工業(yè)酶制劑蛋白酶

工業(yè)酶制劑蛋白酶第一頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日蛋白酶是催化肽鍵水解的一類酶。凡是能水解蛋白質(zhì)的酶,在剛合成時(shí)都沒(méi)有活性,被稱為酶原。以無(wú)活性形式合成酶有利于酶的貯存及在機(jī)體內(nèi)的輸送、轉(zhuǎn)移。這種無(wú)活性的酶原可以通過(guò)自催化反應(yīng)或通過(guò)金屬離子進(jìn)行活化。第二頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日1產(chǎn)蛋白酶菌種研究狀況

1956以來(lái)，我國(guó)陸續(xù)選育了一批優(yōu)良產(chǎn)酶菌種，其中包括中性蛋白酶生產(chǎn)菌枯草桿菌1.398,S114,172,放線菌166，棲土曲霉3.942；堿性蛋白酶生產(chǎn)菌地衣芽孢桿菌2709，短小芽孢桿菌289，209；酸性蛋白酶生產(chǎn)菌黑曲霉3.350，宇佐美曲霉537，肉桂色曲霉No.81，漿油工業(yè)用的米曲霉3042。美國(guó)曾規(guī)定，用在食品和藥物的蛋白酶生產(chǎn)菌種都需經(jīng)食品和藥物管理局批準(zhǔn)，并嚴(yán)格限制在枯草桿菌，黑曲霉，米曲霉三種菌的菌株。第三頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日2酶蛋白的分類：

按酶蛋白的作用方式分：①內(nèi)肽酶：切開(kāi)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵，產(chǎn)物是短肽。②外肽酶：切開(kāi)蛋白質(zhì)末端肽鍵形成少一單元的肽鏈和游離氨基酸，作用于氨基端的叫氨肽酶；作用于羧基端的叫羧肽酶。③水解蛋白質(zhì)或多肽的酯鍵。④水解蛋白質(zhì)或多肽的酰氨鍵的。第四頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日按酶的來(lái)源分類：①植物蛋白酶。②動(dòng)物蛋白酶。③微生物蛋白酶。按酶的最適pH分類：①酸性蛋白酶，最適。②中性蛋白酶，pH7-8。③堿性蛋白酶，。為方便起見(jiàn)，微生物蛋白酶常用此分類法。第五頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日按酶的活性中心功能基團(tuán)分類：①絲氨酸蛋白酶（Serineprotease)。胰蛋白酶，糜蛋白酶，凝血蛋白酶等②巰基蛋白酶（Thiolprotease）。木瓜酶，無(wú)花果酶，某些鏈球菌蛋白酶③金屬蛋白酶（Metalloprotease）。許多微生物的中性蛋白酶第六頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日3關(guān)于蛋白酶的專一性

蛋白酶的專一性一般情況下,不是針對(duì)底物的專一性,而是針對(duì)某些肽鍵的特異性,不管蛋白質(zhì)的分子有多大,但組成蛋白質(zhì)的氨基酸的種類基本是一致的,蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的不同,主要體現(xiàn)在氨基酸的比例和彼此排列順序的差異。蛋白酶的專一性主要是由于形成肽鍵的兩氨基酸的性質(zhì)不同所決定的。第七頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日蛋白酶的底物專一性和水解肽鏈的能力,不僅受到切開(kāi)點(diǎn)一側(cè)或兩側(cè)相鄰氨基酸殘基的影響,甚至受間隔了若干單位的氨基酸殘基的影響.底物專一性上的微小差異,產(chǎn)生的生理功能可能完全不同.如胰蛋白酶,凝血酶和透明質(zhì)酸梅,三者在選擇性切開(kāi)堿性氨基酸羧基側(cè)的肽鍵這點(diǎn)上,有共同之處,但作用于血纖維蛋白時(shí),三者切開(kāi)的肽鍵數(shù)不同.凝血酶使血液凝固,透明質(zhì)酸梅相反,起溶血作用,胰蛋白酶切開(kāi)肽鍵最多,但兩種作用都很微弱.第八頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日

4.微生物蛋白酶的酶系組成細(xì)菌蛋白酶:枯草桿菌等芽孢桿菌生產(chǎn)中性或堿性蛋白酶,有些只一種,有些兩種皆產(chǎn).霉菌蛋白酶:曲霉中米曲霉,黃曲霉及棲土曲霉以中,堿性蛋白酶為主;黑曲霉以酸性蛋白酶為主;根霉,青霉,擔(dān)子菌主要生產(chǎn)酸性蛋白酶.酵母蛋白酶:除解脂假絲酵母產(chǎn)生堿性蛋白酶外,大多數(shù)產(chǎn)酸性蛋白酶.放線菌蛋白酶:生產(chǎn)中,堿性蛋白酶.第九頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日5主要蛋白酶及其性質(zhì)

