紫外-可見吸收光譜分析

紫外—可見吸收光譜現(xiàn)代分析技術(shù)研究中心趙娟跨越眾多領(lǐng)域，提供完美技術(shù)分析裝置測(cè)定裝置試驗(yàn)檢查裝置真空機(jī)器醫(yī)療器械等紫外-可見分光光度法原理(UltravioletandVisibleSpectrophotometry,UV-Vis)

2.1紫外-可見吸收光譜2.2吸收光譜的測(cè)量Lambert-Beer

定律2.3分析條件選擇2.4UV-Vis分光光度法的應(yīng)用

UV-Vis方法是分子光譜方法，它利用分子對(duì)外來(lái)輻射的吸收特性。

UV-Vis涉及分子外層電子的能級(jí)躍遷；光譜區(qū)在160~780nm.

UV-Vis主要用于分子的定量分析，但紫外光譜(UV)為四大波譜之一，是鑒定許多化合物，尤其是有機(jī)化合物的重要定性工具之一。電磁波譜g-X-射線紫外可見紅外

微波無(wú)線電20040080010000(nm)波長(zhǎng)真空紫外近紅外核磁共振

波長(zhǎng)越短，能量越高引起

UV/VIS吸收的原因某些單鍵大多數(shù)雙鍵共軛雙鍵某些金屬與非金屬化合物N,O,S,鹵素2.1紫外-可見吸收光譜一、分子吸收光譜的形成1.過(guò)程：分子外層電子吸收外來(lái)輻射產(chǎn)生電子能級(jí)躍遷分子吸收譜?；鶓B(tài)

E0激發(fā)態(tài)

E1DE=E1-E0=hn能量激發(fā)e能量差DE有機(jī)分子包括:成鍵軌道、；反鍵軌道*、*；非鍵軌道n；可能的躍遷類型：-*；-*；-*；n-*；-*；n-*二、分子吸收光譜躍遷類型n非成鍵軌道s成鍵軌道p*反鍵軌道

p成鍵軌道s*反鍵軌道Energylevelσ-σ*躍遷，能量很高。電子以單鍵存在，如飽和碳?xì)浠衔?，一般在波長(zhǎng)>220nm時(shí)無(wú)強(qiáng)的紫外吸收；

n-σ*躍遷，能量相對(duì)較高?；衔镏泻蟹擎I合的O，

N，S，或X-

的電子。在紫外區(qū)有強(qiáng)吸收；π-π*躍遷、

n-π*躍遷，能量較低。含有雙鍵，螯合雙鍵芳香烴，閉環(huán)芳香烴及雜環(huán)芳香烴的化合物。紫外和可見區(qū)有中等至強(qiáng)的吸收。只有-*和n-*兩種躍遷的能量小，相應(yīng)波長(zhǎng)出現(xiàn)在近紫外區(qū)甚至可見光區(qū)，且對(duì)光的吸收強(qiáng)烈，是我們研究的重點(diǎn)。-胡羅卜素咖啡因阿斯匹林丙酮

幾種有機(jī)化合物的分子吸收光譜圖。2.2吸收光譜的測(cè)量Lambert-Beer

定律一、透射率

入射光I0透射光I光程長(zhǎng)b

透射率

T%=II0X100%二、Lambert-Beer定律當(dāng)入射光波長(zhǎng)一定時(shí)，待測(cè)溶液的吸光度A與其濃度和液層厚度成正比，即k為比例系數(shù)，與溶液性質(zhì)、溫度和入射波長(zhǎng)有關(guān)。

