醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法進(jìn)行初步觀察形成可驗(yàn)證的假說(shuō)設(shè)計(jì)對(duì)照試驗(yàn)收集資料解釋結(jié)果作出合理結(jié)論查閱已有知識(shí)生物學(xué)研究模式生物不同物種享有共同分子機(jī)制如何學(xué)習(xí)細(xì)胞生物學(xué)？抽象思維與動(dòng)態(tài)觀點(diǎn)結(jié)構(gòu)與功能統(tǒng)一的觀點(diǎn)同一性(unity)和多樣性(diversity)的問(wèn)題細(xì)胞生物學(xué)的主要內(nèi)容：結(jié)構(gòu)與功能（動(dòng)態(tài)特征）；細(xì)胞的生命活動(dòng)；實(shí)驗(yàn)科學(xué)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)——細(xì)胞真知源于實(shí)驗(yàn)室

——Whatweknow//Howweknow.第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

細(xì)胞組分的分析方法

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術(shù)

(Electromicroscopy)

掃描探針顯微鏡（ScanningProbeMicroscope）

掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)

第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法

離心分離技術(shù)

細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術(shù)

定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)

細(xì)胞的培養(yǎng)

細(xì)胞工程一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy)

普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（LaserConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）微分干涉顯微鏡（differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC）錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）二、電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的基本知識(shí)電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構(gòu)造

主要電鏡制樣技術(shù)負(fù)染色技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)超薄切片技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）

SPM(Scanningprobemicroscope)三、掃描遂道顯微鏡ScanningProbeMicroscope,SPM

(80年代發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器)

包括：STM、AFM、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等原理：掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離時(shí)，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計(jì)算機(jī)顯示出來(lái)，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。裝置：掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。特點(diǎn)：（1）可對(duì)晶體或非晶體成像，無(wú)需復(fù)雜計(jì)算，且分辨本領(lǐng)高。（側(cè)分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達(dá)0.01nm）； （2）可實(shí)時(shí)得到樣品表面三維圖象，可測(cè)量厚度信息；（3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測(cè)量。 （4）可連續(xù)成像，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

光鏡樣本制作分辨率是指區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）原理與應(yīng)用

直接熒光標(biāo)記技術(shù)

間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用

激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)

（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理應(yīng)用： 排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng) 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，可用于觀察活細(xì)胞

微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）

偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成 明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）

計(jì)算機(jī)輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活 細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見(jiàn)光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構(gòu)造主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)用于電鏡觀察的樣本制備示意圖

負(fù)染色技術(shù)（Negativestaining）與金屬投影

染色背景，襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu) 冰凍蝕刻技術(shù)（Freezeetching）（技術(shù)示意圖） 冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來(lái)觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。 快速冷凍深度蝕刻技術(shù)（quickfreezedeepetching）電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。 電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）

——主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實(shí)驗(yàn)手段。掃描電鏡原理與應(yīng)用：電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測(cè)器收集二次電子成象。

CO2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問(wèn)題一、離心分離技術(shù)

用途：于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物

差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分

密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些 特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過(guò)顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來(lái)判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。

FeulgenStaining三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術(shù)： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限（圖）

蛋白電泳(SDS)

與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)

免疫電鏡技術(shù)：免疫鐵蛋白技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫膠體金技術(shù)

應(yīng)用：通過(guò)對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術(shù)

（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）

PCR技術(shù)

五、放射自顯影技術(shù)原理及應(yīng)用：利用同位素的放射自顯影，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究；實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)和追蹤研究。步驟：前體物摻入細(xì)胞（標(biāo)記：持續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記）

———放射自顯影六．定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)細(xì)胞顯微分光光度術(shù)（Microspectrophotometry）利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對(duì)特異光譜的吸收，測(cè)定這些物質(zhì) （如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。 包括：

紫外光顯微分光光度測(cè)定法可見(jiàn)光顯微分光光度測(cè)定法

流式細(xì)胞儀（FlowCytometry）主要應(yīng)用：用于定量測(cè)定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量； 測(cè)定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量； 從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞； 分離DNA含量不同的中期染色體。

一、細(xì)胞的培養(yǎng)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

類型：原代培養(yǎng)細(xì)胞（primaryculturecell）

繼代培養(yǎng)細(xì)胞（sub-culturecell）

細(xì)胞株（cellstrain）正常二倍體，接觸抑制

細(xì)胞系（cellline）亞二倍體，接觸抑制喪失

植物細(xì)胞

類型：

原生質(zhì)體培養(yǎng)（體細(xì)胞培養(yǎng)）

單倍體細(xì)胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）非細(xì)胞體系（cell-freesystem）

二、細(xì)胞工程細(xì)胞融合（cellfusion）與細(xì)胞雜交（cellhybridization）技術(shù)單克隆抗體（monocloneantibody）技術(shù)圖細(xì)胞拆合與顯微操作技術(shù)物理法結(jié)合顯微操作技術(shù)(圖1、圖2)化學(xué)法結(jié)合離心技術(shù)制備核體（karyoplast）和胞質(zhì)體（cytoplast）。

其它技術(shù)

遺傳分析（mutant,knockout,knockin）

對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)的研究成為當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展的瓶頸對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)的研究成為當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展的瓶頸

細(xì)胞生命活動(dòng)突變體分析突變體分析蛋白修飾分析基因表達(dá)多肽定性分析生物信息學(xué)序列測(cè)定雙向電泳分析DNA分離與克隆機(jī)器人技術(shù)

(robotics)

功能基因組學(xué)蛋白質(zhì)分離與制備蛋白質(zhì)組學(xué)AcomparisonofyeastcellsthatweregrowingonthevaginalepitheliumseenwithdifferenttypesofLM.a)underbright-field;b)phase-contrast;c)DICExamplesofnegtivelystainedan