酸性蛋白酶主要來(lái)源:酸性蛋白酶主要來(lái)源于哺乳動(dòng)物的消化道,如胃蛋白酶;部分微生物是酸性蛋白酶的主要來(lái)源,如:目前的商品酸性蛋白酶制劑主要是由黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的。第十頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日一般性質(zhì):

①分子特性:酸性蛋白酶的最適pH在2-5范圍,酶蛋白的等電點(diǎn)在pI3-5,分子量MW30,000-35,000。②催化特性:酸性蛋白酶的最適溫度因來(lái)源不同而有差異,一般霉菌的蛋白酶的最適溫度較高,大部分在50-60℃范圍,而來(lái)源于動(dòng)物胃粘膜的蛋白酶的最適溫度較低,一般在40℃左右,但酸性蛋白酶的熱穩(wěn)定性都較差,一般在50℃都很快失活,此外,酶的熱穩(wěn)定性還受到基質(zhì)的pH的影響;有些酸性蛋白酶不耐低溫,在低溫條件下,很快失活。許多酸性蛋白酶分子中含5-10%多糖，對(duì)酶的穩(wěn)定有益。第十一頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日酸性蛋白酶的活性中心大多酶在其活性中心含兩個(gè)天冬氨酸殘基.齋藤曲霉酸性蛋白酶中與活性相關(guān)的氨基酸是一個(gè)色氨酸,3個(gè)組氨酸和近20個(gè)酪氨酸,但色氨酸不在活性中心,而是牢固地結(jié)合在酶分子的疏水鍵上,有穩(wěn)定構(gòu)象的作用.擬青霉酶分子中含-SH基.第十二頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日

底物專一性:

許多霉菌產(chǎn)生的酸性蛋白酶需要較大分子的底物,對(duì)蛋白質(zhì)的專一性較胃蛋白酶低,胃蛋白酶作用過(guò)的底物蛋白,可進(jìn)一步用霉菌的酸性蛋白酶進(jìn)行水解。幾乎所有來(lái)源于霉菌的酸性蛋白酶,能裂解胰蛋白酶原的賴氨酸和異亮氨酸之間的肽鍵(Lys6—Ile7),將胰蛋白酶原激活,利用此特異性,可鑒別酸性蛋白酶制劑是來(lái)源于霉菌或其他來(lái)源。

第十三頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日中性蛋白酶

中性蛋白酶是最早用于酶制劑工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶,目前的微生物生產(chǎn)的商品酶制劑的菌種主要有:枯草桿菌、耐熱解蛋白芽孢桿菌、灰色鏈霉菌、寄生曲霉、米曲霉、棲土曲霉。除上述微生物生產(chǎn)中性蛋白酶外,來(lái)源于植物的木瓜蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶等都屬于中性蛋白酶。第十四頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日一般性質(zhì):

①分子特性:大部分微生物產(chǎn)生的中性蛋白酶屬于金屬蛋白酶,一分子酶蛋白含有一個(gè)鋅原子,酶蛋白的分子量在35,000-40,000范圍,等電點(diǎn)pI8-9,微生物蛋白酶中,中性蛋白酶的穩(wěn)定性最差,分子之間最容易發(fā)生自溶,即使在低溫條件下,也會(huì)發(fā)生明顯的自溶,造成分子量明顯降低。第十五頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日②催化特性:中性蛋白酶的熱穩(wěn)定性較差,如枯草桿菌的中性蛋白酶在pH7,60℃處理15min,失活90%;棲土曲霉的中性蛋白酶在pH7,55℃處理10min,失活80%以上;以酪蛋白為底物時(shí),枯草桿菌蛋白酶的最適pH7-8、熱解蛋白芽孢桿菌的中性蛋白酶的最適pH7-9、棲土曲霉的中性蛋白酶pH6.5-7.5;最適溫度受測(cè)定時(shí)的反應(yīng)時(shí)間有直接關(guān)系,因?yàn)槊傅鞍椎姆€(wěn)定性較差,所以反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短影響著反應(yīng)結(jié)果,一般在10-30min最適溫度為45-50℃。鈣離子可以增加酶蛋白的穩(wěn)定性,并減少自溶。第十六頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日關(guān)于中性蛋白酶的活性中心

大部分微生物產(chǎn)生的中性蛋白酶的活性中心有一個(gè)鋅離子,鋅離子起著酶蛋白與底物之間的橋梁作用,有些酶蛋白還含有鈣離子,鈣離子具有穩(wěn)定酶蛋白空間構(gòu)象的作用;此外,鈣離子還與酶蛋白的熱穩(wěn)定性有關(guān),含有鈣離子的酶蛋白的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于不含鈣離子的蛋白酶。利用酶蛋白的分子修飾技術(shù),研究發(fā)現(xiàn),利用EDTA螯合作用除去中性蛋白酶的鋅離子,然后置換成鈣離子,這樣制備的中性蛋白酶結(jié)晶比原酶蛋白的活力提高了3倍。如果用錳離子置換鋅離子,酶活力提高56%,并且提高了酶蛋白的熱穩(wěn)定性。第十七頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日關(guān)于酶蛋白的專一性

