酶工程制藥二演示文稿

酶工程制藥二演示文稿第一頁，共四十九頁。二、模擬酶的理論基礎(chǔ)1.模擬酶的酶學(xué)基礎(chǔ)Pauling穩(wěn)定過渡態(tài)理論：酶先與底物結(jié)合，進(jìn)而選擇性地穩(wěn)定某一特定反應(yīng)的過渡態(tài)（TS），降低反應(yīng)活化能，從而加快反應(yīng)速度。模擬酶要和酶一樣，能夠在結(jié)合底物過程中，通過底物的定向化、鍵的扭曲及變形來降低反應(yīng)的活化能。第二頁，共四十九頁。第三頁，共四十九頁。第四頁，共四十九頁。2.主-客體化學(xué)和超分子化學(xué)主-客體化學(xué)的基本意義來源于酶和底物的相互作用，體現(xiàn)為主體和客體在結(jié)合部位的客間及電子排列的互補(bǔ)。超分子的形成源于底受和受體的結(jié)合，這種結(jié)合基于非共價(jià)鍵相互作用，超分子兼具分子識別、催化和選擇性輸出的功能。主-客體化學(xué)和超分子化學(xué)已經(jīng)成為酶人工模擬的重要理論基礎(chǔ)，是人工模擬酶研究的重要理論武器。第五頁，共四十九頁。三、模擬酶的分類根據(jù)Kirby分類法，模擬酶可分為：單純酶模型：以化學(xué)方法通過天然酶活性的模擬來重建和改造酶活性。機(jī)制酶模型：通過對酶作用機(jī)制諸如識別、結(jié)合和過渡態(tài)穩(wěn)定化的認(rèn)識，來指導(dǎo)酶模型的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)。單純合成的酶樣化合物：一些化學(xué)合成的具有酶樣催化活性的簡單分子。第六頁，共四十九頁。按照模擬酶的屬性，可分為：主-客體酶（環(huán)糊精、冠醚、穴醚、雜環(huán)大環(huán)化合物和卟啉類等）膠束酶肽酶半合成酶分子印跡酶第七頁，共四十九頁。1.主-客體酶模型優(yōu)良的模擬酶—環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）。能提供一個(gè)疏水的結(jié)合部位并能與一些無機(jī)和有機(jī)分子形成包結(jié)絡(luò)合物，以此影響和催化一些反應(yīng)。由幾個(gè)D-(+)-吡喃葡萄糖殘基通過α-1，4糖苷鍵連接而成。每個(gè)葡萄糖殘基呈現(xiàn)椅式構(gòu)象，整個(gè)分子類似環(huán)柱形分子，由于環(huán)糊精分子空穴邊緣有許多羥基，能溶于水，空穴內(nèi)基本是疏水的。環(huán)糊精催化的特點(diǎn)是：參與反應(yīng)的底物分子先被環(huán)糊精分子包接，再于其發(fā)生反應(yīng)，與酶促反應(yīng)十分相似，已模擬了轉(zhuǎn)氨酶、核糖核酸酶、碳酸苷酶等。除了環(huán)糊精等天然存在的宿主酶模型外，人們還合成了冠醚、穴醚、環(huán)番、環(huán)芳烴等大環(huán)多齒配體來構(gòu)建酶模型。第八頁，共四十九頁。第九頁，共四十九頁。2.膠束模擬酶膠束在水溶液中提供了疏水微環(huán)境，可以對底物束縛，如果再在膠束上共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合了催化基團(tuán)和一些輔酶后，就有可能提供“活性中心”部位，使膠束成為具有酶活力或部分酶活力的膠束模擬酸。目前比較重要的膠束酶模型有：模擬水解酶的膠束酶模型輔酶的膠束酶模型金屬膠束酶模型第十頁，共四十九頁。3.肽酶肽酶就是模擬天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。4.半合成酶以天然酶為母體，用化學(xué)方法或基因工程方法引進(jìn)適當(dāng)?shù)幕钚圆课换虼呋鶊F(tuán)，從而形成一種新的人工酶。第十一頁，共四十九頁。5.印跡酶分子印跡：制備對某一特定分子具有選擇性的聚合物的過程。該特定分子稱為印跡分子或模板。