當(dāng)濃度以g/L表示時(shí)，稱k為吸光系數(shù)，以a表示，即

當(dāng)濃度以mol/L表示時(shí)，稱k為摩爾吸光系數(shù)，以表示，即比a更常用。越大，表示方法的靈敏度越高。與波長(zhǎng)有關(guān)，因此，常以表示。A=-lgT%=lgI0/I=Kbc三、偏離L-B定律的因素樣品吸光度A與光程b總是成正比。但當(dāng)b一定時(shí)，A與c并不總是成正比，即偏離L-B定律！這種偏離由樣品性質(zhì)和儀器決定。1.樣品性質(zhì)影響a）待測(cè)物高濃度--吸收質(zhì)點(diǎn)間隔變小—質(zhì)點(diǎn)間相互作用—對(duì)特定輻射的吸收能力發(fā)生變化變化；b）試液中各組份的相互作用，如締合、離解、光化反應(yīng)、異構(gòu)化、配體數(shù)目改變等，會(huì)引起待測(cè)組份吸收曲線的變化；c）溶劑的影響：對(duì)待測(cè)物生色團(tuán)吸收峰強(qiáng)度及位置產(chǎn)生影響；d）膠體、乳狀液或懸浮液對(duì)光的散射損失。濃度影響適用于稀溶液高濃度區(qū)偏離線形范圍

(>0.01M)Highconcentrationmoremoleculesarepackedinonevolume化學(xué)反應(yīng)影響Deviationfromlinearitymaycausedby分析物分解分析物締合分析物與溶劑發(fā)生反應(yīng)雜散光影響1.02.0

02.55.07.510.0Concentration,M*103Absorbance0.0%0.2%1.0%5.0%Straylight=*100IsIoDiagramwastakenfrom:DouglasA.SkoogandJamesJ.Leary,PrinciplesofInstrumentalAnalysis,4thed.,SaundersCollegePublishing,1992,page131.pH值的影響Diagramtakenfrom:JamesD.IngleJr.andStanleyR.Crouch,SpectrochemicalAnalysis,prentice-HallInternationalEditions,page3741.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10325400475550625700(nm)Absorbance10986.869876.86.56酚紅不同pH值的吸收2.3分析條件選擇一、儀器測(cè)量條件當(dāng)分析高濃度的樣品時(shí)，誤差更大。由L-B定律：微分后得：將上兩式相比，并將dT和dc分別換為T和c，得當(dāng)相對(duì)誤差c/c最小時(shí)，求得T=0.368或A=0.434。即當(dāng)A=0.434時(shí)，吸光度讀數(shù)誤差最小！通常可通過(guò)調(diào)節(jié)溶液濃度或改變光程b來(lái)控制A的讀數(shù)在0.15~1.00范圍內(nèi)。二、反應(yīng)條件選擇顯色劑的選擇原則：使配合物吸收系數(shù)最大、選擇性好、組成恒定、配合物穩(wěn)定、顯色劑吸收波長(zhǎng)與配合物吸收波長(zhǎng)相差大等。2.顯色劑用量：配位數(shù)與顯色劑用量有關(guān)；在形成逐級(jí)配合物，其用量更要嚴(yán)格控制。3.溶液酸度：配位數(shù)和水解等與pH有關(guān)。4.顯色時(shí)間、溫度、放置時(shí)間等。三、參比液選擇溶劑參比：試樣組成簡(jiǎn)單、共存組份少（基體干擾少）、顯色劑不吸收時(shí)，直接采用溶劑（多為蒸餾水）為參比；2.試劑參比：當(dāng)顯色劑或其它試劑在測(cè)定波長(zhǎng)處有吸收時(shí)，采用試劑作參比（不加待測(cè)物）；3.試樣參比：如試樣基體在測(cè)定波長(zhǎng)處有吸收，但不與顯色劑反應(yīng)時(shí)，可以試樣作參比（不能加顯色劑）。四、干擾消除1.控制酸度：配合物穩(wěn)定性與pH有關(guān)，可以通過(guò)控制酸度提高反應(yīng)選擇性，副反應(yīng)減少，而主反應(yīng)進(jìn)行完全。如在0.5MH2SO4介質(zhì)中，雙硫腙與Hg2+生成穩(wěn)定有色配合物，而與Pb2+、Cu2+、Ni2+、Cd2+等離子生成的有色物不穩(wěn)定。2.選擇掩蔽劑3.合適測(cè)量波長(zhǎng)4.干擾物分離5.導(dǎo)數(shù)光譜及雙波長(zhǎng)技術(shù)二、定量分析1.單組份定量方法1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法（略）2）標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法：該法是標(biāo)準(zhǔn)曲線法的簡(jiǎn)化，即只配制一個(gè)濃度為cs的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并測(cè)量其吸光度，求出吸收系數(shù)k，然后由Ax=kcx求出cx

