第七章高效液相色譜法

第七章高效液相色譜法三、示差折光檢測器四、蒸發(fā)光散射檢測器五、化學發(fā)光檢測器§7-3反相色譜一、固定相二、流動相三、保留機理四、色譜條件選擇§7-1一般流程及分離原理一、簡介二、一般分離流程三、原理四、色譜分離的特點§7-2

檢測器一、紫外吸收檢測器二、熒光檢測器02023/2/31六、樹脂預處理及再生七、實驗技術八、離子交換法的應用§7-5

凝膠色譜一、基本原理二、凝膠的種類三、操作方法四、應用§7-4離子交換色譜一、離子交換二、填料三、IEC的保留機理四、離子交換色譜條件的選擇五、影響離子交換的有關因素02023/2/32§7-6

高效液相色譜的實驗技術一、柱技術二、洗脫方式三、流動相四、分離模式的選擇0§7-7高效液相色譜的應用一、制備分離二、樣品前處理三、HPLC應用四、應用實例2023/2/33第七章

高效液相色譜法

以液體為流動相的色譜法稱為液相色譜法。采用普通規(guī)格的固定相及流動相常壓輸送的液相色譜法則為經典液相柱色譜，其柱效低、而且一般不具備在線檢測器，通常作為分離手段使用。HPLC是以經典的液相柱色譜為基礎，引入了氣相色譜的理論與實驗方法，流動相改為高壓輸送，采用高效固定相及在線檢測等手段，發(fā)展而成的分離分析方法。該法具有分離效能高、分析速度快及儀器化等特點，因而稱為高效液相色譜法。2023/2/34

§7-1一般流程及分離原理一、簡介

1.與經典的液相柱色譜法相比

(1)柱內徑↓，填充劑粒度↓、均勻性↑，新型固定相的問世→分離效率↑。

(2)柱長↓，填充劑機械強度↑，供液壓力和進樣壓力↑，流動相流速↑（1~5ml/min）→分離速度↑（7~8個峰/10min）。

(3)采用光學原理的檢測器→靈敏度↑。

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2.與GC相比

(1)樣品受限制少，對易分解、不容易氣化、分子量大、高極性的有機物（70~80%的有機物）可用HPLC分析。

(2)不用制備衍生物，減少了誤差。

(3)進樣量大（500~800μL），易制備。

(4)分離效率降低。2023/2/36二、一般分離流程高效液相色譜儀及一般分離流程見圖7-1。三、色譜原理1、概念HPLC：以溶劑或某種溶液為流動相，以裝在柱子里的固體為固定相，用高壓輸液泵將流動相壓入柱子，使樣品組分在柱子里進行分離的柱色譜法。2、分類根據(jù)色譜柱所用填充劑的不同，HPLC分離原理有：吸附色譜，分配色譜,鍵合相色譜，離子交換色譜，凝膠色譜等。2023/2/37圖7-1

2023/2/38用液液分配色譜的機理來討論高效液相色譜的普遍性問題。

色譜的分離過程(見圖7-2)。（a）在裝好填料的柱子中加上樣品，然后用溶劑洗脫，樣品中各組分（若有A、B、C三個組分）的分子沿流動相流動方向移動。（b）和（c）表示組分的移動。（d）表示經過一段時間的洗脫以后，A、B、C三個組分已經被分離開，不同組分在柱子中移動速度不同而得到了分離，也就是說不同的組分在柱子上存在差速遷移現(xiàn)象。

另外，對照（a）和（d）可以發(fā)現(xiàn)剛上樣后，溶質分子形成的色帶（又叫譜帶）較窄，而到了（d）中，各組分的譜帶明顯變寬，這說明同一組分沿柱子移動時，存在著擴散問題，即譜帶的擴散。圖7-2三組分樣品分離過程示意圖2023/2/39四、色譜分離兩大特點：差速遷移、譜帶擴展差速遷移：不同組分在柱子中移動速度不同而使其混合物得到分離，即不同的組分在柱子上存在差速遷移現(xiàn)象。引起原因：在分配色譜中，由于不同組分在固液兩相的分配系數(shù)不同引起；在離子交換色譜中，主要是由于各組分對固定相的靜電引力不同造成的。譜帶擴展：同一組分沿色譜柱移動時，色帶由窄變寬，即同一組分在柱子上存在譜帶擴展現(xiàn)象。產生原因：由于同一個化合物的不同分子，在通過柱子時平均遷移速度不同造成的。其原因是由于渦流擴散和各種傳質情況的差異造成了同一物質不同分子的差速遷移。2023/2/310

§7-2高效液相色譜檢測器

目前應用較多的有紫外吸收檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器、化學發(fā)光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、安培檢測器及示差折光檢測器等。

1.紫外吸收檢測器（ultravioletdetector,UVD）

紫外檢測器是HPLC應用最普遍的檢測器，利用紫外分光光度計的原理對各組分進行檢測，屬濃度型檢測器。靈敏度、精密度及線性范圍均較好。既用于等濃度，也用于梯度洗脫。但只能用于對紫外線有吸收的組分的檢測，且流動相的選擇有一定的局限性，其截止波長必須小于檢測波長。2023/2/311

2.熒光檢測器（fluorophtometricdetector,FD）熒光檢測器利用熒光分光光度計的原理對各組分進行檢測，其靈敏度高于紫外吸收檢測器，但只適用于能產生熒光或其衍生物能發(fā)熒光的物質。主要用于氨基酸、多環(huán)芳烴、維生素、甾體化合物及酶等的檢測。在用于氨基酸檢測時，需用衍生法制備衍生物，其衍生法分為柱前與柱后衍生兩種，常用鄰苯二甲醛或異氰硫基苯為衍生化試劑，是分析氨基酸應用最廣的方法。2023/2/3123.示差折光檢測器（RI）

屬于通用型檢測器。其檢測原理是液體都有折光指數(shù)，很少有兩種液體具有相同的折光指數(shù)，所以化合物都可用這種檢測器檢出。當流動相恒定地流過檢測池時，其折光指數(shù)不變，儀器得到一條基本平直的基線。當有組分峰流過去時檢測池時，折光指數(shù)發(fā)生變化，記錄儀記下這信號，即為色譜圖。其缺點：靈敏度較少低，檢出下限為10-7g/mL；易受溫度和流速的影響；不能進行梯度洗脫。

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4.蒸發(fā)光散射檢測器（evaporativelightscatteringdetector,ELSD）蒸發(fā)光散射檢測器是20世紀90年代出現(xiàn)的最新型通用檢測器，可用于揮發(fā)性低于流動相的任何樣品組分的檢測，但對于有紫外吸收的樣品組分檢測靈敏度較低，因而主要用于糖類、高分子化合物、高級脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、甘油三酯及甾體類等幾十類化合物。2023/2/314

這種檢測器是示差折光檢測器的理想替代品。其檢測原理是：將流出色譜柱的流動相及組分先引入已通氣體的蒸發(fā)室，加熱，使流動相蒸發(fā)而除去；樣品組分在蒸發(fā)室內形成氣溶膠，而后進入檢測室；用強光或激光照射氣溶膠產生光散射，測定散射光強而獲得組分的濃度信號。2023/2/315

