第四章 中藥制劑的含量測定

第四章

中藥制劑的含量測定藥物分析教研室（AnalysisofChinesePreparation）112掌握樣品的處理、分離和凈化方法；滴定分析法、可見-紫外分光光度法和HPLC法的含量計算方法。3了解常用定量分析方法學習目的：熟悉含量測定的目的與意義以及含量測定方法的效能指標2第一節(jié)含量測定的目的與意義

中藥制劑質(zhì)量優(yōu)劣的標準鑒別檢查含量測定中藥制劑的鑒別是研究某種原料藥或成分的存在與否，從而判定藥物的真?zhèn)沃兴幹苿┖繙y定是研究某種成分的含量高低是否符合規(guī)定來判定藥物的優(yōu)劣，是質(zhì)量控制中的一項重要指標。3

通過測定制劑中有效成分、毒性成分或某些指標性成分的含量來衡量其制劑工藝的穩(wěn)定性和中藥材的質(zhì)量優(yōu)劣，以保證中藥制劑的質(zhì)量，達到臨床用藥安全、有效和中藥制劑進入國際市場的需要。

中藥制劑含量測定的意義4中藥制劑含量測定的特點含量測定內(nèi)容中藥制劑化學藥品對象不同組成及成分復(fù)雜成分單一供試品溶液制備方法繁瑣，大多需要凈化分離方法簡單成分明確待測成分確定先根據(jù)中醫(yī)藥理論選擇藥味，再綜合選擇待測成分一般選擇主要成分中藥制劑與化學藥品含量測定區(qū)別5§1樣品的處理樣品處理的主要作用釋放被測組分，制成穩(wěn)定試樣除去雜質(zhì)，純化濃縮試樣形式符合測定的要求樣品處理的主要步驟1.樣品的粉碎2.樣品的提取3.樣品的分離純化6§1樣品的處理樣品的粉碎目的——1.取樣均勻2.提取完全粉碎設(shè)備——粉碎機、研缽、勻漿機※粒度大小合適

樣品粉末的分級（過篩）※防止污染或損失

儀器設(shè)備潔凈

粉塵和較大顆粒的損失。7§1樣品的處理樣品的提取

關(guān)鍵——提取完全溶劑的選擇水、酸水、堿水親水性的有機溶劑：乙醇、甲醇、丙酮親脂性的有機溶劑：石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷

8常見的提取方法：

萃取法

浸漬法回流提取法連續(xù)回流提取法超聲提取法

水蒸氣蒸餾法超臨界流體提取法

微波輔助萃取法§1樣品的處理樣品的提取

9優(yōu)缺點及適用范圍：優(yōu)點：操作簡單，適于熱不穩(wěn)定的樣品，且提取雜質(zhì)少缺點：費時（12-24h）費溶劑（10-50倍）§1樣品的處理樣品的提?。ㄒ唬├浣ú僮鳎簶悠贰芊Q定→置容器內(nèi)→精密加入溶劑→稱定重量→浸泡（12~24h）→稱重→補足重量→測定測定方法：全部測定法：過濾→濾液→蒸干→定容→測定（殘渣需洗滌完全）部分測定法：過濾→濾液→取若干體積測定（不適宜揮發(fā)性較大的溶劑）10采用回流裝置，用單一溶劑或混合溶劑于水浴上加熱提取優(yōu)缺點及適用范圍：提取效率高，提取時間短，為0.5～2小時；提取雜質(zhì)較多，不適用于熱不穩(wěn)定或具有揮發(fā)性的成分§1樣品的處理樣品的提取

（二）回流提取法（三）連續(xù)回流提取法萬應(yīng)膠囊（黃連等）中鹽酸小檗堿測定+HCl-70%乙醇溶液，加熱回流1h保和丸（陳皮等）中橙皮甙測定+甲醇，加熱回流至提取液無色為止用索氏提取裝置，利用遇熱易揮發(fā)溶劑反復(fù)提取優(yōu)缺點及適用范圍：提取效率高，所需溶劑少，提取雜質(zhì)較少，操作簡便；受熱易分解的成分不宜使用。11§1樣品的處理樣品的提?。ㄋ模┏曁崛》ㄔ恚撼暡ǖ闹茏饔脙?yōu)點：操作簡便，提取速度快※超聲波可能引起供試品化學成分的改變※需對超聲頻率、提取時間、提取溶媒等進行考察12§1樣品的處理樣品的提取