（1）分子印跡的原理分子印跡的過程：1、選定印跡分子和功能單位，讓它們之間發(fā)生互補(bǔ)作用，形成印跡分子功能單位復(fù)合物。2、用交聯(lián)劑在印跡分子功能單位復(fù)合物周圍發(fā)生聚合反應(yīng)，形成交聯(lián)的聚合物。3、從聚合物中除去印跡分子，得到對印跡分子具有選擇性的聚合物。第十二頁，共四十九頁。第十三頁，共四十九頁。第十四頁，共四十九頁。（2）印跡分子與單體相互作用的類型印跡方法：共價(jià)分子印跡和非共價(jià)分子印跡。非共價(jià)分子印跡：首先是印跡分子與功能單位相混合，二者以非共價(jià)鍵發(fā)生反應(yīng)，然后功能單位與交聯(lián)劑發(fā)生共聚合，形成高交聯(lián)的剛性聚合物，最后使印跡分子從聚合物上脫離，并留下一個(gè)在形狀和功能基團(tuán)位置上與印跡分子相互補(bǔ)的識別部位。共價(jià)分子印跡：印跡分子與功能基團(tuán)形成共價(jià)鍵，在與交聯(lián)劑發(fā)生共聚合后，用化學(xué)方法將印跡分子從這個(gè)高度交聯(lián)的聚合物上除去。第十五頁，共四十九頁。（3）分子印跡酶通過分子印跡技術(shù)可以產(chǎn)生類似于酶的活性中心的空腔，對底物產(chǎn)生有效的結(jié)合作用，利用此技術(shù)可以在結(jié)合部位的空腔內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生催化基團(tuán)，并與底物定向排列。應(yīng)用范圍：分子印跡聚合物可作為剪裁分離物質(zhì)的材料；在酶技術(shù)和有機(jī)合成中，可作為模擬抗體、模擬酶或具有催化活性的聚合物；在生物傳感器的構(gòu)建中作為傳感器。第十六頁，共四十九頁。制備具有酶活性的分子印跡酶，要選擇合適的印跡分子，目前所選擇的印跡分子主要有底物、底物類似物、酶抑制劑、過渡態(tài)類似物和產(chǎn)物等。催化活性基團(tuán)的引入：將催化基團(tuán)定位在印跡空腔的合適位置對印跡酶發(fā)揮催化效率相當(dāng)重要。通常引入催化基團(tuán)的方法為誘導(dǎo)法，即通過相反電荷等相互作用引入互補(bǔ)基團(tuán)。第十七頁，共四十九頁。（4）生物印跡酶生物印跡是分子印跡的一種形式，它以天然的生物材料，如蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)為骨架，在其上進(jìn)行分子印跡而產(chǎn)生對印跡分子具有特異性識別空腔的過程。用這種方法可以制備生物印跡酶。以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)制備生物印跡酶的主要過程為：①使蛋白質(zhì)部分變性；②加入印跡分子，使之與部分變性的蛋白質(zhì)充分結(jié)合；③用交聯(lián)劑交聯(lián)印跡的蛋白質(zhì)；④透析等方法除去印跡分子。第十八頁，共四十九頁。第五節(jié)酶的化學(xué)修飾一、目的和意義天然酶的缺陷：易于變性失活（酸、堿、有機(jī)溶劑、熱）；容易受產(chǎn)物和抑制劑的抑制；工業(yè)反應(yīng)要求的酸度和溫度并不總是在酶反應(yīng)的最適酸度和溫度范圍內(nèi)；底物不溶于水，或酶的米式常數(shù)過高；酶做為藥物在體內(nèi)的半衰期較短等因素限制了酶制劑的應(yīng)用。酶的化學(xué)修飾：對酶在分子水平上用化學(xué)方法進(jìn)行改造，即在體外將酶分子通過人工方法與一些化學(xué)基團(tuán)，特別是具有生物相容性的大分子進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶分子的酶學(xué)性質(zhì)的技術(shù)。目的：提高酶的穩(wěn)定性、降低或消除酶分子的免疫原性（醫(yī)藥）。意義：擴(kuò)大了酶制劑的應(yīng)用范圍，同時(shí)化學(xué)修飾法也是研究酶的活性中心性質(zhì)的重要手段。