實驗九噬菌體效價的測定(張理珉)

實驗九

噬菌體效價的測定目的要求1、掌握噬菌體效價測定的原理及方法2、觀察噬菌斑的形態(tài)實驗內(nèi)容一

培養(yǎng)基和實驗物品的準(zhǔn)備本次實驗準(zhǔn)備工作（2人/組）1、配制牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)液（pH7.4-7.6）；

（已準(zhǔn)備好）。2、測定效價時稀釋用9ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)液——3支/組，分裝于18×180mm試管；3、牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（1.5%的瓊脂）——底層用，100ml/組，裝于250ml三角瓶，

（用于制備6個無菌平板，倒薄一點）4、上層用5ml牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基（0.8%的瓊脂），融化后分裝于15×150mm試管中加塞包扎滅菌，6支/組；（教師已準(zhǔn)備好）5、1ml無菌吸管5支/組。實驗內(nèi)容二

噬菌體知識介紹一、幾個重要概念1、噬菌體：是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒，分布極廣，個體很小，在光學(xué)顯微鏡下看不見，需用電鏡觀察。不同的噬菌體在電鏡下有三種形態(tài)：蝌蚪形、微球形和絲形。大多數(shù)噬菌體呈蝌蚪形，由頭部和尾部兩部分組成。2、噬菌斑：

在混濁的細菌菌面（菌苔）上形成的透明區(qū)域，是由噬菌體不斷侵染宿主細胞裂解形成的，其形狀、大小不等。3、噬菌體效價：

指1mL樣品中所含具有侵染活性的噬菌體（烈性噬菌體）數(shù)量——噬菌斑形成單位（pfu，plaque-formingunit）。效價（titre，titer）這一名詞在不同的場合有其不同的含義（如抗生素等）。二、病毒粒子的構(gòu)造（模型）噬菌體的形態(tài)及分類科屬大腸桿菌T4噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖大腸桿菌T4噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖

及電鏡照片頭部六角形基板領(lǐng)環(huán)螺旋形尾鞘核心或管（中空）尾刺或刺突尾絲噬菌斑示意照片宿主細菌菌苔噬菌斑大腸桿菌T噬菌斑的表型形態(tài)三、噬菌體的分類

——根據(jù)噬菌體與宿主菌的相互關(guān)系烈性噬菌體（virulentphage）

能在宿主細胞內(nèi)復(fù)制增殖，產(chǎn)生許多子代噬菌體，并最終裂解細菌。溫和噬菌體（temperatephage）

噬菌體基因與宿主染色體整合，不產(chǎn)生子代噬菌體，但噬菌體DNA能隨細菌DNA復(fù)制，并隨細菌的分裂而傳代，存在游離態(tài)、整合態(tài)、營養(yǎng)態(tài)三種形式。針對溫和噬菌體來說：前（原）噬菌體、溶源菌四、噬菌體繁殖（生活周期）1、吸附2、侵入3、增殖（生物合成）4、成熟裝配5、裂解釋放T4噬菌體吸附和DNA的注入T偶數(shù)噬菌體感染大腸桿菌

的掃描電鏡照片T4噬菌體的生活周期T4噬菌體的裝配五、噬菌體的應(yīng)用1、細菌的鑒定與分型

噬菌體與宿主菌的關(guān)系具有高度特異性，即一種噬菌體只能裂解一種和它相應(yīng)的細菌，故可用于未知細菌的鑒定和分型。2、遺傳學(xué)及分子生物學(xué)研究的重要工具

噬菌體基因數(shù)量少，結(jié)構(gòu)比細菌和高等細胞簡單得多，且易獲得大量的突變體——構(gòu)建基因文庫（λ噬菌體）；基因工程載體；噬菌體展示技術(shù)。3、細菌感染的診斷與治療

利用其專一性，可以診斷和治療一些相關(guān)細菌感染性疾?。ㄓ糜谥委煏r，其分泌的細菌素也可以應(yīng)用，臨床外傷治療已有應(yīng)用）但專一性也限制了噬菌體在臨床上的廣泛應(yīng)用（人們最需要的是廣譜性）。六、噬菌體的危害在工業(yè)上會造成所培養(yǎng)菌體的大量裂解，使生產(chǎn)難以完成。表現(xiàn)形式：①發(fā)酵周期明顯延長；②碳源消耗緩慢；③發(fā)酵液變清，鏡檢時，有大量異常菌體出現(xiàn)；④發(fā)酵產(chǎn)物的形成緩慢或根本不形成；⑤用敏感菌作平板檢查時，出現(xiàn)大量噬菌斑；⑥用電子顯微鏡觀察時，可見到有無數(shù)噬菌體粒子存在。輕則延長發(fā)酵周期、影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，重則引起倒罐甚至使工廠被迫停產(chǎn)。七、以防為主的措施：1、決不使用可疑菌種；2、嚴(yán)格保持環(huán)境衛(wèi)生；3、決不排放或隨便丟棄活菌液；4、注意通氣質(zhì)量空氣過濾器要保證質(zhì)量并經(jīng)常進行嚴(yán)格滅菌，空氣壓縮機的取風(fēng)口應(yīng)設(shè)在30～40米高空；5、加強管道及發(fā)酵罐的滅菌；6、不斷篩選抗性菌種，并經(jīng)常輪換生產(chǎn)菌種；7、嚴(yán)格執(zhí)行會客制度。實驗內(nèi)容三