5.化學發(fā)光檢測器化學發(fā)光檢測器是近年來發(fā)展起來的高選擇性及高靈敏度的新型檢測器，其設備簡單，自身發(fā)光，不需光源，價格便宜，是一種有發(fā)展前途的檢測器，可用于藥物代謝分析及免疫研究。其檢測原理是：將流出色譜柱的組分與發(fā)光試劑混合，產生化學發(fā)光反應，光輻射可用光導纖維傳輸，由光電倍增管檢測，從而獲得信號。2023/2/316幾種主要檢測器的基本特性2023/2/317§7-3反相色譜（RPC）HPLC發(fā)展早期，其填料常用固體吸附劑作固定相，這種色譜叫液—固吸附色譜；另一類填料常采用在固相載體上涂上一層固定液作為固定相（其代替物是鍵合填料），這種色譜是液—液分配色譜。鍵合填料即將配基直接鍵合在固體基質上作為固定相。反相色譜填料是其中之一。所謂反相色譜或正相色譜，其叫法是根據(jù)填料和流動相的相對極性來區(qū)別。流動相極性弱于固定相的液相色譜法叫正相色譜。如以硅膠為吸附劑，以有機溶劑為流動相的吸附色譜中，由于硅膠（SiO2·XH2O）表面大量硅羥基的存在，其極性強于流動相，故是正相色譜。流動相極性強于固定相的液相色譜叫反相色譜。如以有機溶劑加水作流動相，以烷基、苯基鍵合相填料作固定相的色譜就是反相色譜。反相高效液相色譜是應用最廣的一類高效液相色譜法。2023/2/318一、固定相由固體剛性基質和鍵合在基質上的配基組成。（1）基質（擔體）：硅膠。其表面有大量深淺和孔徑不同的孔隙，這樣就使硅膠的表面積大大擴大了。一般常用孔徑在6-12nm。（2）配基：配基都是不同類型的有機基團。采用直接鍵合的方法固定到基質上。其方法：通過有機氯硅烷與硅膠表面硅羥基反應鍵合上去的。即：2023/2/319①非極性鍵合相

此類鍵合相表面基團為非極性烴基，如十八烷基鍵合相（十八烷基鍵合硅膠，octadecylsilane,ODS,C18）以及辛烷基（C8）、乙基、甲基和苯基鍵合相。其中苯基可誘導極化，所以也可視為弱極性鍵合相。

國內產品有YWG-C18和YWG-C8

和YWG-C6H5，國外代表性產品有：NucleosilC18，SpherisorbODS-2，Zorbox-C8等。HPLC中80%的分離工作所用的固定相都是ODS，流動相為不同比例的水和甲醇，所以是反相技術。為提高固定相極性，可縮短烷基的鏈長度，選用YWG-C8為固定相。YWG-C6H5為反相，用于分離芳香族化合物。

2023/2/320

②中等極性鍵合相常見的中等極性鍵合相有醚基鍵合相。這種鍵合相既可作正相又可作反相色譜的固定相，視流動相的極性而定。國內產品有YWG-ROR′，進口產品有Permaphase-ETH。此類鍵合相應用較少。

③極性鍵合相常用的極性鍵合相有氨基、氰基鍵合相用。這種鍵合相既可作正相又可作反相色譜的固定相。國內產品有YWG-NH2、YWG-CN和YQG-NH2、YQG-CN；進口產品有NucleosilNH2或CN，LichrosorbNH2或Zorbox-CN。2023/2/321二、流動相極性溶劑。常用：有機溶劑(如甲醇、異丙醇、乙腈、二氧六環(huán))＋水在這些溶劑中，水的洗脫能力最弱。所以在反相色譜的梯度洗脫中，A液以水為主，B液以有機溶劑為主。洗脫過程中逐漸向流動相中添加有機溶劑，就達到了逐漸增加洗脫強度的目的。相反，如果向水中添加無機鹽，則是減弱了洗脫劑的強度，增強了樣品組分在柱子上的保留。RPC中應用最廣的流動相是:水—甲醇、水—乙腈注：甲醇和乙腈一般用色譜純，而水應當是二次蒸餾水或蒸餾水經脫離子處理2023/2/322三、保留機理（兩種模型）（1）疏溶劑理論一個分子有親水部分和疏水部分兩類基團。親水基團如—OH、-NH2、-COOH和-SH等極性官能團，疏水基團如苯環(huán)-CH3、-CH2-等基團。當一個非極性溶質或分子中的非極性部分放入一個極性溶劑中時，這個非極性部分（即疏水性基團）與極性溶劑之間相互產生了一個斥力，分子中的非極性部分總是趨向于與其他非極性部分聚集，以減少與極性溶劑的接觸面積，減小表面張力，使體系能量最低。這種溶質分子的非極性表面區(qū)域在水中傾向于減小與極性溶劑的接觸面積的效應叫做疏水作用或疏溶劑效應。2023/2/323在RPC中，有機水溶液作流動相，溶質在非極性的配基（烷基、苯基等）上的保留，就是由于溶質中的疏水基團傾向于與配基結合而造成的。溶質中的疏水性越強，與配基的結合地越牢。所以有機同系物中隨著烷基鏈長的增加，其保留值也增大。2023/2/324樣品分子和固定相上的配基在流動相中都是溶劑化的。當樣品分子保留在柱子上時，樣品分子與配基接觸，兩者之間結合面上的溶劑化分子被“擠”走，進入流動相。被“擠”走的溶劑分子有Z個。當樣品分子被洗脫下來時，樣品分子進入了流動相，樣品分子與配基的接觸面重新被溶劑化，重新溶劑化所需的溶劑分子是Z個，與保留時被“擠”走的溶劑分子相等。（2）計量置換模型2023/2/325計量置換模型的數(shù)學表達式為：

lgK′=lgI-Zlg[D0]式中K′為容量因子；lgI為常數(shù)；Z為配基礎與樣品分子接觸面在樣品分子被保留時釋放出來的溶劑分子數(shù)；[D0]為洗脫劑中強溶劑的濃度。在反相色譜中，樣品與配基靠疏水作用結合。而洗脫液如水—甲醇體系中，醇比水更容易使疏水性配基和樣品溶劑化，在保留與置換中，醇在起作用，所以上式中[D0]為甲醇濃度。當柱子、溶劑、樣品分子、溫度固定后，Z為常數(shù)。以lgK′對lg[D0]作圖可得一條直線。通過此表達式，使洗脫劑濃度與保留值建立了直線的關系式。2023/2/326四、反相色譜色譜體系的選擇當樣品組分不是離子型化合物，優(yōu)先選用反相色譜來進行分離。RPC體系選擇順序：首先選柱子再選流動相，然后再考慮檢測器、溫度、洗脫方式、進樣量等條件。（1）柱子：常選ODS柱（其配基為十八烷基）。該柱子優(yōu)點：疏水性強，分離性能好，樣品分子在柱內保留值大，應用面廣。另外：①對于生物蛋白質（大分子量），一般用C4-C8的填料柱；②含-CN或-NO2的化合物，一般用苯基型填料柱；③多糖、類固醇這樣的強極性物質可以使用氨基柱、氰基柱。氨基柱的配基為-RNH2，它可以在一定的條件下，分別當正相柱、反相柱和離子交換柱使用，是一種特殊的填料。

2023/2/327（2）流動相首選：甲醇＋水體系若純甲醇的洗脫能力還不夠強，則要添加或換用其他洗脫能更強的溶劑。常用的溶劑洗脫能力強弱的順序為：水乙腈甲醇二氧六環(huán)四氫呋喃異丙醇（3）檢測條件若物質有發(fā)色團有紫外吸收，用紫外檢測器。檢測波長最常用254nm，因為此波長下燈源光度最強。若樣品組分無紫外吸收，則可選示差折光檢測器。（4）柱溫

rt總之，選擇色譜條件是根據(jù)“樣品組分”確定的。2023/2/328§7-4離子交換色譜法（IEC）

一、離子交換

1.離子交換色譜概念

利用離子交換劑作為固定相，以適宜的溶劑作為流動相，使被分離混合物中的各組分按其離子交換親和力的不同而得到分離。

2.離子交換劑（離子交換樹脂）離子交換劑是不溶性高分子化合物，其分子中含有解離性離子交換基團，當一定量的水溶液通過交換柱時，能與存在于溶液中的陽離子或陰離子物質起可逆的交換作用。2023/2/329

3.離子交換劑的分類

陽離子交換樹脂強酸型弱酸型—PO3H—COOH,—OCH2COOH—C6H4OH—SO3H陰離子交換樹脂強堿型

弱堿型—N(CH3)3X

—NR2—NHR—NH22023/2/330

4.離子交換樹脂的交換原理

(1)強酸型陽離子交換樹脂（SCX）電離程度不受溶液pH變化的影響，在pH1~14范圍內均能進行離子交換反應。2023/2/331

①聚苯乙烯強酸型樹脂：

一般為黑褐色，是最常用的強酸型陽離子交換樹脂，以苯乙烯為單位，向上下左右延伸的網(wǎng)狀結構是它的母體。母體上連結許多—SO3H。2023/2/332常見型號：國產樹脂中強酸1×7（上海樹脂廠#732）、強酸型#1（南開大學樹脂廠）和國外產品Dowex50、AmberliteIR-120、ZeoKarb225、Zerolit225、wofatitK、PermutitQ、IiwatitS100都屬于這種。特性：這種樹脂很穩(wěn)定，使用得當，經過幾百次交換，交換當量也改變不大。對各種試劑也較穩(wěn)定，如較長時間浸在5%氫氧化鈉、0.1%高錳酸鉀、過氧化氫水溶液、0.1M硝酸中也不會改變性能。不溶于水和一般有機溶劑，耐熱性也比其他樹脂好，必要時可以在沸水浴上l00℃左右處理。

