第二章顯微鏡-2-劉甫

第二章顯微鏡臨床檢驗(yàn)儀器原理、結(jié)構(gòu)及維修劉甫

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院免疫學(xué)教研室顯微鏡特殊光學(xué)顯微鏡電子顯微鏡一、特殊光學(xué)顯微鏡用于某些專門的觀察和研究觀察普通顯微鏡看不到或看不清的物體采用特殊的光學(xué)技術(shù)瑪瑙石化木作者：Thomas

Shearer；城市：美國明尼蘇達(dá)州德盧斯；技術(shù)：偏振光彩虹小斑馬魚作者：Albert

Pan；單位：美國哈佛大學(xué)；技術(shù)：熒光蝸牛齒舌作者：David

Walker；城市：英國西約克郡哈德斯菲爾德；技術(shù)：偏振光成年老鼠的海馬體作者：Neal

Melvin；城市：美國得克薩斯州達(dá)拉斯；技術(shù)：熒光星狀硅藻類作者：Petr

Znachor；單位：捷克巴德杰維契水生生物研究所；技術(shù)：熒光一、特殊光學(xué)顯微鏡特殊光學(xué)顯微鏡暗視場顯微鏡熒光顯微鏡倒置顯微鏡偏光顯微鏡相稱顯微鏡紫外光顯微鏡與普通顯微鏡的區(qū)別是照明方式可以分辨0.004μm的微粒（普通只能分辨0.2μm，≤0.1μm者稱超顯微粒子）只能看到微粒的數(shù)量、位置、輪廓和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，無法觀察微粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)暗視場顯微鏡

Dark-fieldmicroscope用強(qiáng)光照射標(biāo)本，但是不讓強(qiáng)光進(jìn)入物鏡散射光與暗背景之間形成較強(qiáng)的對(duì)比進(jìn)入物鏡的是強(qiáng)光在標(biāo)本上形成的"丁達(dá)爾效應(yīng)"而產(chǎn)生的散射光暗視場顯微鏡—基本原理丁達(dá)爾效應(yīng)（Tyndalleffect）：當(dāng)一束光線透過膠體，從入射光的垂直方向可以觀察到膠體里出現(xiàn)的一條光亮的“通路”，這種現(xiàn)象叫丁達(dá)爾現(xiàn)象，也叫丁達(dá)爾效應(yīng)（Tyndalleffect）、丁澤爾現(xiàn)象、丁澤爾效應(yīng).

暗視場顯微鏡—基本原理粒子>入射光波長很多倍--光的反射如果粒子小于入射光波長--光的散射

這時(shí)觀察到的是光波環(huán)繞微粒而向其四周放射的光，稱為散射光或乳光。丁達(dá)爾效應(yīng)就是光的散射現(xiàn)象對(duì)于真溶液，雖然分子或離子更小，但因散射光的強(qiáng)度隨散射粒子體積的減小而明顯減弱，因此，真溶液對(duì)光的散射作用很微弱。散射光的強(qiáng)度，還隨著微粒濃度增大而增加，因此進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，膠體濃度不要太稀。由于溶液粒子<1nm，膠體粒子40~90nm<可見光波長（400nm～750nm）產(chǎn)生光的散射現(xiàn)象暗視場顯微鏡—基本原理丁達(dá)爾效應(yīng)暗視場顯微鏡—基本原理采用采用特種聚光鏡--側(cè)向照明技術(shù)透明物體采用環(huán)形光闌擋住中間照明不透明物體采用反射光暗視野照明方式同心圓暗場光闌+環(huán)形反射鏡暗視場顯微鏡—照明暗視場顯微鏡—照明熒光顯微鏡，是以紫外線為光源來激發(fā)生物標(biāo)本中的熒光物質(zhì)，觀察到各種顏色的熒光觀察自發(fā)光或受激發(fā)光樣品，或用熒光標(biāo)記物標(biāo)記樣品，研究熒光物質(zhì)在組織和細(xì)胞內(nèi)的分布特點(diǎn)：與暗視場形成對(duì)比，對(duì)比度強(qiáng)可用于觀察活體組織的生理或代謝過程用來分析樣品的化學(xué)組分熒光物質(zhì)標(biāo)記后觀察熒光顯微鏡

fluorescencemicroscope熒光顯微鏡—種類透射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡暗場聚光鏡吸收濾色鏡