第十九頁，共四十九頁。2、常用化學(xué)修飾劑要求：較大相對分子量；良好的生物相容性和水容性；分子表面有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)；修飾后酶的半衰期較長。常用修飾劑：糖及糖的衍生物，右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯，糖肽，葡聚糖凝膠，聚乳；高分子多聚物，聚乙二醇，聚乙烯醇；生物大分子，肝素，血漿蛋白質(zhì)，聚氨基酸；雙功能試劑，戊二醛，二胺；其他，固定化酶載體，糖基化試劑，甲基化試劑，乙基化試劑和小分子有機(jī)化合物。第二十頁，共四十九頁。3、修飾方法（1）修飾酶的功能基團(tuán)，酶分子中可解離的基團(tuán)如氨基、羥基、羧基、巰基等都可以修飾。如脫氨基可消除酶分子表面氨基酸的電荷；通過碳二亞胺反應(yīng)，可以改變側(cè)鏈羧基的性質(zhì)；通過酰化反應(yīng)可改變側(cè)鏈羥基的性質(zhì)。（2）酶分子內(nèi)或分子間進(jìn)行交聯(lián)，應(yīng)用某些雙功能試劑可將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內(nèi)部不同肽鏈部分進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。（3）修飾酶的輔因子，可將輔因子共價(jià)結(jié)合在酶分子上，或引入新的或修飾過的具有強(qiáng)反應(yīng)性的輔因子。（4）酶與高分子化合物結(jié)合，蛋白質(zhì)或多糖結(jié)合后可提高穩(wěn)定性。第二十一頁，共四十九頁。4、修飾酶的特性穩(wěn)定性提高、抗各類失活因子的能力提高、抗原性消除、體內(nèi)半衰期延長、最適酸度改變、酶學(xué)性質(zhì)改變，對組織分布能力改變。5、前景酶分子經(jīng)過化學(xué)修飾后，并不是所有的缺點(diǎn)都可以克服了，并且修飾的結(jié)果難以預(yù)測，今后，應(yīng)選用更多的、合適的修飾方法，如使用基因工程法、蛋白質(zhì)工程法、人工模擬法和某些物理修飾法等，使酶的性質(zhì)進(jìn)一步改善。第二十二頁，共四十九頁。第六節(jié)酶工程研究的進(jìn)展一、有機(jī)相的酶反應(yīng)20世紀(jì)80年代中期，A.M.Klibanov等人打破傳統(tǒng)酶學(xué)思想的束縛，將酶引入到非水介質(zhì)中進(jìn)行催化反應(yīng)，開辟了非水酶學(xué)（nonaqueousenzymology）這一新的研究領(lǐng)域，極大地拓寬了酶的應(yīng)用范圍。非水酶學(xué)的提出，為酶在醫(yī)藥、精細(xì)化工、材料科學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用開辟了廣闊的前景。第二十三頁，共四十九頁。有機(jī)相的酶反應(yīng)1、有機(jī)相酶反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)增加疏水性底物或產(chǎn)物的溶解度；熱力學(xué)平衡向合成方向移動；可抑制有水參與的副反應(yīng)；酶不溶于有機(jī)溶劑，易于回收在利用；容易從低沸點(diǎn)的溶劑中分離純化產(chǎn)物；酶的熱穩(wěn)定性提高，酸度適用范圍擴(kuò)大；無微生物污染；能測定某些在水介質(zhì)中不能測定的常數(shù)；固定化酶方法簡單，可以只沉淀在載體表面。第二十四頁，共四十九頁。2、有機(jī)相酶反應(yīng)的溶劑體系水-水溶性溶劑均相體系；水-水不溶性溶劑兩相體系；膠束與反相膠束體系，單相有機(jī)溶劑體系。第二十五頁，共四十九頁。3.水和溶劑對有機(jī)溶劑中酶的影響酶活力疏水性越強(qiáng)的溶劑，其中酶所要求的水量越少；親水性強(qiáng)的溶劑應(yīng)加入更多的水以維持酶活力。