2023/2/333②酚磺酸型樹脂是在聚乙烯樹脂出現(xiàn)以前就被廣泛應用的強酸性樹脂，可以用對羥基苯磺酸和甲醛縮合而成。國產樹脂中華東強酸陽42和國外產品AmberliteIR-100、IR-105、Dowex30、Zerolit215、ZeoKarb215、wofatitK、wofatitKS都屬于這種。這種樹脂一般為黑色，交換量比苯乙烯樹脂小，遇堿或氧化劑時，性能易變化。在不同pH的堿性溶液中離子交換的作用不同，因為有以上缺點，故應用范圍較小。

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(2)強堿型陰離子交換樹脂

(SAX)

電離程度不受溶液pH變化的影響，在pH1~14范圍內均能進行離子交換反應。2023/2/335

樹脂的母體和苯乙烯強酸性樹脂相同，區(qū)別在于母體上連結有季銨。國產樹脂中強堿性201（南開大學樹脂廠）、強堿性201×7（上海樹脂廠717）和國外產品NalciteSAR、Dowex1、Dowex2、AmberliteIRA-400、AmbertitelRA-410、AmbertiteXE-98、PermutitSⅠ、PermutitSⅡ、LewatitMⅡ、ZerolitFF等都屆于這種。這種強堿性樹脂對酸、堿和有機溶劑亦較穩(wěn)定，但在濃硝酸中不穩(wěn)定。游離型（OH型）比鹽型（Cl型）的耐熱性差，超過40-45℃就不穩(wěn)定，因此一般商品都是Cl型。2023/2/336

(3)弱酸型陽離子交換樹脂

(WCX)—COOH電離程度受溶液pH變化的影響很大，其交換能力隨溶液pH的下降而減少，在酸性溶液中幾乎不發(fā)生交換反應。所以羧酸陽離子樹脂的交換反應必須在pH＞7的溶液中才能正常進行，對酸性更弱的酚羥基樹脂，則應在pH＞9的溶液中才能進行反應。2023/2/337

含有-COOH

的樹脂，母體有芳香族和脂肪族兩種。脂肪族類型中用甲基丙烯酸和二乙烯基苯聚合的較多。芳香族類型的用二羥基苯酸和甲醛聚合的較多。國產樹脂中弱酸l0l×l28（上海樹脂廠#724）、弱酸性#10l（南開大學樹脂廠）和國外產品AmbertiteIRC-50、WofatitC、Zerolit226都屬于弱酸性陽離子交換樹脂。2023/2/338

(4)弱堿型陰離子交換樹脂

(WAX)

基團的電離能力弱，和弱酸型陽離子樹脂一樣，電離程度受溶液pH變化的影響很大，其交換能力隨溶液pH的降低而增大，在堿性溶液中幾乎不發(fā)生交換反應。所以交換反應必須在pH＜7的溶液中才能正常進行。2023/2/339

含有-NH2，＝NH，等基團的陰離子交換樹脂。國產樹脂中弱堿330（上海樹脂廠#701）、弱堿311×2（上海樹脂廠#704）、華東弱堿陰32l、弱堿性#301（南開大學樹脂廠）、弱堿性330（同1）和國外產品AmbertiteIR4B、WofatitM、wofatitN、LewatitM、Dowex3、FermutitW等都屬于此種。其基本結構如下。含有-NH-基團的堿性較強，含有—NH2或＝NH的堿性較弱。這種樹脂有黃、橙、黑等顏色。2023/2/340強性和弱性離子交換樹脂的區(qū)別：交換速度不一樣：強酸和強堿性樹脂交換快轉型時體積變化不一樣：強酸和強堿性樹脂由游離型轉為鹽型時，體積變化小，水洗容易達到中性；弱酸和弱堿性樹脂由游離型轉為鹽型時，體積顯著變化，水洗不容易達到中性；但是強酸性樹脂的由鹽型轉為游離型時需要大量的酸處理。2023/2/341二、填料1、配基和交換基團離子交換色譜法，在早期都采用高分子聚合物，如苯乙烯－二乙烯苯為基體的離子交換樹脂作固定相。因這種固定相具有膨脹性、不耐壓、表面的微孔型結構影響傳質速率，所以在高效液相離子交換色譜法中已被離子型鍵合相所代替。2023/2/342

最常見的離子型鍵合相是以薄殼型或全多孔微粒硅膠為載體，表面再經化學鍵合成各種離子交換基團。陰離子鍵合相常用強酸性磺酸型（－SO3H），而陽離子鍵合相常用強堿性季銨鹽型（－N+R3Cl-）。國產的離子化學鍵合相有YWG-SO3H、YWG-N+R3Cl-和YSG-SO3H、YSG-N+R3Cl-。2023/2/3432、填料的交換容量和吸附容量填料的柱容量：可用交換容量或吸附容量表示。（1）離子交換容量用單位量的填料含有可交換基團的數(shù)量表示。其單位：微摩爾/克（μmol/g）或微摩爾/毫升（μmol/mL）。（2）柱子吸附容量在特定色譜條件（動態(tài)或靜態(tài)）下，填料吸附某樣品組分的最大量。用mg/g、g/L或μmol/g、μmol/mL表示。吸附量是可變的：其值隨測定方法、流動相的成分和樣品的變化而變化。2023/2/344（3）交換容量與pH值的關系交換容量受溶液pH值的影響很大，特別是弱離子交換色譜填料。因為它們的交換基團需要在一定的pH值條件下才能完全電離，故受pH值的影響更大。見圖7-3。圖7-3PH值對交換容量的影響2023/2/345由圖可知：①強陽離子交換色譜填料pH＞1時才有明顯交換容量，pH大時，交換容量幾乎不再變化；而弱陽離子交換色譜填料pH＞6時才有明顯交換容量，且PH越大，交換容量越大。②強陰離子交換色譜填料，pH＜10時才能使用；而弱陰離子交換色譜填料，pH＜8時才有明顯交換容量，且PH越小，交換容量越大。由上可知，強陽和強陰離子交換色譜填料，具有比弱陽（陰）離子交換色譜填料更大的pH值使用范圍，能適應較多的化合物在不同的pH條件下進行分離或使用pH梯度進行洗脫，所以應用較廣。但是對于一些保留太強的樣品，選用弱離子交換色譜填料更方便些。2023/2/346三、IEC的保留機理（起主要決定作用的：靜電力）將交換基團和樣品分子近似地看作為兩個點電荷，它們之間的作用力F為：F=q1·q2/εr2式中q1、q2分別為兩個點電荷電量；ε為介質的介電常數(shù)；r為兩點電荷之間的距離。在IEC中，交換基團的大小及電荷在固定pH值條件下是不發(fā)生變化的，所以樣品組分與交換基團的作用力F隨樣品組分的帶電情況及作用距離的不同而變化。正是這種各組分與交換基團之間有不同的作用力而使它們得以分離。2023/2/347分析保留值大小在離子交換色譜中，如果流動相的pH值改變，就會改變樣品分子的電離平衡，從而改變樣品組分的帶電情況，使保留值發(fā)生變化。在陽IEC中，樣品組分應該帶有正電荷，多是由于樣品分子中含有各種氨基形成的正電荷。離解平衡：R-NHR′+H+