噬菌體效價的測定一、噬菌體效價測定的方法

（梯度稀釋）斑點試驗法——涂菌平板上滴加稀釋液液體稀釋試管法——以不長菌判斷（澄清）雙層平板法——最常用，相對單層優(yōu)點較多單層平板法載玻片法——快速其它病毒的效價（計數(shù)）測定——空斑計數(shù)、電子顯微鏡直接計數(shù)、免疫學(xué)間接測定（凝集、ELISA——酶標(biāo)儀）——滴度表示噬菌體效價測定的方法二、雙層平板法二、雙層平板法37℃約4hr雙層平板法雙層平板法（1.5%瓊脂培養(yǎng)基~10mL）雙層平板法宿主菌懸液（對數(shù)期菌液0.9mL）噬菌體菌懸液（合適稀釋液0.1mL）上層培養(yǎng)基（0.8%瓊脂培養(yǎng)基~5mL）混勻計數(shù)單層與雙層平板法所形成的噬菌斑的比較雙層平板法的優(yōu)點：①加了底層培養(yǎng)基后，可使原來底面不平的玻璃皿的缺陷得到了彌補；②所形成全部噬菌體斑都接近處于同一平面上，因此不僅每一噬菌斑的大小接近、邊緣清晰，而且不致發(fā)生上下噬菌斑的重疊現(xiàn)象；③因上層培養(yǎng)基中瓊脂較稀，故形成的噬菌斑較大，更有利于計數(shù)。三、實驗原理一個噬菌體→侵染宿主細胞→引起裂解→擴散重復(fù)侵染裂解→形成一個噬菌斑（瓊脂凝膠中）宿主細胞數(shù)遠遠大于噬菌體數(shù)？噬菌體效價（pfu/ml）=噬菌斑數(shù)×10×稀釋倍數(shù)四、實驗步驟1、制備底層平板將已滅菌融化的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板6個（倒薄一些），凝固。2、加入大腸桿菌敏感菌在每個牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上，無菌條件下，各皿加入敏感菌菌懸液0.9mL。3、稀釋噬菌體取1mL含噬菌體液加入到9mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，采用10倍稀釋法，分別制備噬菌體稀釋液（10-7、10-8、10-9）。4、噬菌體與大腸桿菌敏感菌混合將已加有大腸桿菌敏感菌6皿平板（10-7、10-8、10-9各2皿）中，分別加入0.1mL噬菌體稀釋液，混合后放置5分鐘。5、加入上層培養(yǎng)基將5mL溶化的半固體培養(yǎng)基中迅速倒入含噬菌體與大腸桿菌敏感菌平板中（45~50℃），并混合均勻。靜止凝固。6、培養(yǎng)37℃培養(yǎng)5小時或室溫培養(yǎng)12小時。7、觀察、計數(shù)觀察平板中的噬菌斑，將每一稀釋度的噬菌斑形成單位（pfu）記錄于表格內(nèi)。8、計算噬菌體的效價按照六個計數(shù)原則選擇，計算每毫升未稀釋的原液的噬菌體效價。噬菌體效價（pfu/ml）=噬菌斑數(shù)×10×稀釋倍數(shù)實驗步驟框圖（教師進行演示操作）用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基倒平板6皿（薄一點）

噬菌體稀釋液（10-7、10-8、10-9）0.1mL，各2皿敏感菌菌懸液0.9mL放入已有底層固體培養(yǎng)基的平板中混勻放置5分鐘將5mL溶化的半固體培養(yǎng)基中倒入上述平板中（45~50℃）混勻（動作？）37℃培養(yǎng)4小時或室溫培養(yǎng)12小時觀察結(jié)果計數(shù)①②③④⑤⑧⑦⑥教科書介紹方法的操作步驟噬菌體稀釋液0.1ml宿主培養(yǎng)液0.9ml45~48℃溶化好牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基4ml混勻吸附5min搓動混勻后倒于有底層的平板中鋪平37℃培養(yǎng)5~6小時，觀察計數(shù)在無菌空試管中混勻上層后（3種成分），再倒入底層上鋪平。思考題噬菌體稀釋度10-710-810-9123平均123平均123平均pfu數(shù)/平板每毫升中的pfu數(shù)1、記錄結(jié)果，并進行統(tǒng)計分析。2、什么因素決定噬菌斑的大??？3、如果在你的測定平板上，偶爾出現(xiàn)其他細菌的菌落，是否影響你的噬菌體效價測定？4、噬菌體效價測定實驗中所用操作方法和書上介紹