酶選擇性取決于酶分子的結(jié)構(gòu)，會因酶所處的溶劑不同而發(fā)生巨大變化。酶的穩(wěn)定性有機(jī)溶劑中的水含量對溶劑中酶的穩(wěn)定性影響很大；有機(jī)溶劑中酶的熱穩(wěn)定性隨系統(tǒng)水含量增加而下降。第二十六頁，共四十九頁。4.有機(jī)相的酶工程在有機(jī)相中，天然酶容易變性而失活、分散性差、容易聚結(jié)成團(tuán)。因此，酶在有機(jī)相中的穩(wěn)定化研究具有重要的意義。固定化酶不僅使酶在有機(jī)相中易于分散，提高擴(kuò)散效果，而且能增加其穩(wěn)定性，還可以調(diào)節(jié)和控制酶的活性與選擇性，有利于酶的回收和連續(xù)化生產(chǎn)。酶的化學(xué)修飾和表面活性劑包埋可以增加酶表面的疏沙發(fā)一，改善酶在有機(jī)相中的脂溶性和穩(wěn)定性，提高酶的催化效率。第二十七頁，共四十九頁。二、核酶和脫氧核酶具有催化活性的RNA，即核酶(ribozyme)。根據(jù)其催化的反應(yīng)可分為兩大類：剪切型核酶催化自身或異體RNA的切割，相當(dāng)于內(nèi)切核酸酶，主要包括錘頭型核酶、發(fā)夾型核酶、丁型肝炎病毒核酶以及蛋白質(zhì)—RNA復(fù)合酶（RNaseP）。剪接型核酶主要包括組Ⅰ內(nèi)含子和組Ⅱ內(nèi)含子，可實(shí)現(xiàn)mRNA前體自我拼接，具有內(nèi)切核酶酶和連接酶兩種活性。第二十八頁，共四十九頁。切割RNA的DNA分子，稱之為脫氧核酶。大多數(shù)脫氧核酶的催化需要Mg2+等二價(jià)金屬離子作為輔助因子。這些離子的作用是：中和DNA單鏈上的負(fù)電荷，從而增加單鏈DNA的剛性；利用金屬螯合作用發(fā)揮空間誘導(dǎo)效應(yīng)；產(chǎn)生H+，誘導(dǎo)并參與體系的電子或質(zhì)子傳遞，催化體系發(fā)生氧化還原反應(yīng)。第二十九頁，共四十九頁。三、抗體酶利用抗體能與抗原特異性結(jié)合的原理，可用過渡態(tài)類似物作為半抗原來誘發(fā)抗體，這樣產(chǎn)生的抗體便能特異地識別反應(yīng)過程中真正的過渡態(tài)分子，從而降低反應(yīng)的活化能，達(dá)到催化反應(yīng)的目的，這種抗體便稱為催化抗體。催化抗體是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物，本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性，因此也叫抗體酶?？贵w酶與天然酶相比，最大優(yōu)點(diǎn)是：種類繁多，不但能催化一些天然酶能催化的反應(yīng)，還能催化一些天然酶不能催化的反應(yīng)。第三十頁，共四十九頁。抗體酶制備方法（1）穩(wěn)定過渡態(tài)法：用類似于反應(yīng)過渡態(tài)的小分子作為半抗原，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體而獲得。（2）抗體與半抗原互補(bǔ)法：利用抗體-半抗原互補(bǔ)性產(chǎn)生抗體酶，通過半抗原的優(yōu)化設(shè)計(jì)使之正確模仿過渡態(tài)的幾何結(jié)構(gòu)及所有的反應(yīng)鍵，從而產(chǎn)生高活力的抗體酶。（3）熵阱法：利用抗體結(jié)合能克服反應(yīng)熵壘來設(shè)計(jì)半抗原。第三十一頁，共四十九頁。利用過渡態(tài)類似物制備抗體酶第三十二頁，共四十九頁。（4）多底物類似法：將酶催化反應(yīng)的輔因子引入到抗體結(jié)合部位，產(chǎn)生既有輔因子結(jié)合部位，又有底物結(jié)合部位的抗體（5）抗體結(jié)合部位修飾法：將抗體的結(jié)合部位引入催化基團(tuán)（6）抗體庫法：用基因克隆技術(shù)將全套抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因克隆出來，重組到原核表達(dá)載體，通過大腸桿菌直接表達(dá)有功能的抗體分子片段，從中篩選特異性的可變區(qū)基因。