力學(xué)方法治療骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)理研究,理療學(xué)論文

力學(xué)方法治療骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)理研究,理療學(xué)論文骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是中老年人的一種常見疾病,慢性起病,造成患者關(guān)節(jié)疼痛、畸形和功能障礙.已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn),通過一定大小和頻率的力學(xué)刺激來治療骨關(guān)節(jié)炎,具有明顯緩解異常感覺和狀態(tài)和改善關(guān)節(jié)功能的作用[1].但是力學(xué)治療采用多大的力度和頻率,至今尚無定論,而且治療OA的機(jī)制也尚未明確.關(guān)節(jié)軟骨的退變是OA發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制.越來越多的研究表示清楚,軟骨細(xì)胞作為關(guān)節(jié)軟骨的主要組成部分,其凋亡與OA的進(jìn)程關(guān)系密切[2].在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨中,力學(xué)信號能夠通太多種途徑調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖和分化能力.本研究團(tuán)隊(duì)的前期工作中已經(jīng)證實(shí),短期內(nèi)持續(xù)的壓力能刺激軟骨細(xì)胞增殖,172kPa的持續(xù)壓力下,軟骨細(xì)胞的增殖能力最強(qiáng)[3-6].但是力學(xué)治療不僅講究加壓力度,施壓的頻率對治療效果也有影響.因而在持續(xù)性壓力的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究不同頻率的周期性壓力,對揭示力學(xué)方式方法治療OA的機(jī)理研究具有重要意義.本研究將持續(xù)施加的壓力改良為施加不同頻率的周期性壓力,觀察不同頻率組的軟骨細(xì)胞增殖和整合素11分泌的差異,進(jìn)一步揭示手法治療骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制.1材料與方式方法1.1主要試劑與儀器:胎牛血清(GIBCO,美國),培養(yǎng)液(Hy-clone,美國),Hanks液(Solarbio,中國),雙抗(GIBCO,美國),0.25%胰蛋白酶(Hyclone,美國),Ⅱ型膠原酶(Sigma,美國),CO2培養(yǎng)箱(Thermo,型號:311,美國),超凈臺(再鑫儀器,VCM-620,中國),低溫高速臺式離心機(jī)(Eppendorf,美國),熒光倒置相差顯微鏡(OLYMPUS,型號:CKX43,日本),全自動酶標(biāo)儀(Bio-Tek,型號:ELX900,美國).1.2施加不同頻率的周期性壓力控制裝置:通過前期研究使用的裝置[6],將壓力定為172kPa,加壓頻率根據(jù)分組要求設(shè)置B1組0.2Hz,B兩組0.5Hz,B3組1Hz,B4組2Hz和B5組5Hz.1.3兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與傳代:①取出生時(shí)間不到12h的新生新西蘭兔2只,處死;②置于75%酒精100mL浸泡15min消毒;③放置在消毒容器里,于超凈臺中進(jìn)行軟骨分離:剪刀剝離新生兔四肢長骨,剔除干凈肌肉、肌腱和筋膜等軟組織,用手術(shù)刀分離四肢骨骺端透明軟骨,并盡量切碎成小于1m3碎屑;④軟骨細(xì)胞消化分離:將切碎軟骨組織放入兩個(gè)無菌離心管,每管軟骨體積約為1mL,參加4mL(4倍于軟骨體積)0.25%胰蛋白酶,在37℃水浴鍋中消化約40min,參加4mL培養(yǎng)液(與胰蛋白酶等體積)終止消化,放入低溫高速臺式離心機(jī)配平后設(shè)定1500轉(zhuǎn)/min,離心5min,吸除上清液;參加4mL濃度為0.5mg/mLⅡ型膠原酶進(jìn)一步消化,37℃水浴鍋中消化4h后,將液體通過200目篩網(wǎng)過濾,濾下的液體放入離心管再經(jīng)低溫高速臺式離心機(jī)1500轉(zhuǎn)/min,離心5min,吸棄上清液,參加培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,分別接種于4個(gè)培養(yǎng)皿,培養(yǎng)皿參加含10%胎牛血清的培養(yǎng)液,放入37℃、5%二氧化碳及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).第2天原代軟骨細(xì)胞貼壁即可換培養(yǎng)液,并于熒光倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況.可見原代軟骨細(xì)胞呈小圓、多角等形態(tài),胞漿淡、飽滿,見圖1.天天將培養(yǎng)皿在超凈臺中更換培養(yǎng)液一次,注意無菌操作,避免細(xì)胞污染.一般于24-48h后,顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞貼壁情況良好,細(xì)胞呈梭形.等長滿培養(yǎng)皿底部80-90%左右,即可進(jìn)行消化傳代.傳代使用1:3的比例,傳至第三代細(xì)胞表型穩(wěn)定,即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)見圖2.1.4各組軟骨細(xì)胞增殖的測定:第三代兔軟骨細(xì)胞生長狀態(tài)良好、表型穩(wěn)定,用0.25%胰酶消化分離后離心機(jī)1500轉(zhuǎn)/min,離心5min,培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液密度,按3105個(gè)/孔密度接種到6孔板,并分為:A組常規(guī)培養(yǎng)不施加壓力,B組172kPa壓力以不同頻率干涉2h/d:B1組頻率0.2Hz,B2組0.5Hz,B3組1Hz,B4組2Hz,B5組5Hz).