（五）超臨界流體提取法（Supercritical-fluidextraction，SFE）超臨界流體——特殊的物質(zhì)狀態(tài)密度-d液體→溶解能力強粘度-氣體→傳質(zhì)快，有利于待測組分的擴散表面張力幾乎為0→浸潤性能好13§1樣品的處理樣品的提取超臨界流體提取法密度受壓力、溫度的影響大→改變對溶質(zhì)的溶解能力加入甲醇、氯仿、苯等改變極性→提取不同極性的成分優(yōu)點：速度快、萃取效率高、方法準確度高、選擇性較高、節(jié)省溶劑、易于自動化，而且可避免使用易燃，有毒的有機溶劑，能與色譜和光譜等分析儀器直接聯(lián)用。14§1樣品的處理樣品的分離純化（一）沉淀法樣品+沉淀劑雜質(zhì)沉淀→過濾→取濾液測定待測組分沉淀→重量法或溶解后測定蛇膽糖漿口服液含有大量糖，可用無水乙醇回流樣品，冷后過濾，除糖以消除其干擾。

復(fù)方益母草口服液中水蘇堿的含量測定利用雷氏鹽（硫氰酸鉻銨）作沉淀劑，在酸性介質(zhì)中可與大部分有機堿生成難溶于水的配合物與其它雜質(zhì)分離。

15§1樣品的處理樣品的分離純化

（二）蒸餾法適用于具揮發(fā)性的待測組分，如揮發(fā)油、小分子的生物堿、丹皮酚等最常用水蒸氣蒸餾法共水蒸餾法通水蒸氣蒸餾法水上蒸餾法利用鹽析作用，提高蒸餾效果16§1樣品的處理樣品的分離純化（三）液-液萃取法直接萃取法萃取劑的選擇親脂性有機溶劑：如苯、氯仿或乙醚弱親脂性的溶劑：如乙酸乙酯、正丁醇等多次萃取（3-4次）調(diào)整水相酸度，提取有機酸、有機堿利用鹽析作用，提高提取率原理：利用試樣中被測成分與干擾成分在有機溶劑（萃取劑）中的溶解度不同，通過多次萃取達到分離凈化的目的。17§1樣品的處理樣品的分離純化（三）液-液萃取法離子對萃取法※水相酸度的控制※離子對試劑的選擇BH+（水相）+In-(水相)BH+·In-（水相）BH+·In-（有機相）生物堿離子對試劑：酸性染料，如BTB,BCG適合于高度電離的有機酸、堿化合物的萃取18弱極性離子對§1樣品的處理樣品的分離純化（四）色譜法（層析法）分離原理：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜按操作方式：柱色譜、薄層色譜、紙色譜裝柱方法：濕法裝柱、干法裝柱微柱色譜（固相萃取LSE）19§1樣品的處理樣品的分離純化LSE常用凈化劑（填料）硅膠：酸性吸附劑，適用于中性或酸性成分的層析，強烈保留堿性化合物。洗脫順序：極性小→大氧化鋁：帶有堿性，分離一些堿性中草藥成分，不宜用于醛、酮、內(nèi)酯等類型的化合物分離中性、酸性氧化鋁：適用于酸性成分的分離20§1樣品的處理鍵合相硅膠（C18或ODS）:分開脂溶性和水溶性成分操作程序：①柱的活化；②上樣；③清洗；④洗脫洗脫順序：極性大→小大孔樹脂分為極性（丙烯酰胺聚合物）和非極性（苯乙烯和二乙烯苯的共聚物）型※使用前需要用有機溶劑除去雜質(zhì)，有時還需用酸、堿清洗

21§1樣品的處理聚酰胺：與溶質(zhì)形成氫鍵而產(chǎn)生吸附作用，常用含酚、酸、醌類藥物樣品液的凈化分離。硅藻土、纖維素：親水型填料，以水基質(zhì)液作為固定相，與水不混溶的有機溶劑為流動相的分配色譜離子交換樹脂：用于除去樣品中的離子及萃取可離解化合物(弱酸、弱堿藥物)活性炭：非極性吸附劑使用前需先用稀鹽酸洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗凈，于80℃干燥分開水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)，單糖與多糖，氨基酸與多肽22§1樣品的處理樣品的分離純化（五）固相微萃?。⊿PME）