第三十三頁，共四十九頁。對于任何分子，幾乎都可以通過免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，而且專一性很強(qiáng)，抗體的這種多樣性標(biāo)志著抗體酶的應(yīng)用潛力是巨大的。第三十四頁，共四十九頁。四、基因工程酶的構(gòu)建1、酶基因的克隆和表達(dá)重組DNA技術(shù)克隆各種天然酶的基因，在微生物中表達(dá)，篩選出高產(chǎn)菌株，可以通過發(fā)酵大量生產(chǎn)所需要的酶。2、酶基因的遺傳修飾人為地將酶基因中個(gè)別核苷酸加以修飾或更換，從而改變酶蛋白分子中某個(gè)或幾個(gè)氨基酸，不僅改變酶的結(jié)構(gòu)，而且改變拜的催化活力，專一性及穩(wěn)定性。第三十五頁，共四十九頁。第七節(jié)酶工程產(chǎn)品制造實(shí)例酶工程具有技術(shù)先進(jìn)、廠房設(shè)備投盜小、工藝簡單、能耗量低、產(chǎn)品收率高、效率高、效益大、污染輕等優(yōu)點(diǎn)。

以往采用化學(xué)合成、微生物發(fā)酵及生物材料提取等傳統(tǒng)技術(shù)生產(chǎn)的藥品，都可以通過酶工程生產(chǎn)，甚至可以獲得傳統(tǒng)技術(shù)不可能得到的昂貴藥品。第三十六頁，共四十九頁。一、固定化細(xì)胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸青霉素G經(jīng)青霉素?；缸饔?，水解除去側(cè)鏈后的產(chǎn)物稱為6-氨基青霉烷酸，也稱無側(cè)鏈青霉素。6-氨基青霉烷酸是生產(chǎn)半合成青霉素的最基本原料。1、工藝路線（1）大腸桿菌的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基為普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為蛋白胨、氯化鈉、苯乙酸、自來水。用氫氧化鈉調(diào)酸度為7.0，在55。16kP下滅菌30分后備用。在250毫升搖瓶中加入發(fā)酵液培養(yǎng)液30毫升，將斜面接種后培養(yǎng)18-30小時(shí)的大腸桿菌D816（產(chǎn)青霉素?；福?5毫升無菌水制成菌細(xì)胞懸液，取1毫升懸浮液接種至裝有30毫升發(fā)酵液培養(yǎng)基的搖瓶中，在搖床上28℃，170轉(zhuǎn)每分振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，如此依次擴(kuò)大培養(yǎng)，直至1000-2000升規(guī)模通氣攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后用高速管式離心機(jī)收集菌體，備用。第三十七頁，共四十九頁。（2）大腸桿菌固定化取濕菌體100公斤，置于40度反應(yīng)罐中，在攪拌下加入50升10%戊二醛5升，在轉(zhuǎn)移至搪瓷盤中，使之成為3-5厘米厚的液層，室溫放置2小時(shí)，再轉(zhuǎn)移至4度冷庫過夜，待形成固體凝膠后，通過粉碎和過篩，使其成為直徑為2毫米左右的顆粒狀固定化大腸桿菌細(xì)胞，用蒸餾水以酸度7.5和0.3摩爾每升磷酸緩沖液先后充分洗滌，抽干，備用。（3）固定化大腸桿菌反應(yīng)堆制備將上述充分洗滌后的固定化大腸桿菌細(xì)胞裝填于帶保溫夾套的填充式反應(yīng)器中，即成為固定化大腸桿菌反應(yīng)堆，反應(yīng)器規(guī)格為直徑70*160厘米。第三十八頁，共四十九頁。