干涉3d后各組按5104密度分別接種到96孔板,每組8孔,細(xì)胞過夜貼壁.第2天測定細(xì)胞增殖:吸棄96孔板培養(yǎng)上液,每孔參加100L含10%WST-1試劑的培養(yǎng)液,37℃孵育2h后,450nm波長測定各孔吸光度OD值.根據(jù)各孔的吸光度和對照孔的比值分析軟骨細(xì)胞的增殖情況.1.5各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中整合素11的測定:軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及傳代同1.4,細(xì)胞消化分離后按3105個(gè)/孔密度接種到6孔板,分組與干涉方式方法同1.4.3d后收集各孔細(xì)胞上清液,放入離心管,離心機(jī)根據(jù)1500轉(zhuǎn)/min,離心20min,仔細(xì)收集上液,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測定各組培養(yǎng)上清液中整合素11的含量.1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)以x珋s表示,采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對各組間差異進(jìn)行單因素方差分析,P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1不同頻率的周期性壓力對兔軟骨細(xì)胞增殖的影響:一樣大小(172kPa)不同頻率的周期性壓力干涉軟骨細(xì)胞2h/d,作用3d后,細(xì)胞OD值對照組A組為1.080.13,B1組為1.190.11,B2組為1.230.08,B3組為1.350.06,B4組為1.450.09,B5組為1.370.12.加壓各組與對照組比擬OD值升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05).B組各組間OD值差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),峰值出如今B4組.見表1.2.2不同頻率的周期性壓力對兔軟骨細(xì)胞分泌整合素11的影響:一樣大小(172kPa)不同頻率的周期性壓力干涉軟骨細(xì)胞2h/d,作用3d后,整合素11水平對照組A組為3.020.26pg/mL,B1組為3.280.19pg/mL,B2組為3.430.11pg/mL,B3組為3.770.24pg/mL,B4組為4.010.09pg/mL,B5組為3.940.13pg/mL,周期性加壓各組與對照組比擬整合素11值升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05).B組各組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,峰值出如今B4組.見表1.一樣大小(172kPa)不同頻率的周期性壓力刺激兔軟骨細(xì)胞,均能增加軟骨細(xì)胞的增殖作用和整合素的含量.華而不實(shí)以2Hz的頻率作用最強(qiáng).3討論OA是一種慢性、進(jìn)展性骨關(guān)節(jié)疾病,發(fā)病率很高,給患者和社會帶來重大負(fù)擔(dān).當(dāng)前已得到共鳴的觀點(diǎn)是,關(guān)節(jié)軟骨的退變是導(dǎo)致OA發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[7].關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成.膠原纖維是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要構(gòu)造,能構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)格狀構(gòu)造,將軟骨細(xì)胞包裹在內(nèi),使關(guān)節(jié)軟骨能承受壓力、張力及剪切力.軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞類型[8],這些力學(xué)刺激通過膠原纖維傳導(dǎo)至軟骨細(xì)胞,引起細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生理變化,最終調(diào)節(jié)軟骨的退變.整合素是軟骨細(xì)胞的一種膠原受體,由和兩個(gè)亞單位組成,能夠接受來自細(xì)胞外基質(zhì)傳導(dǎo)到細(xì)胞的力學(xué)刺激信號.整合素在力學(xué)刺激下與相應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白結(jié)合后發(fā)生空間構(gòu)造改變,介導(dǎo)了軟骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的信號通路,它是軟骨細(xì)胞力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的前提,并進(jìn)一步調(diào)控軟骨的增殖、分化、生長、凋亡甚至影響到細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)造[9,10].有研究發(fā)現(xiàn)[11],整合素作為最重要的細(xì)胞外表力學(xué)刺激受體之一,通過細(xì)胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架信號傳導(dǎo)通路,完成力學(xué)刺激的傳導(dǎo),在防止細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表示出,甚至在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等生理和病理方面均起著重要的作用[12,13].已經(jīng)知道軟骨細(xì)胞表示出的整合素有:整合素11、21、31、51、61、101、V3、V5等,正常成人軟骨細(xì)胞以1型整合素表示出為主[11],十分是11、31和51,因而11具有很高的研究價(jià)值.