落射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡熒光顯微鏡--原理某些物質(zhì)在一定短波長的光（如紫外光）的照射下吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，能在極短的時(shí)間內(nèi)放射出比照射光波長更長的光（如可見光），這種光就稱為熒光。熒光顯微鏡利用特殊的照明裝置發(fā)出激發(fā)光，誘發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，通過物鏡作用在樣品上，再由目鏡觀察到肉眼可見的熒光。吸收濾色鏡暗場聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈箱透射熒光顯微鏡構(gòu)造透射熒光顯微鏡原理落射熒光顯微鏡構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈紫外線保護(hù)罩孔徑光欄（FS）視場光欄（AS）孔徑光闌：決定可以進(jìn)入光學(xué)系統(tǒng)的光束尺寸視場光闌：決定可以觀察和成像的視野范圍落射熒光顯微鏡原理熒光顯微鏡--照明裝置常用高壓水銀燈為光源，光譜峰280~335nm、365~435nm、545~580nm照明方式分透射、落射或組合照明配合專用聚光鏡有明場、暗場、偏光和相襯等照明方式熒光顯微鏡--濾色系統(tǒng)濾色系統(tǒng)由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。

一、激發(fā)濾板根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn)可分為三類激發(fā)濾板1、紫外藍(lán)光激發(fā)濾板：可使300～450nm的光通過。2、紫外藍(lán)光激發(fā)濾板：可使300～450nm的光通過。3、紫藍(lán)光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過。二、壓制濾板的作用是完全阻擋激發(fā)光通過，提供相應(yīng)波長范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對(duì)應(yīng)，可分為三類：1、紫外光壓制濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過。2、紫藍(lán)光壓制濾板：能通過510nm以上波長的光（綠到紅）。3、紫外紫光壓制濾板：能通過460nm以上波長的光（藍(lán)到紅）。熒光顯微鏡--CCD熒光顯微CCD：是與熒光顯微鏡密切相關(guān)的數(shù)碼攝像產(chǎn)品它可以將熒光顯微鏡拍攝的顯微攝影產(chǎn)品通過usb接口傳輸?shù)诫娔X中，便于圖像的采集研究通過熒光顯微鏡CCD我們可以拍攝到比單純使用熒光顯微鏡更好的圖片。熒光顯微鏡CCD可以連接熒光顯微鏡組成顯微成像系統(tǒng)。倒置顯微鏡

Invertedmicroscope物鏡與照明系統(tǒng)顛倒配有長工作距離的聚光鏡物鏡放大倍數(shù)不超過40倍可使用各種培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶，特別適用于對(duì)活體細(xì)胞和組織，流質(zhì)，沉淀物等進(jìn)行顯微研究，常裝有攝影（像）裝置。倒置顯微鏡

Invertedmicroscope補(bǔ)充內(nèi)容光的波粒二象性光到底是什么？……………17世紀(jì)明確形成了兩大對(duì)立學(xué)說牛頓惠更斯微粒說波動(dòng)說由于波動(dòng)說沒有數(shù)學(xué)基礎(chǔ)以及牛頓的威望使得微粒說一直占上風(fēng)19世紀(jì)初證明了波動(dòng)說的正確性這里的光子完全不同于牛頓所說的“微?！?9世紀(jì)末光電效應(yīng)現(xiàn)象使得愛因斯坦在20世紀(jì)初提出了光子說：光具有粒子性

光的微粒說：光是沿直線高速傳播的粒子流。

牛頓支持微粒說。人們都認(rèn)為牛頓是微粒說的代表。牛頓于1675年曾提出：“光是一群難以想象的細(xì)微而迅速運(yùn)動(dòng)的大小不同的粒子”，這些粒子被發(fā)光體“一個(gè)接一個(gè)地發(fā)射出來”。