（4）轉(zhuǎn)化反應(yīng)取20公斤青霉素G鉀鹽，加入到1000升配料罐中，用0.03摩爾每升、pH7.5的磷酸緩沖液溶解并使青霉素G鉀鹽濃度為3%，用2摩爾每升氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.5-7.8，然后將反應(yīng)器及pH調(diào)節(jié)罐中反應(yīng)液溫度升到40度，維持反應(yīng)體系的酸度在7.5-7.8范圍內(nèi)，以70每分70升流速使青霉素G鉀鹽溶液通過固定化大腸桿菌反應(yīng)堆進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)化，直至轉(zhuǎn)化液酸度不變?yōu)橹埂Ｑh(huán)時(shí)間一般為3-4小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，放出轉(zhuǎn)化也8，再進(jìn)入下一批反應(yīng)。第三十九頁，共四十九頁。（5）6-氨基青霉烷酸的提取

上述轉(zhuǎn)化液經(jīng)過濾澄清后，濾液用薄膜濃縮器減壓濃縮至100升左右，冷卻至室溫后，于250升攪拌罐中加50升醋酸丁脂充分?jǐn)嚢杼崛?0-15分，取下層水相，加1%克每毫升活性炭于70度攪拌脫色30分，濾除活性炭，濾液用6摩爾每升鹽酸調(diào)酸度至4左右，5度放置結(jié)晶過夜，次日濾取結(jié)晶，用少量冷水洗滌，抽干，115℃烘2-3小時(shí)得成品6-氨基青霉烷酸，收率為70-80%。第四十頁，共四十九頁。二、固定化酶法生產(chǎn)5’—復(fù)合單核苷酸5'—復(fù)合單核苷酸可用于治療白血球下降、血小板減少以及肝功能失調(diào)等疾病。核糖核酸經(jīng)磷酸二脂酶作用，可分解為腺苷、胞苷、尿苷、鳥苷等一磷酸化合物，該磷酸二脂酶存在于桔青霉細(xì)胞、谷氨酸發(fā)酵菌細(xì)胞、麥芽根等生物材料中，本法以麥芽根為材料制備磷酸酶。第四十一頁，共四十九頁。工藝路線：1、磷酸二脂酶的制備取干麥芽根，加9-10倍體積的水，用2摩爾每升的鹽酸調(diào)酸度至5.2，于30度條件下浸泡15-20小時(shí)，然后加壓去渣，浸出液過濾，濾液冷卻至5度，加入2.5倍體積的5度95%冷工業(yè)酒精，5度靜置2-3小時(shí)后，吸去上層清夜，回收乙醇，下層離心收集沉淀，用少量丙酮以乙醚先后洗滌2-3次，真空干燥，粉碎得到磷酸二脂酶，備用。第四十二頁，共四十九頁。2、固定化磷酸二脂酶的制備取上述磷酸二脂酶200克，用1.5%硫酸銨溶液溶解，過濾得到酶液。另取濕ABXE-纖維素40公斤，加入0-5度蒸餾水至80升，攪拌下先后加入1摩爾每升鹽酸和5%亞硝酸鈉溶液各10升，攪拌均勻，于0-5度下反應(yīng)，150分，抽濾，濾餅迅速用預(yù)冷的0.05摩爾每升鹽酸和蒸餾水各洗3次，抽干后，將濾餅投入上述磷酸二脂酶溶液中，攪拌均勻后用1摩爾每升碳酸鈉溶液調(diào)pH8.0，攪拌反應(yīng)30分，用冷水洗3-4次，抽干，得到固定化磷酸二脂酶，備用。第四十三頁，共四十九頁。3、轉(zhuǎn)化反應(yīng)取2公斤核酸，緩慢假如預(yù)熱至60-70度的360升、摩爾每升氯化鋅溶液中，用摩爾每升氫氧化鈉溶液調(diào)至，濾除沉淀，將清液升溫至70度，加入上述濕的固定化磷酸二脂酶40公斤，，于67度維持，攪拌反應(yīng)1-2小時(shí)，根據(jù)增色效應(yīng)，用紫外吸收法判斷轉(zhuǎn)化平衡點(diǎn)，轉(zhuǎn)化完成后，濾出轉(zhuǎn)化液，用于分離5’—單核苷酸，固定化酶再繼續(xù)用于下一批轉(zhuǎn)化反應(yīng)。第四十四頁，共四十九頁。4、5’—復(fù)合單核苷酸的分離純化將上述轉(zhuǎn)化液用6摩爾每升的鹽酸調(diào)酸度至3，濾除沉淀，，濾液用6摩爾每升氫氧化鈉調(diào)酸度至7，進(jìn)入已處理好的氯-型陰離子交換樹脂柱，流速為2-2.5升每分，吸附后，用250-300升去離子水洗滌柱床，然后用3%氯化鈉溶液以1-1.2升每分流速洗脫，當(dāng)流出液pH達(dá)到7時(shí)開始部分收集，直至洗脫液中不含核苷酸