集萃取、濃縮、進樣于一體的樣品前處理新方法23§1樣品的處理樣品的分離純化（六）消化法——測定中藥制劑中的無機元素濕法消化硝酸—高氯酸法：適用于血，尿、組織等生物樣品和含動植物藥制劑的破壞※對含氮雜環(huán)類有機物破壞不夠完全

硝酸—硫酸法：與硫酸形成不溶性硫酸鹽的金屬離子的測定，不宜采有此法。硫酸—硫酸鹽法：常用于含砷或銻的有機樣品的破壞，破壞后得到三價砷或銻。

24§1樣品的處理樣品的分離純化※控制溫度在420℃以下※灰化完全，切勿棄去不易溶灰分※不適用于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等，）有機樣品的破壞。灼燒灰化(+Na2CO3/MgO)供試品灰分干法消化25§2常用定量分析方法

重量分析法：揮發(fā)法、萃取法和沉淀法

一、化學分析法適用于含量較高的成分及無機成分的測定滴定分析法酸堿滴定法沉淀滴定法配位滴定法氧化還原滴定法26§2常用定量分析方法重量分析揮發(fā)法：又叫汽化或干燥法如水分測定及干燥失重測定萃取法：又稱為提取法或抽取法如冰片散中冰片的含量測定沉淀法：如苦參片中苦參總堿的含量測定27§2常用定量分析方法滴定分析酸堿滴定法：測定生物堿、有機酸、內(nèi)酯類

沉淀滴定法銀量法：生物堿的氫鹵酸鹽及有機鹵化物四苯硼鈉法：+生物堿→白色沉淀亞鐵氰化鉀法配位滴定法（EDTA法和硫氰酸銨法）：測定鞣質(zhì)、生物堿及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等礦物類制劑的含量氧化還原滴定法：酚類、糖類及礦物藥中Fe、As等成分的中藥制劑；分為碘量法、高錳酸鉀法和亞硝酸鈉法等28§2常用定量分析方法二、紫外－可見分光光度法290.575光源單色器吸收池檢測器信號處理及顯示§2常用定量分析方法紫外－可見分光光度法紫外分光光度計基本構(gòu)造30§2常用定量分析方法紫外－可見分光光度法（一）單波長分光光度法吸收系數(shù)法（CHP最為常用）

A=ECL（朗伯-比爾定律：物質(zhì)對單色光吸收特性與濃度、液層厚度關(guān)系定律）對照品比較法對照品溶液濃度應(yīng)與供試品濃度接近（100±10％）標準曲線法要求：

選擇被測成分的λmax為測定波長，而共存組分在此波長處基本無吸收，并控制供試液的吸收度讀數(shù)在0.3-0.7之間31§2常用定量分析方法吸收系數(shù)法測定供試品溶液在規(guī)定波長處的吸收度A，根據(jù)A=εcl，若l和吸光系數(shù)ε或

已知，即可求出被測物的濃度。

例:小檗堿溶液在345nm處的為728，現(xiàn)測的某小檗堿溶液在345nm出的吸收度為0.5824，計算該小檗堿溶液的濃度。32§2常用定量分析方法標準曲線法從標準品吸光度-濃度曲線求得樣品溶液的濃度

對照品對照法在一定線性范圍內(nèi)根據(jù)Lambert-Beer定律溶液的濃度和吸光度存在以下關(guān)系33§2常用定量分析方法紫外－可見分光光度法（二）計算分光光度法雙波長分光光度法（等吸收點法、系數(shù)倍率法）三波長法導(dǎo)數(shù)光譜法一般應(yīng)用于供試品溶液中含有2中或2種以上的組分的含量測定。差示光譜法

利用比樣品濃度稍低的標準品作為空白,進行測定及計算的方法.34ａ為干擾組分的吸收光譜ｂ為待測組分的吸收光譜ｃ為混合組分的吸收光譜關(guān)鍵步驟：選擇λ1和λ2的基本條件干擾組分在λ1和λ2處應(yīng)具有相同的吸收度待測組分在這兩個波長處的吸收光度差值應(yīng)足夠大波長(λ1、λ2)雙波長法等吸收點法abc計算分光光度法35分析步驟①選擇雙波長（λ1、λ2）②繪制標準曲線