易解釋：光的直進(jìn)性、影的形成、光的反射和折射等現(xiàn)象。

難解釋：（1）一束光入射到兩種介質(zhì)界面時(shí)，既有反射，又有折射。何種情況發(fā)生反射，何種情況下又發(fā)生折射呢?微粒說在解釋這一點(diǎn)時(shí)遇到了很大的困難。（2）兩束光相遇后，為何仍能沿原方向傳播這一常見的現(xiàn)象，微粒說則完全無能為力了。光的波動(dòng)說：某種振動(dòng)，以波的形式向四周圍傳播。代表人物：是荷蘭的物理學(xué)家惠更斯。易解釋：（1）光的反射、折射、光的反射和折射可以同時(shí)發(fā)生。（2）兩束光相遇后，為何仍能沿原方向傳播這一常見的現(xiàn)象。難解釋：光的直進(jìn)性和影的形成。干涉現(xiàn)象：英國醫(yī)生兼物理學(xué)家托馬斯·楊于1801年進(jìn)行了著名的楊氏干涉實(shí)驗(yàn)。衍射現(xiàn)象：法國工程師菲涅耳于1818年演示了小孔衍射。干涉和衍射是波動(dòng)的重要特征，從而光的波動(dòng)說得到迅速發(fā)展。人類對(duì)光的本性的認(rèn)識(shí)達(dá)到一個(gè)新的階段。

電磁說的提出：隨著物理學(xué)各方面的發(fā)展，麥克斯韋提出了電磁波的理論，進(jìn)而完善了光是電磁波的結(jié)論，惠更斯的波動(dòng)說發(fā)展到了麥克斯韋的電磁說。干涉現(xiàn)象：是波動(dòng)獨(dú)有的特征，只有兩列頻率相同，相位差恒定，振動(dòng)方向一致的相干光源在空間相遇時(shí)相互疊加，才能在某些區(qū)域始終加強(qiáng)，在另一些區(qū)域則始終削弱，形成穩(wěn)定的強(qiáng)弱分布的現(xiàn)象--光的干涉。衍射現(xiàn)象：光繞過障礙物偏離直線傳播路徑而進(jìn)入陰影區(qū)里的現(xiàn)象，叫光的衍射。光電效應(yīng)：19世紀(jì)末，光電效應(yīng)被發(fā)現(xiàn)，光的波動(dòng)說在光電效應(yīng)面前束手無策，人們又認(rèn)識(shí)到了光確實(shí)具有粒子性。愛因斯坦提出了光的量子理論---光子說.人們終于認(rèn)識(shí)到光既具有波動(dòng)性又具有粒子性。光的波粒二象性光電效應(yīng)和康普頓效應(yīng)表明光具有粒子性，光的干涉、衍射、偏振現(xiàn)象表明光具有波動(dòng)性。光既有粒子性，又有波動(dòng)性，單獨(dú)使用波或粒子的解釋都無法完整描述光的所有性質(zhì)，人們把這種性質(zhì)稱為波粒二象性光子是能量為hν的微粒，表現(xiàn)出粒子性，而光子的能量與頻率ν有關(guān)，體現(xiàn)了波動(dòng)性，所以光子是統(tǒng)一了波粒二象性的微粒。但是，在不同條件下的表現(xiàn)不同。大量光子表現(xiàn)出波動(dòng)性，個(gè)別光子表現(xiàn)出粒子性；光在傳播時(shí)表現(xiàn)出波動(dòng)性，而在與其他物質(zhì)相互作用時(shí)表現(xiàn)出粒子性；頻率低的光波動(dòng)性更強(qiáng)，頻率高的光粒子性更強(qiáng)。綜上所述，光的粒子性和波動(dòng)性組成一個(gè)有機(jī)的統(tǒng)一體，并不是獨(dú)立存在的。光的粒子性:1.與物質(zhì)發(fā)生作用時(shí),表現(xiàn)出粒子的性質(zhì)2.少量或個(gè)別光子容易顯示出粒子性3.頻率較大時(shí),易顯示粒子性光的波動(dòng)性:1.傳播時(shí),表現(xiàn)出波的性質(zhì)2.大量光子容易顯示出波動(dòng)性3.頻率較小時(shí),易顯示波動(dòng)性正確理解波粒二象性偏光顯微鏡