＝RN+H2R′而在陰IEC中，樣品分子應該帶負電荷，多是由于羧酸根或其他酸根離解形成的負離子。離解平衡：RCOOH＝RCOO-+H+可見，在陽IEC中，當pH值減小時(即H+濃度增大)，促使樣品組分形成更多的正電荷。這會使樣品組分對陽離子交換劑表面帶負電的交換基團親合力增加，使保留值增加。在陰IEC中，當pH值增大時(H+濃度減小)，促使樣品組分上酸根的離解，形成更多的負電荷，因而使樣品組分對陰離子交換劑表面帶正電的交換基團親合力增加，使保留值增加。2023/2/348問題：當樣品為蛋白質時，分析蛋白質在陰、陽離子交換色譜中，PH值改變對保留值影響。注意：在選擇弱陰、陽離子交換填料時，既要考慮填料在一定PH值下的離解度（PH越?。篧AX離解度越大，WCX離解度越?。?，又要考慮在一定PH值下流動相的保留值（PH越?。宏朓EC中保留越小，陰IEC中，保留越大）。這兩個是矛盾的。∴在選擇條件時要注意，特別是流動相PH的確定。對于兩性蛋白質無上面的注意事項，陽離子不行就選陰離子交換填料。2023/2/349圖7-4蛋白質的保留值(●)與其表面純電荷(▲)及流動相PH的關系示意圖2023/2/350四、離子交換色譜條件的選擇▲樣品在溶液中能形成離子，則首選離子交換色譜。1、柱子的選擇△離子交換色譜的柱子的選擇比其他色譜法更復雜。因為交換基團有四種類型。樣品的離解也有不同方式，所以要根據(jù)樣品和實驗室條件選擇適用的柱子。選擇柱子時可遵循下列原則：（1）根據(jù)實驗室條件和實驗要求△定性、定量還是分離?！鞣治鲂椭樱簝葟?－8mm,長度5－25cm,流速0.5-3ml/min。(定性、定量用硬基質填料)△分離可以用高分子球基質。2023/2/351(2)按照樣品的性質含有各種氨基（-RNH2，-NHR，-NR2）的組分，可在溶液中接受質子，形成正離子，所以要用陽離子交換色譜柱子分離。含有各種羧基的化合物，可以在溶液中放出質子，形成負離子，所以要用陰離子交換色譜填料。等電點PI值大的蛋白質，易形成陽離子，可優(yōu)先選用陽離子交換色譜；等電點PI值小的蛋白質，易形成負離子，可優(yōu)先選用陰離子交換色譜。2023/2/352一般小分子，選一般填料。而蛋白質等分子量很大的化合物，選用大孔徑填料(常用內孔徑在25-50nm)。(3)填料孔徑的選擇2、流動相選擇鹽＋水組成的溶液。（鹽溶于水以后形成的離子作為樣品組分的頂替離子）洗脫強度：由頂替離子的濃度定。濃度越大，洗脫能力越強。對樣品及儀器無損害。例：NaCl作為流動相時，Cl－對不銹鋼有腐蝕性，要控制使用。2023/2/353對樣品溶解度無影響。所以常用具有緩沖作用的鹽梯度洗脫：鹽濃度由弱→強。改變洗脫強度可以濃度梯度或PH梯度。3、檢測條件的選擇參見反相色譜部分。4、其他條件的選擇操作溫度一般選用室溫，2023/2/354五、影響離子交換的有關因素1、溶液的酸堿度交換溶液中氫離子的濃度顯著增高時，會抑制陽離子交換基團的電離和目標離子的交換反應。通常強酸性交換劑交換液的pH應大于2。弱酸性交換劑的交換液pH應在6以上。同樣在陰離子交換劑中，強堿性交換劑的交換液的pH應在12以下，弱堿性應在7以下。2023/2/3552、目標離子的交換性能：主要取決于母體化合物的解離、目標離子的電荷、半徑及酸堿性的強弱。解離常數(shù)大，酸堿性強者置換容易，但洗脫相對來說較難。離解離子價數(shù)愈高，電荷愈大，則它的引力愈強，愈易交換在交換樹脂上。堿金屬、堿土金屬及稀土元素還與它們的原子序數(shù)有關，堿金屬原子序數(shù)大，則交換吸附就強，稀土元素的原子序數(shù)小，其交換吸附強。2023/2/3563、被交換物質在溶液中的濃度離子交換操作通常是在水溶液或含有水的極性溶劑中進行，這樣有利于離解與交換。濃度越低，離子交換劑的選擇性大。濃度過高，將降低物質的解離，有時會影響吸附次序及選擇性。另外，還會引起樹脂表面及內部交聯(lián)網(wǎng)孔收縮，影響離子進入網(wǎng)孔。所以一般實驗操作時所用溶液的濃度應該略稀，有利于提取分離。2023/2/357

4、溫度的影響溫度的改變對稀溶液的離子交換性能影響不大，但在0.1mol/L以上濃度時，溫度升高對水合傾向大的離子容易交換吸附。同時離子的活性系數(shù)增大，對弱酸、弱堿交換劑來說其交換率有較大的影響。一般溫度增高，離子交換速度加快，在洗脫時亦可提高洗脫能力。但對不耐熱的交換劑應注意提高溫度的條件，避免引起交換劑的破壞。

5、溶劑的影響通常在水中進行交換，亦可采用含水溶劑，但在極性小的溶劑中難以進行或不進行交換，同時還導致離子交換的選擇性的降低或消失。2023/2/358陽離子交換樹脂臨界溫度陰離子交換樹脂臨界溫度華東強酸陽42華東強酸陽42Na型95℃H型40℃華東弱堿陰32150℃AmberliteIR-120

Na型120℃H型100℃AmberliteIRA-400AmberliteIRA-400Cl型90℃OH型49℃AmberliteIR-120Na型120℃AmberliteIRA-410andAmberliteIRA-411Cl型82℃OH型40℃AmberliteIRC-50Na型120℃Dowex50Na型120℃H型150℃Dowex1andDowex2Cl型100℃OH型50℃Dowex50Na型95℃表1離子交換樹脂干燥的臨界溫度2023/2/359六、樹脂的預處理及再生（1）樹脂的選擇與準備：選擇樹脂類型時，首先必須了解其性能如交換量的大小、顆粒大小、耐熱性、酸堿度，然后進行預處理。普通的樹脂，粒子都較大，大部分是35—20目（0.49—0.83毫米），亦有50目，可作為植物成分的粗提及初步劃分，但不適用子離子交換層析。離子交換層析一般需要較細的樹脂，因此需要把它干燥，粉碎后，過篩或利用浮選法進行選擇。

2023/2/360（2）預處理除去可溶性小分子有機物和鐵、鈣等雜質。首先把新樹脂浸在蒸餾水中1～2d，使它膨潤后，裝在層析管中，按下法處理：①強酸性陽離子交換樹脂的預處理：新樹脂一般是Na型。先用樹脂體積的20倍的2mol/L鹽酸以1ml/(cm2·min)左右的速度進行交換，使它變?yōu)镠型后用水洗到流出液呈中性，然后用樹脂體積的l0倍量的1mol/L氫氧化鈉（或食鹽）進行交換，使它變?yōu)镹a型。再用水洗到流出液不含Na為止（焰色反應無黃色）。再重復一次鹽酸→氫氧化鈉（或食鹽）處理。最后用樹脂體積的10倍量的lmol/L鹽酸進行交換，使它變?yōu)镠型，然后用蒸餾水洗到流出液呈中性為止。2023/2/361