△Ａ對濃度Ｃ作圖（回歸）樣品測定λ1、λ2，分別測定Ａ1及Ａ2△Ａ應(yīng)用條件：吸收曲線有峰和谷雙波長法等吸收點法abc計算分光光度法36§2常用定量分析方法紫外－可見分光光度法紫外光譜法中對儀器和試劑的要求（1）儀器的校正和檢定：包括波長精度、吸收度的準確性、雜散光等。（2）對溶劑的要求：用1cm石英池盛裝溶劑，以空氣為空白，測定其吸光度，溶劑和吸收池的吸光度在220nm—240nm范圍內(nèi)不得超過0.40；在241nm—250nm范圍內(nèi)不得超過0.20；在251nm—300nm的范圍內(nèi)不得超過0.10；300nm以上不得超過0.05。37§2常用定量分析方法三、薄層掃描法（TLCS）

薄層掃描法是指薄層色譜斑點的色譜掃描，薄層色譜掃描是指固定波長，斑點移動，測定A-t或F-l曲線。根據(jù)薄層掃描的測定方式分為薄層吸收掃描法和薄層熒光掃描法二種方法。38§2常用定量分析方法薄層掃描法（TLCS）1.薄層吸收掃描法

光源：鎢燈和氘燈；

靈敏度：在200-800nm波長范圍內(nèi)選擇合適波長進行測定，其靈敏度可達ng級；

適用范圍：適用于在可見、紫外區(qū)有吸收的物質(zhì)，及通過色譜前或色譜后衍生成上述化合物的樣品組分。39§2常用定量分析方法薄層掃描法（TLCS）

2.薄層熒光掃描法

光源：氖燈或汞燈;

靈敏度：最低可測到10-50pg;

適用范圍：適合于本身具有熒光或經(jīng)過適當處理后可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的測定。40§2常用定量分析方法四、氣相色譜法（GC）

基本原理

氣相色譜法（GC）是將氣化后的試樣由載氣（流動相）帶入色譜柱，根據(jù)各組分在流動相和固定相間作用的不同而分離，并隨載氣依次流出色譜柱，經(jīng)檢測器檢測，利用保留值進行定性，色譜峰面積或峰高進行定量的分析方法。

41§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）

基本原理

氣-固色譜氣-液色譜吸附色譜分配色譜填充柱色譜毛細管柱色譜1.按固定相分3.按柱子粗細分GC分類

2.按分離原理分42§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）基本概念

色譜峰：由電信號強度對時間作圖所繪制的曲線。（正態(tài)分布曲線）

不正常的色譜峰：前延峰、拖尾峰

常用定量參數(shù)：峰高、峰面積

常用定性參數(shù)：峰位

用于衡量柱效：峰寬

43§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）基本概念

基線：在操作條件下，沒有組分流出時的流出曲線，橫軸直線。

保留值

保留時間tR保留體積VR

死時間t0死體積V0

調(diào)整保留時間t`R調(diào)整保留體積V`R

44§2常用定量分析方法45§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）塔板理論塔板理論將色譜柱看作一個分餾塔，待分離組分在分餾塔的塔板間移動，在每一個塔板內(nèi)組分分子在固定相和流動相之間形成平衡，隨著流動相的流動，組分分子不斷從一個塔板移動到下一個塔板，并不斷形成新的平衡。一個色譜柱的塔板數(shù)越多，則其分離效果就越好

46§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）柱效指標理論塔板數(shù)n及理論塔板高度H衡量色譜柱分離效果的參數(shù)：理論塔板數(shù)n。105-106

在一定高度內(nèi)，組分可以在兩項中達到分配平衡，次高度為理論塔板高度。

47§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）柱效指標理論塔板數(shù)n及理論塔板高度H

48§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）柱效指標

指待測峰與其他峰、內(nèi)標峰或特定的雜質(zhì)對照峰之間的分離情況。分離度的計算衡量色譜分離條件優(yōu)劣的參數(shù)49§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）適用范圍揮發(fā)油及其它揮發(fā)性組分：冰片、桉葉素、樟腦、丁香酚、龍腦等。中藥制劑含水量、含醇量系統(tǒng)適用性試驗1.理論塔板數(shù)n＝5.54(tR/W1/2)2