polarizingmicroscope利用光的偏振特性對(duì)組織內(nèi)含有的具有雙折射特性的晶體類物質(zhì)進(jìn)行觀察需要專門的偏振片（起偏片）將入射光變?yōu)槠窆廨d物臺(tái)分為兩層，上層可旋轉(zhuǎn)，下層設(shè)有游標(biāo)，可分辨0.1o的轉(zhuǎn)角檢測偏振光需要與上述相同的偏振片（檢偏片）

偏光顯微鏡是利用光的偏振特性，對(duì)具有雙折射性(即可以使一束入射光經(jīng)折射后分成兩束折射光)的晶體、液晶態(tài)物質(zhì)進(jìn)行觀察和研究的重要光學(xué)儀器。利用它可以清楚地觀察到纖維絲、紡錘體、膠原、染色體、卵巢、骨骼、毛發(fā)、活細(xì)胞的結(jié)晶或液晶態(tài)的內(nèi)含物、神經(jīng)纖維、肌肉纖維、植物纖維等的細(xì)微結(jié)構(gòu)，從而可以分析細(xì)胞、組織的變化過程。偏光顯微鏡

偏光顯微鏡是在一般顯微鏡的基礎(chǔ)上增添了使普通光轉(zhuǎn)變成線偏振光和檢測偏振光的裝置或觀察干涉圖樣的特殊透鏡。即光源前有偏振片（起偏器），使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器（一個(gè)偏振方向與起偏器垂直的起偏器）。偏光顯微鏡偏光顯微鏡

偏光顯微鏡的載物臺(tái)是可以旋轉(zhuǎn)的。當(dāng)載物臺(tái)無樣品時(shí)，無論如何旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)，由于兩個(gè)偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線。而放入旋光性物質(zhì)后，由于光線通過這類物質(zhì)時(shí)發(fā)生偏轉(zhuǎn)，因此旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)便能檢測到這種物體。偏光顯微鏡的結(jié)構(gòu)光通過單軸晶體時(shí)的雙折射現(xiàn)象一.雙折射現(xiàn)象：1.雙折射：當(dāng)一束光在各向異性介質(zhì)折射時(shí)，折射光一般將分為兩束，這種現(xiàn)象稱為晶體的雙折射2.雙折射現(xiàn)象的特點(diǎn)和規(guī)律：當(dāng)一束自然光正入射到冰洲石（或碳等）晶體界面上時(shí)，在晶體內(nèi)部分成兩束折射光，一束總是滿足折射定律稱尋常光（o光），另一束不滿足折射定律，稱為非常光（e光），雙折射后的偏振光都是線偏振光，并且振動(dòng)方向相互垂直。雙折射現(xiàn)象對(duì)于各向異性晶體，一束光射入晶體后，可以觀察到有兩束折射光的現(xiàn)象。n1n2irore(各向異性媒質(zhì))自然光尋常光線(o光)-----遵守折射定律非常光線(e光)-----不遵守折射定律o光和e光都是線偏振光。一、自然光一束自然光可以等效為:光振動(dòng)方向相互垂直的、等振幅的、互不相干的、光強(qiáng)度各占一半的兩束光。自然光的等效由于光源發(fā)光是由大量原子發(fā)光組成,每個(gè)原子發(fā)光的電矢量和磁矢量的振動(dòng)方向都是隨機(jī)的,