微生物產(chǎn)生的中性蛋白酶的最適底物是Z--Gly-↓-X--NH2,其中X是疏水性氨基酸,如果是絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、組氨酸時(shí),酶蛋白的活力明顯升高。第十八頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日堿性蛋白酶

堿性蛋白酶主要是由微生物產(chǎn)生,微生物中主要是細(xì)菌的部分菌種產(chǎn)生堿性蛋白酶,目前堿性蛋白酶主要是用于洗滌劑、皮革工業(yè)、絲綢脫膠。第十九頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日生產(chǎn)菌種

幾乎所有的細(xì)菌堿性蛋白酶都是胞外蛋白酶,主要包括兩類:其一是在中性條件下生產(chǎn)的堿性蛋白酶,如枯草桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌等;其二是嗜堿微生物,其必須在堿性條件下[pH8-10]才能生產(chǎn)的堿性蛋白酶。第二十頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日一般性質(zhì)

①酶蛋白特性:堿性蛋白酶的分子量比中性蛋白酶的分子量小,一般在20,000-34,000Da,而且等電點(diǎn)較高,一般在pH8-9。②催化特性:大部分堿性蛋白酶的最適pH在7-11范圍,當(dāng)以酪蛋白為底物時(shí),最適pH為9.5-10.5,堿性蛋白酶除能夠水解肽鍵外,還具有水解酯鍵的能力和轉(zhuǎn)肽能力,最適溫度因菌種不同而有差異,一般在50℃左右,酶蛋白的熱穩(wěn)定性不高,50-60℃處理15分鐘,幾乎有50%的酶活力喪失,我國(guó)目前生產(chǎn)的幾種堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性一般都在60℃以下。第二十一頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日堿性蛋白酶的活性中心

堿性蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶,其活性中心的主要功能基團(tuán)是絲氨酸,一部分天然蛋白質(zhì)能夠使堿性蛋白酶失活,如在土豆、大豆、大麥中含有一種蛋白質(zhì)是堿性蛋白酶的抑制劑。第二十二頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日堿性蛋白酶的專一性

微生物產(chǎn)生的堿性蛋白酶除具有水解肽鍵的能力外,還具有較強(qiáng)的水解酯鍵的酯酶活力,能夠水解各種對(duì)硝基苯基酯,當(dāng)酶制劑中混有中性蛋白酶時(shí),可以利用對(duì)硝基苯基酯作底物來(lái)測(cè)定堿性蛋白酶的活力,以區(qū)別中性蛋白酶。第二十三頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日根據(jù)微生物堿性蛋白酶水解肽鍵的羧基側(cè)氨基酸的專一性,可將堿性蛋白酶分為4組:①對(duì)堿性氨基酸有專一性的(LysArg)類似于胰蛋白酶的堿性蛋白酶②對(duì)芳香族氨基酸有專一性的(TyrPhe)枯草桿菌堿性蛋白酶③對(duì)脂肪族氨基酸有專一性的(LeuIleVal)粘細(xì)菌α-裂解型蛋白酶 ④對(duì)酸性氨基酸有專一性的(GluAsp)葡萄球菌堿性蛋白酶第二十四頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日6蛋白酶的應(yīng)用

蛋白酶種類繁多，商品蛋白酶不下100種。不同來(lái)源的蛋白酶在工業(yè)上有不同的用途。蛋白酶已廣泛使用在皮革、毛紡、絲綢、日化、食品、釀造、醫(yī)藥等許多行業(yè)中。在食品工業(yè)中利用蛋白酶制劑，可以避免酸水解、堿水解對(duì)氨基酸的破壞作用及變旋，保證蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不受影響.第二十五頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日蛋白酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用肉類加工中水解結(jié)締組織,嫩化肉類,軟化腸衣：利用蛋白酶對(duì)肉中的彈性蛋白和膠原蛋白進(jìn)行部分水解，使肉類制品口感達(dá)到嫩而不韌、味美鮮香的效果。提高質(zhì)量.使用最多、作用最穩(wěn)定的蛋白酶是木瓜蛋白酶面包、蛋糕加工中縮短揉面時(shí)間，增強(qiáng)面團(tuán)延伸性。乳酪制造中可凝固酪素，縮短凝乳時(shí)間醬品制造中用于處理大豆或豆餅粉，提高蛋白質(zhì)利用率或縮短醬油、豆瓣醬發(fā)酵時(shí)間酒類生產(chǎn)中用于啤酒、清酒澄清，防止渾濁:豆奶生產(chǎn)中利用蛋白酶制劑可使苦澀味及豆腥味等異昧成分游離出來(lái)，通過(guò)吸附等方式較容易除去，又能提高蛋白質(zhì)的可溶性而提高蛋白質(zhì)得率。并且以中性蛋白酶效果最佳。第二十六頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日第二十七頁(yè)，共二十九頁(yè)，2022年，8月28日其它方面的應(yīng)用皮革脫毛軟化