※

不得低于最小理論塔板數(shù)；柱長，柱填充、載體性能等有影響。

50§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）系統(tǒng)適用性試驗2.分離度R=2(tR1-tR2)/(W1+W2)

※R≥1.5（兩峰完全分離）3.重復(fù)性※RSD≤2.0％(n=5)4.拖尾因子

T=W0.05h/2d1(d1峰極大至峰前沿之間的距離)※峰高法定量時1.05≥T≥0.95

51§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）實驗條件的選擇一、固定相的選擇氣-液分配色譜柱固定液的選擇按相似相溶原則選擇按組分性質(zhì)的主要差別選擇

52§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）按相似相溶原則選擇固定液與被測組分極性“相似相溶”非極性組分—選非極性固定液，按沸點順序出柱，低沸點的先出柱中等極性組分—選中等極性固定液，基本按沸點順序出柱強極性組分—選極性固定液按極性順序出柱，極性強的后出柱53§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）按組分性質(zhì)的主要差別選擇組分以沸點差別為主—選非極性固定液按沸點順序出柱、沸點低的先出柱組分的極性差別為主—選極性固定液按極性強弱出柱、極性弱的先出柱例：苯（80.10C），環(huán)己烷（80.70C）選非極性柱——分不開；選中強極性柱——較好分離，環(huán)己烷先出柱54§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）實驗條件的選擇一、固定相的選擇2.氣-固分配色譜柱固定相的選擇吸附劑：活性炭（非極性）硅膠，Al2O3（極性，吸附力強）分子篩：吸附+分子篩高分子多孔微球：GDX有機合成高分子聚合物、吸附+分配機制

55§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）實驗條件的選擇二、柱溫的選擇

沸點℃固定液配比%柱溫℃高（300-400）低1-5200-250200-3005-10150-180100-20010-15平均2/3低高15-2550以下根據(jù)樣品的沸點選擇56§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）實驗條件的選擇三、載氣的選擇柱效、柱壓、靈敏度流速20-80mL/min低流速氮氣*高流速氫氣氦氣熱導(dǎo)檢測器氫氣氦氣氫焰檢測器、電子捕獲檢測器氮氣

57§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）實驗條件的選擇四、其他條件氣化室（進樣口）溫度：不超過沸點50℃高于柱溫30-50℃檢測室溫度：高于柱溫30℃左右進樣量：

氣體0.1-1mL液體0.2-1μL

58§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）實驗條件的選擇五、檢測器熱導(dǎo)檢測器（TCD）氫焰離子化檢測器（FID）氮磷檢測器（NPD）電子捕獲檢測器（ECD）

59§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）定量分析方法峰面積的測量正常峰不對稱峰自動求和（自動積分儀或色譜工作站）：直接給出A，h，W1/2

60§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）定量分析方法

歸一化法外標法校正因子內(nèi)標法標準溶液加入法常用的定量分析方法61§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）定量分析方法定量校正因子

62§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）定量分析方法絕對校正因子

63§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）定量分析方法相對校正因子

64§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）定量分析方法校正因子內(nèi)標法校正因子的計算取內(nèi)標物和待測組分的對照液進樣測定A取含有內(nèi)標物的供試品溶液進樣測定A

65§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）定量分析方法

對內(nèi)標物的基本要求1.內(nèi)標物是原樣品中不含有的組分2.內(nèi)標物的保留時間應(yīng)與待測組分相近，但彼此能完全分離(R≥1.5)3.內(nèi)標物必須是純度合乎要求的純物質(zhì)66§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）定量分析方法

內(nèi)標法的優(yōu)缺點優(yōu)點定量結(jié)果與進樣量的重復(fù)性無關(guān)與其他組分是否出峰無關(guān)用于測定藥物中微量有效成分或雜質(zhì)的含量測定的結(jié)果較為準確缺點操作程序較為麻煩尋找合適的內(nèi)標物有困難67§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）定量分析方法歸一化法前提：試樣中所有組分都產(chǎn)生信號并能檢出色譜峰依據(jù)：組分含量與峰面積成正比