和

在各方向的振動(dòng)都存在;感光作用決定于電矢量

(光矢量),且的振幅可看作完全相等.自然光的圖示法：自然光自然光的等效二、線偏振光(完全偏振光)只在某一方向有光振動(dòng)的光，稱為線偏振光。E播傳方向振動(dòng)面·面對(duì)光的傳播方向看線偏振光可沿兩個(gè)相互垂直的方向分解EEyEx

yx線偏振光的表示法：光振動(dòng)垂直畫面光振動(dòng)平行畫面

某些物質(zhì)能強(qiáng)烈地吸收某個(gè)方向的光振動(dòng)，當(dāng)自然光照射其上時(shí)，只允許某個(gè)特定方向的光振動(dòng)通過，形成偏振光。起偏和檢偏一、起偏從自然光獲得偏振光的過程，稱為起偏。起偏器:產(chǎn)生偏振光的光學(xué)器件.偏振片:只能透過某一方向光振動(dòng)的光學(xué)器件.二、檢偏用偏振片分析檢驗(yàn)光的偏振態(tài)過程.I?P待檢光旋轉(zhuǎn)法.9......起偏器檢偏器自然光線偏振光偏振光通過旋轉(zhuǎn)的檢偏器，光強(qiáng)發(fā)生變化.....起偏器檢偏器自然光線偏振光偏振光通過旋轉(zhuǎn)的檢偏器，光強(qiáng)發(fā)生變化.....起偏器檢偏器自然光線偏振光偏振光通過旋轉(zhuǎn)的檢偏器，光強(qiáng)發(fā)生變化.....起偏器檢偏器自然光線偏振光兩偏振片的偏振化方向相互垂直光強(qiáng)為零偏振光通過旋轉(zhuǎn)的檢偏器，光強(qiáng)發(fā)生變化.....起偏器檢偏器自然光線偏振光偏振光通過旋轉(zhuǎn)的檢偏器，光強(qiáng)發(fā)生變化.....起偏器檢偏器自然光線偏振光偏振光通過旋轉(zhuǎn)的檢偏器，光強(qiáng)發(fā)生變化.....檢偏器自然光通過旋轉(zhuǎn)的檢偏器，光強(qiáng)不變自然光.....檢偏器自然光自然光通過旋轉(zhuǎn)的檢偏器，光強(qiáng)不變.....檢偏器自然光自然光通過旋轉(zhuǎn)的檢偏器，光強(qiáng)不變.....檢偏器自然光自然光通過旋轉(zhuǎn)的檢偏器，光強(qiáng)不變.....檢偏器自然光自然光通過旋轉(zhuǎn)的檢偏器，光強(qiáng)不變.....檢偏器自然光自然光通過旋轉(zhuǎn)的檢偏器，光強(qiáng)不變.....檢偏器自然光自然光通過旋轉(zhuǎn)的檢偏器，光強(qiáng)不變相襯顯微鏡

光線只有通過染色標(biāo)本時(shí)其波長、振幅發(fā)生變化，人眼才能看見?；罴?xì)胞和未染色的標(biāo)本由于光的波長和振幅不發(fā)生變化，人眼看不到，但其相位有變化，因此利用光的干涉和衍射效應(yīng)把透過標(biāo)本不同區(qū)域的光波光程差轉(zhuǎn)變成振幅差，使細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間呈現(xiàn)清晰可見的明暗對(duì)比。

相襯顯微鏡比普通光學(xué)顯微鏡多了2個(gè)部件：在聚光器上增加一個(gè)環(huán)形光闌；在物鏡后焦面增加一個(gè)相板，相板上有一個(gè)環(huán)形區(qū)，通過環(huán)形區(qū)的光比從其它區(qū)域透過的光超前或滯后1/4λ，這樣就使通過標(biāo)本不同區(qū)域光波的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹?。相襯顯微鏡相襯顯微鏡照明原理