②強堿性陰離子交換樹脂的預處理：

新樹脂一般呈Cl型，依次用樹脂體積的20倍的1mol/L氫氧化鈉溶液（使它變?yōu)镺H型）洗滌→樹脂體積的10倍量的水洗滌→用樹脂體積的lO倍量的lmol/L鹽酸溶液洗滌（使它變?yōu)镃l型）→用蒸餾水洗至流出液近中性為止。再重復一次氫氧化鈉→鹽酸處理。最后用樹脂體積的10倍量的1mol/L氫氧化鈉溶液進行交換，使它變?yōu)镺H型。OH型樹脂容易吸收空氣中二氧化碳，因此保存時要注意，臨用時把C1型的樹脂變?yōu)镺H型較好。2023/2/362③弱酸性陽離子交換樹脂的預處理：新樹脂一般是Na型。依次用樹脂體積的l0倍量的lmol/L鹽酸溶液（使它變?yōu)镠型）→用水洗到流出液呈中性為止→用樹脂體積的10倍量的lmol/L氫氧化鈉溶液（使它變?yōu)镹a型，此時體積膨脹）→用樹脂體積的10倍量的水洗滌至中性。如果流出液仍然呈弱堿性。再重復一次鹽酸→氫氧化鈉處理。最后用樹脂體積的10倍量的1mol/L鹽酸溶液使它變?yōu)镠型。用水洗到中性。2023/2/363④弱堿性陰離子交換樹脂的預處理：新樹脂一般是Cl型。預處理與強堿性陰離子交換樹脂基本相同。變?yōu)镃l型后，用水洗滌時因為水解的關系不容易洗到中性。一般用樹脂體積的l0倍量水洗滌就可以。除鹽酸外有時也用硫酸，也可用氯化銨代替氯化鈉。交換終點可以用以下方法來判定。請參考下表。2023/2/364交換前試劑交換后交換終點的判斷方法NaRHRNH4RHRRClROHR2SO4HClNH4ClNaClNaOHNaOHH2SO4NaClHRNH4RNaRNaRROHR2SO4RClNa的火焰反應甲基紅等酸性指示劑奈氏試劑檢測銨離子酚酞硝酸酸化，硝酸銀檢測氯離子甲基紅等酸性指示劑氯化鋇檢測硫酸根離子表2樹脂預處理終點交換點的判斷2023/2/365（3）再生：

用過的樹脂，如還要交換同一種樣品，把鹽型變?yōu)橛坞x型即可。如要交換其他樣品，要用預處理的方法再生。不用時加水，保存在廣口瓶中。若遇耐熱性離子交換樹脂，則可在加溫條件下處理，市售商品往往是濕的，若遇到干燥狀態(tài)的樹脂時，不要馬上加水，這樣易引起龜裂，影響物理性能。可先加飽和氯化鈉濕潤后再按前述方法處理或再生。2023/2/366七、實驗技術關于樹脂量、層析管的粗細、展開溶劑量和流速的關系，可以參考下表。

柱子直徑cm柱子高度cm樹脂量干燥品/g粒子的目數(shù)洗脫劑量/ml0.15MNH3流速ml/min7.65.13.82.51.71.20.86141302013.69.66.4110033513541124.21.360～8060～8080～10080～10080～10080～10080～1203000095003900120034012070

40201041.50.5表3酚磺酸型陽離子交換柱的操作條件2023/2/367表4苯乙烯強酸型陽離子交換柱的操作條件

柱子直徑cm柱子高度cm樹脂量干燥品/g粒子的目數(shù)洗脫劑量/ml0.15MNH3流速ml/min7.65.13.82.51.71.20.846312315107.24.88302551063093.21.060～8060～8060～8060～8060～8080～100100～12058000175007300210062022070

502512620.62023/2/368表5強堿性陰離子交換柱的操作條件

柱子直徑cm柱子高度cm樹脂量干燥品/g粒子的目數(shù)洗脫劑量/ml0.15MNH3流速ml/min3.82.51.71.20.82315107.24.8100288.33.00.9100～200100～200250～500250～500250～50037001000310111337.53.01.50.750.332023/2/369

裝柱：把樹脂放在燒杯中，加水充分攪拌，將氣泡全部趕掉。放置幾分鐘使大部分樹脂沉降，傾去上層浮粒和微粒，反復上述操作到上層液透明為止。粒度小的樹脂，攪拌后要放置稍久，因為較難沉降。如果急于倒水，往往損失較大。將準備好的樹脂，加少量水攪拌后一次性倒入保持垂直的層析管中，使樹脂沉下，讓水流出。注意不要讓氣泡進入樹脂中。

2023/2/370加樣：加樣時要注意不要把樹脂沖散。放一塊玻璃浮球或一層玻璃絲即可。樣品量與樹脂量的比例：每一種樹脂都有一定的交換容量（1克干燥樹脂理論上能交換樣品的毫克當量數(shù)），如國產弱堿330樹脂的交換當量為9（毫克當量／克），強堿2014為3.5，強酸1×7為4.5等。強酸l×7的4.5毫克當量／克，就是說這種樹脂的l克能夠交換丙氨酸89.09×4.5毫克（注：丙氨酸的分子量為89.09）。如果用陽離子交換樹脂，樣品可以加到全交換當量的l/2。用陰離子交換樹脂，樣品可以加到全交換當量的l/4～1/3。樣品和樹脂量的關系：要注意柱子上的吸收帶長度不超過層析柱長度的1/10。

2023/2/371八、離子交換法的應用

離子交換法可用于分離氨基酸、肽類、生物堿、有機酸、酚類等天然化合物。①常用于有效部位的分離：一般可用水提取液通過強酸性（磺酸型）樹脂，再通過強堿性（季銨型）樹脂，分別洗脫，分成酸性、中性、堿性部位。

②生物堿的分離：可用強酸性樹脂從中草藥水浸液或稀酒精提取液或酒精提取部分的水溶部位直接交換生物堿，用氨水或氨性酒精洗脫，所得部位，再用其他分離手段分離。此法由于樹脂可反復使用，特別對水溶性生物堿的提取分離，較經典方法有利。③用于有機酸及酚性物質的提取分離：④氨基酸的提取分離：一般利用不同pH的緩沖液梯度洗滌達到分離目的。2023/2/372§7-5排阻色譜法（SEC）凝膠色譜法是上世紀60年代發(fā)展起來的一種分離分析技術，有多種名稱如凝膠色譜分子篩色譜尺寸排阻色譜等使用的固定相是凝膠。凝膠是具有許多孔隙的網(wǎng)狀結構的固體，有分子篩的性質。2023/2/373

一、基本原理當被分離物質的分子大小不同時，能夠進入到凝膠內部的能力也不同。凝膠中的孔隙大小與分子大小有相仿的數(shù)量級。當混合物通過凝膠時，比孔隙小的分子可以自由進入凝膠內部，而比孔隙大的分子就不能進入，因此在移動速度方面就出現(xiàn)差異，從而使不同相對分子質量的各組分得到分離。2023/2/374圖7-5凝膠色譜法的原理2023/2/375其分離原理可用下式表示：VR=V0+kViVR：保留體積（洗脫體積）V0：柱床內存在于凝膠外面的水相體積—外水體積Vi：凝膠顆粒內部所含的水相體積—內水體積k：分配系數(shù)2023/2/376

被分離物質分子很大，被完全排阻于凝膠顆粒之外：VR=V0，k=0；被分離物質分子很小，能完全自由進入凝膠顆粒內部：VR=V0+Vi

，k=1

中等大小的分子，只能達到部分凝膠顆粒內部：V0＜VR

＜V0+Vi

，0＜k＜1二、凝膠的種類具有分子篩效應的凝膠，主要有葡聚糖（商品名為Sephadex）、瓊脂糖（商品名為Sepharose）聚丙烯酰胺凝膠（商品名為Bio-gel）及具有一定網(wǎng)眼的玻璃珠。還有這些凝膠的衍生物。最常用的是葡聚糖凝膠。2023/2/3771.親水性凝膠

(1)葡聚糖凝膠蔗糖發(fā)酵→葡聚糖（

-1,6-苷鍵）→交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷與葡聚糖發(fā)生交聯(lián)反應→生成多孔性網(wǎng)狀結構的葡聚糖凝膠(其結構見下頁)

（商品名：Sephadex）。環(huán)氧丙烷是引入甘油基將各個多聚葡萄糖單位交聯(lián)起來，凝膠網(wǎng)眼的大小由多聚葡萄糖的分子量和制備時環(huán)氧氯丙烷的用量決定的。2023/2/3782023/2/379葡聚糖的特性與類型：親水性較強，在水和電解質溶液中膨脹成為柔軟而富于彈性的膠體。其吸水能力與葡聚糖凝膠的交聯(lián)度有密切關系。交聯(lián)度大的，孔徑小，吸水少，膨脹的程度?。唤宦?lián)度小的，孔徑大，吸水多，膨脹的程度大。因此，葡聚糖孔徑大小可以其吸水量的大小來表示，常以G-10至G-200號碼標記。G后面的數(shù)字是其吸水量（mL·g-1干膠）乘以10所得的值。如G-25即表示吸水量為2.5。市售有G-10、G-12、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、G-200等型號。G-75以上的凝膠因吸水量大，膨脹后形態(tài)柔軟易變，統(tǒng)稱為軟膠。G-75以下的稱為硬膠。2023/2/380表6交聯(lián)葡聚糖的性質2023/2/381凝膠層析是一種物理分離法。葡聚糖基本上不帶電荷、呈惰性，不與被分離的物質發(fā)生反應，所以分離的效果較好。然而由于是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量的活性羥基，能吸附少量蛋白質等被分離的物質。為了克服這個缺點，一般使用含有離子強度達0.08的NaCl等中性鹽作洗脫液。（2）其它