68§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）定量分析方法外標法

以待測組分純品為對照物，與試樣中待測組分的響應(yīng)信號相比較進行定量的方法a工作曲線法b外標一點法c外標兩點法

69§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）定量分析方法外標法

b外標一點法一種濃度對照物對比樣品中待測組分含量前提：截距為0，對照品濃度與待測組分濃度接近

70§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）定量分析方法外標法

c外標兩點法

前提：選取兩點對照品的濃度，需涵蓋待測濃度

外標法特點：

1）不需要校正因子，不需要所有組分出峰

2）結(jié)果受進樣量、進樣重復(fù)性和操作條件影響大→每次進樣量應(yīng)一致，否則產(chǎn)生誤差71§2常用定量分析方法氣相色譜法（GC）定量分析方法標準溶液加入法精密稱量被測組分的對照品，配置成適當濃度的對照品溶液，取一定量，精密加入到供試品溶液中，依據(jù)內(nèi)標法或外標法測定含量，再扣除加入對照品的含量，即得。

72§2常用定量分析方法五、高效液相色譜法（HPLC）特點：高柱效、高靈敏度、高選擇性、分析速度快及應(yīng)用范圍廣適用于測定 揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、分子量大的高分子化合物及離子型化合物，如蛋白質(zhì)、氨基酸、生物堿、甾體、類脂、核酸、維生素及無機鹽類。73§2常用定量分析方法高效液相色譜法（HPLC）基本原理以氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實驗和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法。1.塔板理論2.速率理論

74§2常用定量分析方法項目HPLCLC柱長/cm10-25100-200內(nèi)徑/mm2-1010-25壓力/MP2-200.001-0.1柱效/n/m2*103-5*1032-50進樣量/g10-6-10-21-10分離、分析時間/h0.05-1.01-20裝置自動化手工檢測方法檢測器檢測收集后定性定量HPLC與LC的比較：75§2常用定量分析方法項目HPLCGC進樣方式溶液氣化或裂解流動相液態(tài)氣態(tài)壓力/MP2-200.1-0.5柱溫常溫常溫-300℃分離原理吸附、分配、離子交換、化學鍵合吸附、分配應(yīng)用范圍大部分物質(zhì)易揮發(fā)、熱穩(wěn)定HPLC與GC的比較：76§2常用定量分析方法高效液相色譜法（HPLC）實驗條件的選擇色譜柱的選擇①大多數(shù)藥物可用C18反相（ODS）柱加以分離測定；也可選用正相分配色譜柱（氨基柱、氰基柱）或硅膠吸附色譜柱等；②解離藥物可用離子對色譜、離子抑制色譜或離子交換色譜分離測定；③脂溶性藥物異構(gòu)體的分離測定可采用硅膠吸附色譜柱。根據(jù)被分離物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)、極性和溶解度等因素進行選擇。77§2常用定量分析方法高效液相色譜法（HPLC）實驗條件的選擇流動相的選擇反相鍵合相色譜常用流動相：

流動相常用溶劑適用范圍部分含水溶劑甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)用于分離中等極性、弱極性藥物非水溶劑乙腈-二氯甲烷、甲醇-四氫呋喃等用于分離疏水性物質(zhì)緩沖溶液三乙胺磷酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽溶液用于可溶于水并具可解離特性的化合物78§2常用定量分析方法高效液相色譜法（HPLC）實驗條件的選擇流動相的選擇正相鍵合相色譜：①常采用飽和烷烴（如正已烷）中加入一種極性較大的溶劑作為極性調(diào)節(jié)劑（如異丙醚），通過調(diào)節(jié)極性調(diào)節(jié)劑的濃度改變?nèi)軇姸龋虎诔２捎枚陨系幕旌先軇┫到y(tǒng)。

79§2常用定量分析方法高效液相色譜法（HPLC）實驗條件的選擇洗脫方式等度洗脫：同一分析周期內(nèi)流動相的組成保持恒定，適用于組分數(shù)較少、性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫：在一個分析周期內(nèi)程序控制流動相的組成（如溶劑極性、離子強度和pH值等），適用于分析組分數(shù)多、性質(zhì)相差較大的復(fù)雜混合物樣品，使所有組分在適宜條件下獲得分離。

80§2常用定量分析方法高效液相色譜法（HPLC）實驗條件的選擇檢測器UV或UVD：被測物有紫外吸收，流動相的截止波長小于檢測波長。FD：靈敏度高，熒光物質(zhì)檢測。ELSD：揮發(fā)性低于流動相的組分，糖類、高分子化合物等；不能用含鹽流動相。ECD、RID、CLD等

