議用酚：氯仿進行抽提，如果僅僅是為了酶切驗證重組質粒，則無需進行抽提。在加完溶液III后，離心取上清，再次離心，重新取上清加無水乙醇沉淀。兩次離心可以去除絕大部分的不溶性蛋白質，在最后所得的質粒DNA中基本沒有不溶性的物質出現(xiàn)。這種沒有抽提的質粒完全可以滿足膠回收、酶切驗證等實驗的要求。三實驗操作的經(jīng)驗質粒的提取常見問題與對策在使用堿裂解法提取質粒時，加溶液III離心后出現(xiàn)一層白色的蛋白質漂浮物怎么辦？兩種解決方法：一是在加完溶液III后放在-20℃冰箱冰上10分鐘，可以有效減少和杜絕蛋白質漂浮物；二是將這些上清液取出后再次離心，再次取上清，基本可以完全去除這些蛋白質漂浮物。三實驗操作的經(jīng)驗其他方面的實驗經(jīng)驗制備感受態(tài)的菌每次從-80℃冰箱取出活化，活化后再轉接一次，然后再進行液體培養(yǎng)。菌體PCR，對于大腸桿菌只需用尖頭的牙簽碰一點點菌體便可。菌體PCR的體系，推薦10ul的體系，比20ul的體系減半。酶切的樣品如重組質粒，不要一次性全部切完，要留一部分防止此次酶切失敗而又要重新制備材料。三實驗操作的經(jīng)驗其他方面的實驗經(jīng)驗連接時，可以使用10ul的連接體系，使用不超過0.5ul的連接酶，不僅可以比使用5ul連接體系省酶，還可以在轉化步驟有多余的連接體系備用。做轉化時可以使用5ul的連接液轉化，剩余的連接液放到-20℃冰箱暫存；如果因某些不確定性因素導致轉化失敗，可以用剩余的連接液再次轉化。轉化時如果轉化液不完全涂布的話，最好剩余的轉化液放到4°冰箱保存，直至確定本次轉化可以挑選到自己所需的轉化子；如果沒有獲得或者因某些因素導致本次涂布失敗，可以用剩余的轉化液重新涂布。三實驗操作的經(jīng)驗其他方面的實驗經(jīng)驗做PCR時8連管的標記做藍白篩選時，37℃下培養(yǎng)17小時以上便可顯色。顯色后將平板置于4℃兩小時，藍色會加深。用試劑盒提取質?；蛘呒兓疍NA、膠回收時，最后一步加水或TEBuffer溶解和收集DNA時，可以將收集到的溶液再次放回柱子中離心一次，可以大大增加樣品的濃度；也可以再次加新的水離心一次。普通的酶切驗證，重組質粒取3ul，總體系用10ul，電泳時根據(jù)需要看看是否需要稀釋，一般電泳1-2ul酶切體系便可，過多上樣會導致電泳不整齊，不能準確地判斷酶切片段的大小。四

常用到的部分材料成本試劑材料類瓊脂糖1.5元/gGelRed1.2元/ul100bpMarker160元/支，0.3元/ul連接酶5元/ul

測序成本生工生物22元/反應華大基因20元/反應Invitrogen