聚丙烯酰胺凝膠（Bio-gel）、瓊脂糖凝膠（Sepharose）等，適合于分離分子較大和不溶于水的化合物。2023/2/3822.疏水性凝膠在交聯(lián)葡聚糖凝膠分子上引入一個基團，增大其親脂性，便得到疏水性凝膠。例如，在SephadexG-25分子上引入羥丙基（ROH→ROCH2CH2CH2OH），得到疏水性凝膠：葡聚糖凝膠LH-20，既有親脂性又有親水性，可用于分離酯類化合物、類固醇等。2023/2/383

三、操作方法

1.凝膠的選擇

一般根據(jù)凝膠的分離范圍進行選擇。如果分離相對分子質量相差懸殊的組分：例如脫去蛋白質溶液中的鹽類，可選擇型號較小的凝膠（G-10，G-15，G-25），顆粒為100~150目。分離相對分子質量比較接近的組分，凝膠顆粒要細（200目）且大小要近乎均一。

2.裝柱凝膠→用水或緩沖液浸泡使其充脹→用流動相浸泡→裝柱2023/2/384（1）凝膠溶脹（水化）商品葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠均為干燥顆粒。使用前必須水化溶脹。商品瓊脂糖凝膠呈懸浮膠體可直接使用，玻璃珠無需溶脹。凝膠溶脹有兩種方法：室溫溶脹沸水溶脹注1：各種葡聚糖凝膠在兩種溶脹方法中所需的時間不同。必須浸泡足夠的時間以便凝膠充分溶脹。兩種方法中，沸水溶脹不但節(jié)省時間，還可以殺滅凝膠中污染的細菌并排除氣體。2023/2/385注2：凝膠溶脹后，需用蒸餾水洗滌幾次，每次應將沉淀緩慢的細小顆粒隨水傾去，以免在裝柱后產生阻塞現(xiàn)象，降低流速，洗滌后將凝膠浸泡在洗脫液中待用。柱子大小和凝膠用量的確定：稱取1g所需型號的葡聚糖干膠，放在5mL的量筒中，用室溫溶脹的方法充分溶脹，觀察溶脹后凝膠的體積。然后在層析柱中加水到所需的柱床高度，將水倒出，量取體積。根據(jù)1g干膠溶脹后的體積和所需柱床體積，即可推算出干膠的需要量。2023/2/386（2）裝柱子裝柱的操作過程如下：將層析柱垂直固定在鐵架上，打開柱下口開關。將溶脹好的凝膠放在燒杯中，使凝膠表面的水層與凝膠體積相等。用玻璃棒攪勻凝膠液，順玻璃棒灌入柱內。此時柱下口一邊排水，上口一邊加入攪勻的凝膠，可見凝膠連續(xù)均勻地沉降，逐步形成凝膠柱。當?shù)竭_所需凝膠高度時，立即關閉下口，使凝膠完全沉降。凝膠柱一般離柱頂3—5cm，以覆蓋一層溶液。2023/2/387柱子、凝膠類型、用量和上樣量的關系：凝膠層析中，在把小分子物質（MW<1500），如無機鹽或其它物質與大分子物質（MW>20000）分離時，層析柱的體積一般約為樣品的4—10倍，高度與直徑的比例為5∶1至15∶1之間。這類柱也稱為“脫鹽柱”。常用網(wǎng)眼很小的凝膠如G-25。用以將生物大分子物質彼此分開的分級層析柱，體積應為樣品體積的25—100倍。柱長度與直徑的比例為20∶1—100∶1。2023/2/388裝柱操作注意事項：灌注凝膠時要求將均勻的凝膠一直加到所需柱床高度，不能時斷時續(xù)，否則將出現(xiàn)分層或“紋路”等毛病。若出現(xiàn)這些現(xiàn)象，可以用玻璃棒將已經形成的柱床逐步攪起，直至出毛病的地方，再繼續(xù)加入攪勻的凝膠懸液。若在罐好凝膠后才發(fā)現(xiàn)“紋路”、分層等現(xiàn)象時，要重新裝柱，以免影響層析效果。在做大型的凝膠柱時，灌注的凝膠是否均勻往往從表面上看不出來。所以使用前應用一些帶色的大分子物質如細胞色素C、血紅蛋白或專用的藍色葡聚糖—2000（Bluedextran-2000）通過凝膠柱，以檢查形成的帶色斑帶是否整齊，若斑帶歪斜，應該重新裝柱，直至達到要求。2023/2/389注1：剛從冰箱中取出的凝膠液，不能馬上用來灌柱，應平衡至室溫后再用，不然裝好的凝膠柱會產生大量的氣泡影響層析。注2：在整個灌注凝膠的過程及使用中，凝膠柱面上一定要覆蓋著一層溶液，以免進入空氣。若進空氣，在加入溶液時，凝膠柱中易形成氣泡。注3：裝好的凝膠柱，使用時應該用相當于柱體積兩倍或更多的洗脫液流過洗脫柱，以壓實凝膠。2023/2/3903、上樣上樣時，應該注意上樣量的多少，樣品的粘稠度及離子強度。這三個因素會影響到以后層析的效果。一般來說“脫鹽”層析時，上樣體積可為柱體積的10%—25%；生物大分子的分級分離，約為柱體積的1%—5%。樣品的粘稠度一般不宜大于洗脫液粘稠度的2倍以上，不然洗脫峰會變寬和歪斜。離子強度要達到0.08，以免產生機械性吸附。2023/2/391上樣操作：打開層析柱的下口開關，放出凝膠柱面上的多余溶液，或用橡皮頭吸管吸取，使液面與凝膠表面相平齊。將樣品加在凝膠表面，打開下口開關，控制流速，使樣品慢慢滲入凝膠內。當慢慢滲入凝膠的樣品溶液面與凝膠柱面相平齊時，關閉下口，完成上樣。然后在凝膠柱面上加一層（3—5cm）洗脫液，接上洗脫瓶準備洗脫。注1：切忌液面低于凝膠表面注2：勿將凝膠柱面沖起形成凹面，也不能沿管壁流下，以免樣品沿柱壁與凝膠的間隙漏下。2023/2/3924、洗脫（等濃度洗脫）

洗脫過程中保持恒定的流速是獲得良好分離效果的重要條件。因為凝膠層析的分離作用主要取決于分子擴散進入凝膠的機會，流速過快有些分子來不及在分子篩中分配而流出；過慢時已分離的分子會因擴散而混合。因而要保持適當?shù)暮愣魉?。洗脫液的流速取決于它的靜水壓（指洗脫液的液面高出層析柱出口液面的高度）（或接觸空氣的兩個液面間的高差）。靜水壓越大，流速就越快。實驗室通常用馬氏瓶來控制流速，注意不要讓瓶中的液面低于玻璃管的下口。2023/2/393圖7－6恒壓洗脫裝置2023/2/394注1：對于G-75以上的軟膠來說，每種凝膠都有自己的所能承受的最大靜水壓，如果靜水壓超過凝膠的承受能力，凝膠將發(fā)生變形而被壓緊，流速也會隨之降低。注2：用試管分步收集色譜柱的流出液，分別測定各管光密度，并以其為縱坐標，以收集管的順序號為橫坐標，在坐標紙上繪圖，獲得具有洗脫峰的曲線即洗脫曲線（圖7-7）。相鄰峰交叉越少表明分離效果越好。2023/2/395圖7-7洗脫曲線示意圖2023/2/3965、凝膠的洗滌與保存再生：①一般只要用洗脫液沖洗后即可連續(xù)使用。若凝膠顆粒沉積壓緊，流速減慢，則需倒出，清洗后重新裝柱。②有微量污染可用0.9mol/L氫氧化鈉（內含0.5mol/L氯化鈉）處理沖洗，再用水洗至中性。③凝膠色澤改變，流速降低，表面有污染物等時，常用溫熱（50℃左右）的0.5mol/L氫氧化鈉和0.5mol/L氯化鈉混合液浸泡，再用水洗凈。短時保存：可浸泡在溶液中，存放在4℃冰箱中。若放在室溫保存應加入0.02%疊氮化鈉（NaN3）或0.01%乙酸汞等防腐劑，以防發(fā)霉。用時以水洗去防腐劑即可使用。長期保存：可用水洗凈，分次加入百分濃度遞增的乙醇脫水，最后再用乙醚除乙醇，烘干即可。2023/2/397四、應用