81檢測器特點最低檢測限適用范圍紫外檢測器（UV或UVD）:①可變波長型②二極管陣列檢測器①檢測有紫外吸收的物質(zhì);②靈敏度較高,噪音低,線性范圍寬,對流速和溫度波動不靈敏,可用于梯度洗脫.10-7-10-12g用于芳烴、稠環(huán)芳烴、芳香氨基酸、核酸、甾體激素、羰基及其化合物等熒光檢測器(FD)①用于能產(chǎn)生熒光或其衍生物能發(fā)熒光的物質(zhì);②靈敏度高于紫外檢測器1×10-10g/ml用于氨基酸、多環(huán)芳烴、維生素、甾體化合化物及酶等蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)①屬通用型檢測器,理論上可用于揮發(fā)性低于流動相的任何樣品組分;②檢測靈敏度較低,適用于流動相能揮發(fā)的色譜洗脫,不能用含緩沖鹽的流動相用于檢測糖、高分子化合物、高級脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、甘油三酯及甾體等幾十類化合物82電化學檢測器(ECD)用于能氧化、還原的有機物質(zhì)的檢測，尤其適用于痕量組分的分析1×10-12g/ml適用生物胺、酚、羰基化合物、巰基化合物等示差折光檢測器(RID)①通用型檢測器,利用組分與流動相折射率之差進行檢測.②穩(wěn)定性好,操作方便.③靈敏度低,受環(huán)境溫度、流動相組成等波動的影響大,不適合梯度洗脫10-8g/ml尤其適合于糖類的檢測化學發(fā)光檢測器(CLD)①高選擇性、高靈敏度的新型檢測器.②設(shè)備簡單,自身發(fā)光,無需光源,價格便宜Pg級(10-12)用于分析微量脂質(zhì)、核酸、生物胺等83§2常用定量分析方法高效液相色譜法（HPLC）實驗條件的選擇HPLC前處理流動相的處理：①溶劑的純化：色譜純；②流動相脫氣：常用超聲波振蕩脫氣；③過濾：防止不溶物堵塞流路和色譜柱入口處的微孔墊片，采用0.45μm以下微孔濾膜過濾，濾膜分有機溶劑專用和水溶液專用兩種。84

高效液相色譜法（HPLC）實驗條件的選擇HPLC前處理樣品的處理：①待測組分的提?、谌軇┑膿]發(fā)：自然揮散或在氮氣流下吹干，適用于小體積樣品和揮發(fā)性溶劑；減壓蒸發(fā)，適用于熱不穩(wěn)定樣品；冷凍干燥，適用于受熱易分解破壞的樣品。③濾過：樣品溶液進樣前，需用濾膜抽濾或針頭濾器過濾，以除去樣品溶液中的懸浮物或部分大分子雜質(zhì)。

§2常用定量分析方法85§2常用定量分析方法高效液相色譜法（HPLC）HPLC法分類及方法分類一、液固吸附色譜法（LSC）二、液液分配色譜法（LLC）三、化學鍵合相色譜法（BPC）

86§2常用定量分析方法高效液相色譜法（HPLC）一、液固吸附色譜法（LSC）

固定相：硅膠、薄膜型氧化鋁、聚酰胺、高分子多孔小球等。

流動相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、烷烴等。

出柱順序：強極性組分后出柱，弱極性組分先出柱。

87§2常用定量分析方法高效液相色譜法（HPLC）二、液液分配色譜法（LSC）

固定相：載體+固定液（物理或機械涂漬法）內(nèi)壓大、易流失、不實用

正相色譜—固定液極性>流動相極性極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱;適于分離極性組分

反相色譜—固定液極性<流動相極性極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱;適于分離非極性組分

88高效液相色譜法（HPLC）三、化學鍵合相色譜法（分配+吸附）

基本原理：利用化學反應(yīng)將固定液的官能團鍵合在載體表面。

特點：不易流失、熱穩(wěn)定性好、化學性能好、載樣量大、適于梯度洗脫。

§2常用定量分析方法化學鍵合相色譜法分類反相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法離子對色譜法離子抑制色譜法89

高效液相色譜法（HPLC）反相鍵合相色譜法固定相：多采用非極性鍵合相，C18柱（ODS）流動相：極性大的甲醇-水或乙腈-水基礎(chǔ)溶劑+有機調(diào)節(jié)劑（極性調(diào)節(jié)劑）例：水+甲醇，乙腈，THF