該法只有在測(cè)定濃度范圍內(nèi)遵守L-B定律，且cx與cs大致相當(dāng)時(shí)，才可得到準(zhǔn)確結(jié)果。校正曲線Analyteconcentration(ppm)AbsorbanceSlopem=e

lAbs=m*Concentration+K0紫外可見分光光度計(jì)UV2550紫外-可見分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)紫外-可見分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)是由五個(gè)部分組成：光源單色器吸收池檢測(cè)器數(shù)據(jù)系統(tǒng)紫外-可見分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)（一）光源

熱輻射光源用于可見光區(qū)，如鎢絲燈和鹵鎢燈，鎢燈和碘鎢燈可使用的范圍在340－2500nm；

氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氘燈。它可在160－375nm范圍內(nèi)產(chǎn)生連續(xù)光源。氘燈的燈管內(nèi)充有氫的同位素氘，它是紫外光區(qū)應(yīng)用最廣泛的一種光源。氘燈：紫外區(qū)，190nm-光源轉(zhuǎn)換波長(zhǎng)（282-393nm）鎢燈：可見-近紅外，光源轉(zhuǎn)換波長(zhǎng)-3200nm

（二）單色器

單色器主要功能：產(chǎn)生光譜純度高的波長(zhǎng)且波長(zhǎng)在紫外可見區(qū)域內(nèi)任意可調(diào)。

單色器一般由入射狹縫、準(zhǔn)光器、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。單色器的性能直接影響入射光的單色性，從而也影響到測(cè)定的靈敏度、選擇性及校準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系等。狹縫的大小直接影響單色光純度，但過(guò)小的狹縫又會(huì)減弱光強(qiáng)。紫外-可見分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)AFM顯微鏡下的光柵圖像（三）吸收池吸收池用于盛放分析試樣，一般有石英和玻璃材料兩種。石英池適用于可見光區(qū)及紫外光區(qū)，玻璃吸收池只能用于可見光區(qū)。

為減少光的損失，吸收池的光學(xué)面必須完全垂直于光束方向。

在高精度的分析測(cè)定中（紫外區(qū)尤其重要），吸收池要挑選配對(duì)。因?yàn)槲粘夭牧系谋旧砦馓卣饕约拔粘氐墓獬涕L(zhǎng)度的精度等對(duì)分析結(jié)果都有影響。（四）檢測(cè)器

常用的檢測(cè)器有光電池和光電倍增管等。硅光電池對(duì)光的敏感范圍為190-1100nm。但由于容易出現(xiàn)疲勞效應(yīng)而只能用于中低檔的分光光度計(jì)中。光電倍增管是檢測(cè)微弱光最常用的光電元件，它的靈敏度比一般的光電池要高200倍，因此可使用較窄的單色器狹縫，從而對(duì)光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)有較好的分辨能力。紫外可見區(qū)：光電倍增管（PMT）近紅外區(qū)：PbS光電池切換波長(zhǎng)：750-895nm（五）數(shù)據(jù)系統(tǒng)它的作用是放大信號(hào)并以適當(dāng)方式指示或記錄下來(lái)。現(xiàn)在一般的紫外可見分光光度計(jì)有計(jì)算機(jī)控制和主機(jī)單片機(jī)控制兩種類型，功能基本類似。

紫外-可見分光光度計(jì)的類型很多，但可歸納為三種類型，即單光束分光光度計(jì)、雙光束分光光度計(jì)和比例雙光束分光光度計(jì)。1，單光束分光光度計(jì)經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過(guò)參比溶液和樣品溶液，以進(jìn)行吸光度的測(cè)定。這種簡(jiǎn)易型分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便，維修容易，適用于常規(guī)分析。2，雙光束分光光度計(jì)經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡分解為強(qiáng)度相等的兩束光。紫外-可見分光光度計(jì)的類型

一束通過(guò)參比池，一束通過(guò)樣品池。光度計(jì)能自動(dòng)比較兩束光的強(qiáng)度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對(duì)數(shù)變換將它