特適合于大分子量的聚合物、蛋白質、核酸等的分析。對樣品要求：可溶于流動相中。

1.脫鹽

25克固體葡聚糖凝膠+0.05MpH=7.2的Tris緩沖液（2-氨基-2-羥甲基-1,3-丙二醇-鹽酸緩沖液）→充脹→裝柱（待脫鹽的蛋白質溶液體積=1/5柱床體積）→加樣→用上述緩沖液洗脫→紫外分光光度計（

=280nm）檢測洗脫下來的蛋白質。2023/2/3982.酶解產物在SephadexG-50柱上的預分級分離

一種普通的蛋白質如果通過一些特異酶或化學方法進行降解，則會生成相當復雜的肽混合物。為了進行結構研究，必須分離和純化“粗”水解產物中構成多肽鏈的所有肽，這是件非常復雜的工作。因此，“粗”水解產物必須進行預分級分離。在現(xiàn)代方法中，凝膠過濾最適于此種目的。2023/2/399

將凝膠與4份0.01mol／L氨水溶液在室溫攪拌30min，然后沉降，傾去細顆粒的上層液。沉降的葡聚糖凝膠G-50再與約3份0.01mol／L氨水溶液攪拌并倒入柱中。柱用5倍與床體積的0.01mol／L氨水溶液洗滌。將200mg被分離物質溶于3~5ml0.01mol/L氨水溶液中，讓樣品慢慢吸入凝膠柱中，用0.01mol/L氨水溶液洗脫，流速250~300ml／h，收集各管在紫外280nm處有吸收的洗脫液，合并，冷凍干燥。22023/2/3100§7-6高效液相色譜的實驗技術一、柱技術液相色譜柱是色譜的關鍵部件，應該了解柱子結構、填料性質、裝柱操作和保養(yǎng)維持技術。1、裝填（用“高壓勻漿法”裝填）（1）裝柱機的準備高壓勻漿法裝柱的裝填機及配套流程見圖7-8。

圖7-8色譜柱的高壓勻漿法裝填2023/2/3101（2）柱子的清洗：有兩種清洗法可供選擇。一是有機溶劑清洗法，柱子依次用二氯甲烷、丙酮、水洗洗干凈。二是酸洗法，把柱頭及柱管放在1：1的硝酸中超聲20-30min，再用清水超聲處理幾次，至洗滌的水顯中性。（3）裝柱條件的選擇：裝柱條件主要是裝柱壓力(是使用壓力的幾倍)、裝柱時間(在20-60min之間)、勻漿的體積(隨機附有勻漿管)等。（4）勻漿的配制：裝柱的填料要用一定的溶劑使其分散制成勻漿。裝反相色譜柱常用四氯化碳和二氧六環(huán)（約2：1）。裝流動相是鹽水溶液的填料可用異丙醇。2023/2/3102方法：先稱取所需填料量的1.1-1.2倍，加入與勻漿管體積數(shù)相等量的分散溶劑，超聲2-3min，使填料分散均勻，并盡可能地趕去填料孔內氣泡。將清洗過的柱子一頭柱頭裝好，另一頭柱頭卸下，將柱子裝在勻漿管上，然后將勻漿從超聲器上取出倒進勻漿管。此時，勻漿應充滿整個勻漿管。接上管子后馬上開泵裝柱。（5）裝柱：裝柱過程中不能停頓，以免裝填不勻。方法：裝柱時間到了以后，不能馬上拆下柱子。應關閥門，然后等待5-20min，讓柱內壓力自然降低，柱子出口不再滴液時方可拆下柱子，裝上柱頭。并擰上兩頭的密封螺絲。2023/2/31032、柱子的保養(yǎng)柱子不用時，用不會長霉菌的液體充滿柱內，并擰緊兩頭密封螺絲。常用的封存液有：甲醇、50%甲醇、萬分之二的疊氮化鈉水溶液。3、柱子堵塞的處理柱子堵塞經常是柱子入口端篩板被雜質堵塞。可以拆下入口端柱頭，用可以溶解雜質的溶劑超聲或煮沸處理；也可以用1：1的HNO3煮30min。4、柱子填料凹陷打開柱頭，用同種填料在濕潤下填平即可2023/2/3104二、洗脫方式洗脫方式有三種：等濃度洗脫、梯度洗脫、脈沖洗脫。等濃度洗脫：是流動組成、pH值、流速不變化的洗脫方式。（使用示差檢測器時，or在排阻色譜中，只能使用等濃度洗脫。）梯度洗脫：在一次分離中用改變流動相組成或pH來逐步增加流動相洗脫能力的洗脫方式。（梯度洗脫用兩種洗脫液，分A液和B液。A液洗脫能力弱，B液洗脫能力強。洗脫開始時用A液，然后根據(jù)梯度洗脫程序自動向流動相中添加B液，增大洗脫強度。）（使用紫外檢測器和熒光檢測器時的反相色譜和離子交換色譜中可以使用梯度洗脫。一般，在樣品組分較多，組分之間容量因子K′或保留時間相差大時，應該使用梯度洗脫，否則保留強的溶質峰太寬或者某些峰分離不開。）脈沖洗脫：用一段少量的洗滌劑，讓它象一條密集的脈沖帶流過柱子，以洗下某個特定物質。（這種方法適用于很昂貴洗脫液，須在柱子平衡、上樣、洗滌后使用。）（親合色譜中使用）2023/2/3105三、流動相（1）流動相的作用①樣品組分能溶解在其中，隨流動相流出柱子。②流動相參與了分離過程。除了排阻色譜外，流動相中的強洗脫劑與樣品組分對配基有一個競爭作用，它會把樣品組分從配基上頂替下來，即解吸作用。另外，改變流動相的組成不僅可以改變洗脫能力、分離度和選擇性，還會影響某些生命活性物質的活性回收率。（2）流動相的選擇遵循以下原則：①樣品組分能溶于流動相并不起化學反應。②對儀器無腐蝕作用。對人無毒害。③對柱填料無破壞作用，如硅膠基質的填料，流動相pH值應在2-8之間，否則會破壞填料。④要考慮與色譜方法和檢測器配套。2023/2/3106四、分離模式的選擇依據(jù)是：實驗室條件、樣品組分的理化性質、分離目的和要求三方面。色譜分離模式選擇參考圖。P212（3）流動相的處理①流動相若不純，則要作純化處理。方法：水要用去離子水或蒸餾水。有機溶劑常要先作化學處理后重蒸。鹽要重結晶除去一些有害的重金屬離子。②配制好的流動相應作過濾和脫氣處理。過濾時用孔徑0.2μm的膜，除去機械雜質。脫氣處理有超聲、抽真空、回流三種方法，以除去溶液中的氣體。國外還常用He氣，使流動相的瓶中保持一定的He氣分壓作為脫氣的一種手段，因代價高，國內不常用。2023/2/3107色譜分離模式選擇參考圖有機磷酸脂、脂溶性維生素、農藥、芳烴、單糖、二糖類脂類、甙衍生物、脂溶性維生素、多環(huán)芳烴核苷酸、核酸堿、低聚核苷酸、聚胺、氨基酸、抗體、甾體軛合物、止痛藥人血清蛋白、胚胎、牛血清蛋白、合成高聚物、蛋白、糊精血紅蛋白蛋白LDH同功酶蛋白、多糖、核酸、肌紅蛋白、溴化氰裂解物應用農藥、肽、兒茶酚胺、PTH氨基酸、核苷酸、甾類、氨基酸、抗體、類黃酮、有機酸2023/2/3108