力學(xué)方式方法治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制離不開生物力學(xué)和軟骨細(xì)胞研究.軟骨細(xì)胞對骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生和發(fā)展起著關(guān)鍵作用.軟骨細(xì)胞的增殖分化與力學(xué)刺激有密切關(guān)系,整合素就是揭示這種關(guān)系的關(guān)鍵因子,因而研究力學(xué)方式方法對骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制,能夠從力學(xué)刺激-整合素-軟骨細(xì)胞-骨關(guān)節(jié)炎這條途徑著手.在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn),適當(dāng)?shù)撵o水壓力刺激軟骨細(xì)胞,能上調(diào)Ⅱ型膠原、蛋白多糖和糖氨聚糖等mRNA的表示出;并且在一定水平內(nèi)靜水壓越高,軟骨細(xì)胞表型越穩(wěn)定[3,4].周期性力學(xué)刺激能促進(jìn)基質(zhì)合成,而持續(xù)性靜壓力則使基質(zhì)合成減少[14].Kian[15]對體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞施加24h周期性的牽張力,發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原表示出上調(diào),同時(shí)作為其受體的整合素1與之同步上調(diào),而整合素5則只要較小的變化.馬軍利等[16]研究發(fā)現(xiàn)一定大小和適宜時(shí)間的靜壓力能促進(jìn)整合素2的表示出,持續(xù)時(shí)間較長、較大的靜壓力則抑制軟骨整合素2的表示出.這些研究牽涉到力學(xué)刺激的大小和作用時(shí)間等參數(shù),但是沒有深切進(jìn)入研究力學(xué)刺激頻率對軟骨細(xì)胞代謝和基因表示出的影響.研究力學(xué)方式方法對骨關(guān)節(jié)炎治療的機(jī)制,必須同時(shí)說明力學(xué)大小和刺激頻率對軟骨細(xì)胞的影響機(jī)制,二者缺一不可.本研究在前期持續(xù)性壓力對軟骨細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用同樣加壓力度、不同頻率的周期性壓力刺激軟骨細(xì)胞,研究不同的刺激頻率對軟骨細(xì)胞增殖以及整合素表示出的影響.結(jié)果顯示:施加172kPa,刺激頻率分別0.2Hz、0.5Hz、1Hz、2Hz、5Hz的周期性壓力,均能增加軟骨細(xì)胞的增殖作用和整合素11的含量.華而不實(shí)頻率為2Hz的周期性壓力作用最強(qiáng).講明力學(xué)刺激能夠通過上調(diào)整合素11,引起基質(zhì)成分的變化,進(jìn)一步能夠上調(diào)軟骨細(xì)胞的增殖作用.但并非頻率越高作用越強(qiáng).本實(shí)驗(yàn)中以2Hz頻率的周期性壓力作用最強(qiáng).這對揭示不同頻率的力學(xué)方式方法對骨關(guān)節(jié)炎治療效果的機(jī)制具有重要意義,并且在臨床治療骨關(guān)節(jié)炎時(shí),對采取何種推拿手法,使用多大的力度和頻率進(jìn)行力學(xué)方式方法治療具有指導(dǎo)意義.但是哪種頻率和多大的力度組合能得到最佳治療效果,還有這種組合的力學(xué)刺激在力學(xué)信號通路方面的研究尚未說明,這將成為今后研究的重點(diǎn)和趨勢.以下為參考文獻(xiàn):[1]潘化平,馮慧,曹月龍.手法治療結(jié)合運(yùn)動療法治療膝骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥雜志,2018,12:2934-2938.[2]張延輝,高春陽,李少華.骨性關(guān)節(jié)炎患者退變軟骨及滑膜組織中細(xì)胞因子的表示出[J].中國組織工程研究,2020,17(37):6671-6675.[3]黃正,黃好,傅文彧,等.不同類型靜水壓對兔軟骨細(xì)胞表型的影響[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志,2007,15(2):29-33.[4]黃正,傅文彧,馮偉,等.循環(huán)靜水壓力對維持兔軟骨細(xì)胞表型的影響[J].中國骨傷,2007,20(3):180-183.[5]朱鴻飛,劉益杰,褚立希.力學(xué)刺激對軟骨細(xì)胞整合素亞單位的調(diào)控[J].中國骨傷,2018,24(3):266-268.[6]劉益杰,馮偉,楊松濱.不同循環(huán)靜壓力對兔軟骨細(xì)胞整合素11的影響[J].上海中醫(yī)藥雜志,2020,46(7):13-15.[7]MallenCD,PeatG,PorcheretM.Osteoarthritis[J].BritishJournalofGeneralPractice,2008,58:649.[8]ArcherCW,Francis-WestP.Thechondrocyte[J].IntBio-chemCellBiol,2003,35(4):401-404.[9]Millward-SadlerSJ,WrightMO,LeeH,etal.Integrin-regulatedsecretionofinterleukin4,novelpathwayofmecha-notransductioninhumanarticularchondrocyte[J].CellBiol,1999,145(5):483.[10]BrakebuschC,BouvardD,StanchiF,etal.Integrinsinin-vasivegrowth[J].ClinInvest,2002,109(8):999-1006.[11]ShakibaeiM,CsakiC,MobasheriA.Diverserolesofinte-grinreceptorsinarticularcartilage[J].AdvAnatEmbryolCellBiol,2008,197:1-60.[12]ShewchukLJ,BryanS,UlanovaM,etal.Integrinbeta3pre-ventsapoptosisofHL1cardiomyocytesunderconditionsofoxidativestress[J].CanPhysiolPha