光通過標(biāo)本致密區(qū)時(shí)發(fā)生衍射，產(chǎn)生偏折光，相位和未受影響的直射光相比被推遲了1/4λ。只有未發(fā)生偏折的的直射光可通過相位板的環(huán)形區(qū)，其它的偏折光在物鏡的后焦面上產(chǎn)生了一個(gè)與通過相位板的環(huán)形區(qū)的光不同的1/4λ的光程差。兩組光在平面上成像。相襯顯微鏡

如果相板的環(huán)形區(qū)使直射光超前1/4λ，加上開始直射光超前的1/4λ，直射光共超前1/2λ，直射光和偏折光疊加形成的合成波振幅減少，產(chǎn)生暗反差。如果相板的環(huán)形區(qū)使直射光滯后1/4λ，加上開始直射光超前的1/4λ，兩者相抵直射光不發(fā)生變化，直射光和偏折光無相位變化，形成的合成波振幅增加，產(chǎn)生明反差。相襯顯微鏡紫外光顯微鏡

紫外光源可以明顯提高顯微鏡的分辨率，對(duì)于生物樣品使用紫外光照明還具有獨(dú)特的效果。細(xì)胞中的原生質(zhì)對(duì)可見光幾乎是不吸收的，而蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子對(duì)紫外光具有特殊的吸收作用。因此，可以使用紫外光顯微鏡（ultravioletmicroscope）研究單個(gè)細(xì)胞的組成與變化情況。二、電子顯微鏡一、電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)二、電子顯微鏡的分類及其應(yīng)用

光鏡分辯極限為0.2m，小于0.2m的微細(xì)結(jié)構(gòu)的光波可產(chǎn)生衍射現(xiàn)象,這種光波經(jīng)過物體時(shí)可繞過物體就象無物體經(jīng)過一樣,因此無法用光鏡觀察。這就需要一種更大分辮力的儀器來觀察比0.2m更小的物體的微細(xì)結(jié)構(gòu)。

一、電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)電子光學(xué)系統(tǒng)真空系統(tǒng)供電系統(tǒng)機(jī)械系統(tǒng)觀察顯示系統(tǒng)照明系統(tǒng)成像系統(tǒng)（一）電子光學(xué)系統(tǒng)---照明系統(tǒng)電子光學(xué)系統(tǒng)主要由電子槍和聚光鏡組成。電子槍是發(fā)射電子的照明光源。聚光鏡是把電子槍發(fā)射出來的電子會(huì)聚而成的交叉點(diǎn)進(jìn)一步會(huì)聚后照射到樣品上。照明系統(tǒng)的作用就是提供一束亮度高、照明孔徑角小、平行度好、束流穩(wěn)定的照明源。

1.電子槍

電子槍是電鏡的電子發(fā)射源，其作用是形成電子束，并控制電子束的發(fā)射，獲得一高亮度和高穩(wěn)定度的照明電子光源。常用的電子槍是熱陰極三極電子槍，它由發(fā)夾形鎢絲陰極、柵極和陽極組成。電子槍的結(jié)構(gòu)及工作原理圖燈絲2.聚光鏡

聚光鏡用來會(huì)聚電子槍射出的電子束，以最小的損失照明樣品，調(diào)節(jié)照明強(qiáng)度、孔徑角和束斑大小。一般都采用雙聚光鏡系統(tǒng)。第一聚光鏡是強(qiáng)激磁透鏡而第二聚光鏡是弱激磁透鏡。（一）電子光學(xué)系統(tǒng)——成像系統(tǒng)

電子透鏡：能使電子束聚焦的裝置電子透鏡是電鏡的核心部件，其工作方式是利用復(fù)雜的電極和線圈結(jié)構(gòu)形成靜電場和磁場。電子透鏡存在各種像差（aberration），這是影響成像質(zhì)量的主要因素。電子透鏡(二)真空系統(tǒng)

主要由機(jī)械泵、油擴(kuò)散泵或離子泵、聯(lián)動(dòng)控制閥門、真空排氣管道、空氣過濾器和用于真空度指示的真空測量規(guī)等組成。(三)供電系統(tǒng)

供電系統(tǒng)包括