§7-7高效液相色譜的應用

一、制備分離用HPLC進行制備分離，其性能遠比氣相色譜優(yōu)越。可用于制備純品（只分離不分析）或氣相色譜的前處理（HPLC-GC聯(lián)用）。使用內徑為8mm的色譜柱，可制備mg級純品，用于結構測定，也可作為HPLC純的試劑，為GC提供標樣。2023/2/3109（1）制備色譜分類類型用途柱子內徑(mm)長度(cm)填料粒度(μm)流動相流速(ml/min)上樣量分析色譜定性、定量分析2－55－255－8＜2＜1mg半制備型制備小量純樣品5－2015－5010－252－205－100mg制備型制備克級樣品20－5020－7020－5015－1500.1－10g工業(yè)制備型幾十克以上樣品幾十到幾百＞100＜幾十克2023/2/3110（2）分析型和制備型色譜的差別①分離樣品量不同。分析型不超過1mg。制備型至少進樣幾毫克以上。②柱子大小及儀器不同。制備：用大柱子和制備色譜儀。③分離目的、要求不同。色譜分離三個指標，即分離度、分離速度和樣品負荷量。這三者是互相關聯(lián)的。分型型色譜中，在極短的時間內得到高分離度，不考慮分離量，因為其目的是要得到樣品的組成及含量的數(shù)據(jù)。制備色譜中，目的：得到純度高的某物質，并且往往要求盡可能地減少成本。要求：分離度是以保證純度為標準，分離量在保證純度的情況下越大越好。2023/2/3111④分析型色譜—

線性色譜：柱子不過載。樣品組分的保留值（K′）和柱效（η）不隨樣品量的變化而改變。K′與流動相相流速無關，分離度（Rs）和塔板數(shù)（n）與流速有關。峰形與樣品量無關，但峰面積與樣品量成正比。制備色譜—有兩種情況。一是柱子不過載，與分析型色譜有類似的現(xiàn)象；二是柱子過載，這就是非線性色譜。在柱子過載后，K′、n隨樣品量的變化而變化（樣品量增大，K′減小,n增大)。流速對分離度和塔板數(shù)的影響較小。 ⑤分析型色譜不收集組分洗脫液，制備色譜中要收集有關產品的洗脫液。2023/2/3112（3）不同混合樣品的制備方法在制備色譜中，主要考慮：保證產品純度、降低消耗。在一個混合樣品中，需要制備的組分常有如下三種情況，并應采取不同方法分離制備。如圖7-9。欲分離制備組分是一個主要組分欲制備組分有兩個主組分被制備的組分是微量組分圖7-9制備色譜中被制備組分的三種組成情況2023/2/3113第一種情況，欲分離制備的組分是一個主要組分，如圖7-9的（a）。①通過改變容量因子K′，相對保留值α和增大塔板數(shù)n來提高分離度Rs（圖7-10中a、b）。②增大進樣量直到柱子的負荷極限，但要保證使待分離組分與其他K′接近的組分有良好的分離。此時可以收集待分離的組分。③進一步增大進樣量，柱子在過載的情況下運行，甚至會發(fā)生峰的重疊。此時應按中心切割法收集洗脫液（見圖7-10中的d）。圖7-10獲得主組分最大制備量的途徑2023/2/3114第二種情況欲制備組分有兩個主組分，并且K′較接近。制備方法：兩次分離。①初次制備時，暫不考慮分離度，在制備柱大量過載的情況下，按“中心切割法”收集含這兩個組分的峰的洗脫液（見圖7-11中b）。②將收集液在盡可能高的分離度的條件下再次分離，收集流出液，并檢驗各自的純度（見圖7-11中的c）。圖7-11K’相近物質對的最佳分離2023/2/3115③對于兩個分離不完全的組分，可按下圖切割收集。兩峰的兩頭，可以得到高純物質。而中間部分是兩個物質的混合物，應再作分離（見圖7-12）。圖7-12兩個不完全分離的組分的收集2023/2/3116第三種情況，欲制備的組分是微量組分。圖7-9中的c①按第一種情況①②，選擇最佳分離度，在柱子負荷的極限時，可觀察到該組分的存在（見圖7-13），②在過載的情況下，收集該組分的對應洗脫液。③將收集液濃縮，再在最佳分離度情況下再一次分離制備和收集該組分。圖7-13微量組分的制備

制備樣品中，分離時絕不止這三種典型的情況，所以在根據(jù)實際制定合適的分離方案。2023/2/3117

二、樣品前處理

HPLC色譜柱的柱頭易被污染，被測樣品一定要嚴格進行前處理。提取后一般用薄層色譜或柱色譜進行預分離，再用預處理柱進一步去雜質。HPLC一般不需要制備衍生物，但：

1.為使樣品中的各組分能被檢測器檢出，需制備衍生物。例如：分析脂肪酸或氨基酸時，若用UVD檢測器，要用對硝基苯甲酰氯與試樣反應，生成酯類化合物，使其在紫外光下有吸收。

2.對不易分離的強極性有機物，例如脫落酸，可進行酯化，以提高分離效果。2023/2/31181、HPLC在不同領域的主要應用三、HPLC的應用及實例2023/2/31192、應用實例例1高效液相吸附（正相）色譜分離皮質甾類化合物①分析型：吸附劑：硅膠（粒徑0.04mm），玻璃柱的內徑2mm、長300mm。洗脫液：甲醇－氯仿，線性梯度，流速1ml/min。檢測器：紫外光（240nm）檢測。壓力：3.4-4.08MPa，樣品量：278μg。皮質甾類混合物的高效液相吸附色譜分離被分離物質：1－11－脫氫皮質甾酮2－皮質甾酮3－皮質酮4－皮質醇Q－脫氧皮質甾酮S－11－脫氧皮質醇aldo－醛固酮2023/2/3120②制備型分離三個皮質甾體人工混合物吸附劑：硅膠H（粒度20－50μm）。洗脫劑：二氯甲烷－甲醇（9∶1），流速60ml/min。檢測器：紫外光（254nm）檢測。壓力：1.05MPa。樣品量：200mg脫氧皮質甾酮。制備高壓色譜分離皮質甾體2023/2/3121例2查爾酮和黃烷酮的分離（正相）

（說明：粉狀吸附劑與薄殼吸附劑效能的差別）查爾酮和黃烷酮可在酸性或堿催化下相互轉換。很難完全轉換，兩者分離相當困難。（a）吸附劑：粉狀聚酰胺淋洗液：甲醇流速：1ml/min壓力：4.76MPa（b）吸附劑：薄殼球狀聚酰胺淋洗液：甲醇-水(3∶1)流速：2.5ml/min壓力：1.22MPa2023/2/3122在聚酰胺柱上分離查爾酮和黃烷酮可以看出：在（b）的情形下，分離更迅速，給出的峰更尖銳。2023/2/3123例3青霉素生產中，發(fā)酵液成分中，主成分與苯乙酸的含量測定（反相）為重要的β-內酰胺類抗生素

為有效地控制發(fā)酵生產過程，采取對發(fā)酵液進行監(jiān)控，即測定其中主成分與苯乙酸，其方法：HPLC分析。固定相:LiChrosorb

C18流動相：0.01mol/l醋酸緩沖液(PH4.75)∶乙腈=85∶15，流速：1.3ml/min檢測器：紫外檢測器，檢測波長為254nm2023/2/3124

取發(fā)酵液樣品過濾稀釋成300－500萬/ml的樣品溶液，加入適量苯乙酸標準液，濾膜過濾后進行HPLC分析。見下譜圖。以青霉素鉀與苯乙酸為標準物，采用外標法定量，可測定不同發(fā)酵時間內發(fā)酵液中青霉素與苯乙酸的濃度。青霉素發(fā)酵液樣品的HPLC圖1－苯乙酸；2－青霉素2023/2/3125例4合成莠去津（atrazine）反應中主產物及副產物的HPLC分析（反相）莠去津主要用于玉米田除草，其合成是：

反應中有五種副產物存在。