流動相極性>固定相極性出柱順序：極性大的組分先出柱極性小的組分后出柱

適用：非極性-中等極性組分

§2常用定量分析方法90

高效液相色譜法（HPLC）正相鍵合相色譜法固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相流動相：底劑（烷烴）+有機極性調(diào)節(jié)劑例：正己烷+氯仿出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱極性大的組分后出柱

適用：氰基鍵合相與硅膠柱選擇性相似（極性稍?。┓蛛x物質(zhì)也相似；氨基鍵合相有較強氫鍵結(jié)合能力，氨基柱作分析糖類的專用色譜柱

§2常用定量分析方法91

高效液相色譜法（HPLC）離子對色譜法（PIC或IPC）直接將離子對試劑加入到流動相中，用以分離離子型或可離子化化合物，分為正相和反相離子對色譜法，重點介紹反相離子對色譜法。

§2常用定量分析方法①基本原理:以C18或C8鍵合相為固定相，用含離子對試劑的有機溶媒-水溶液為流動相，用以分離離子型或可離子化化合物.92

高效液相色譜法（HPLC）離子對色譜法（PIC或IPC）

②適用范圍:適用于有機酸、堿、鹽的分離；用離子交換色譜法無法分離的離子和非離子混合物的分離;在中藥制劑分析廣泛用于生物堿、有機酸的分析。③缺點:離子對試劑價格比較貴。

④分離條件的選擇:離子對試劑的性質(zhì)和濃度、流動相的pH值及流動相中所含有機溶劑的種類與比例等。

§2常用定量分析方法93

高效液相色譜法（HPLC）離子抑制色譜法（ISC）通過向流動相加入少量弱酸（常用醋酸）、弱堿（常用氨水）或緩沖鹽（常用磷酸鹽及醋酸鹽），調(diào)節(jié)流動相的pH值，抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相中的溶解度，改善峰形，達到分離有機弱酸、弱堿的目的，這種技術(shù)稱為離子抑制色譜法（ISC）。特點:該方法簡便、經(jīng)濟實用、分離效果好，在許多場合可替代離子對色譜法，但重復(fù)性較差是其缺點。適用范圍:通常用于反相色譜中，適用3.0≤pKa≤7.0的弱酸、7.0≤pKa≤8.0的弱堿和兩性化合物的分離，以及它們與分子型化合物共存時的分離。

§2常用定量分析方法94高效液相色譜法（HPLC）離子抑制色譜法（ISC）

離子抑制色譜法與離子對色譜法的區(qū)別：①離子抑制色譜法是向流動相中加入抑制劑，調(diào)節(jié)pH值，抑制樣品組分的解離，使其以分子形式存在。而離子對色譜法是加入離子對試劑，并調(diào)節(jié)pH值使樣品組分盡可能呈解離狀態(tài)，使離子對試劑的反離子與樣品離子結(jié)合成中性離子對。②離子抑制色譜僅適用于弱堿、弱堿的分離，不適用于有機強酸、強堿的分離；而離子對色譜法對不同強度的酸、堿均適用。

§2常用定量分析方法95§2常用定量分析方法高效液相色譜法（HPLC）定量分析方法一、外標法（同GC）二、內(nèi)加法

將待測物的純品加入待測樣品溶液中，通過測定該純品加入前后組分峰高或峰面積的變化進行含量測定的方法。

96§2常用定量分析方法高效液相色譜法（HPLC）定量分析方法二、內(nèi)加法該法不需內(nèi)標物，又具有內(nèi)標法的優(yōu)點97§2常用定量分析方法熒光分析法法本身具有熒光或能轉(zhuǎn)化為熒光的物質(zhì)，如胺類、甾體、蛋白質(zhì)、氨基酸和酶等原子吸收分光光度法

呈原子狀態(tài)的金屬和部分非金屬。中藥材中重金屬、毒害元素、微量元素等

98熒光物質(zhì)分子都具有兩個特征光譜：激發(fā)光譜和熒光光譜，是熒光分析中定性與定量的依據(jù)和基本參數(shù)。乙醇溶液中蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜熒光分析法熒光分析法(Fluorime-try)是根據(jù)熒光強度測定物質(zhì)