藥物檢驗(yàn)工-12高效液相色譜法

液相色譜法

液相色譜法：以液體為流動(dòng)相的色譜法稱～。1經(jīng)典液相色譜：固定相顆粒較大且不均勻

常壓下輸送流動(dòng)相柱效較低

分析周期長(zhǎng)現(xiàn)代液相色譜：固定相顆粒小且均勻

高壓下輸送流動(dòng)相柱效較高分析周期短經(jīng)典液相色譜包括：

柱色譜和平面色譜高效液相色譜法HPLC第一節(jié)概述highperformanceliquidchromatography以氣相色譜理論為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測(cè)手段1．經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段

柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻常壓輸送流動(dòng)相柱效低（H↑，n↓）分析周期長(zhǎng)無法在線檢測(cè)，靈敏度差2．HPLC：分離和分析

柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）高壓輸送流動(dòng)相柱效高（H↓，n↑）分析時(shí)間大大縮短可以在線檢測(cè)，靈敏度高二、HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè)主要差別：分析對(duì)象的差別和流動(dòng)相的差別1．分析對(duì)象

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品，高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、離子型等樣品不可檢測(cè)占有機(jī)物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測(cè)用途廣泛，占有機(jī)物的80%2．流動(dòng)相差別GC：流動(dòng)相為惰性氣體組分與流動(dòng)相無親合作用力，只與固定相作用

HPLC：流動(dòng)相為液體流動(dòng)相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對(duì)分離起很大作用流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣流動(dòng)相極性和pH值的選擇也對(duì)分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相可以增大分離選擇性3．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。┤⒏咝б合嗌V儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進(jìn)樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測(cè)器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置固定相和流動(dòng)相1、固定相：非極性鍵合相如十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，ODS柱——HPLC約80%問題）2、流動(dòng)相：流動(dòng)相極性>固定相極性底劑（水）+與水混溶的極性調(diào)節(jié)劑

常用甲醇－水、乙腈－水等3、分離機(jī)理：疏溶劑理論為代表(了解)溶質(zhì)的保留機(jī)理是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合。不是溶質(zhì)分子與鍵合相間的色散力流動(dòng)相洗脫方式1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）——類似GC的等溫度洗脫；以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個(gè)泵）具有方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、色譜柱易再生等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于成分復(fù)雜的樣品，往往不能兼顧某些性質(zhì)相差很大組分的分離要求2）梯度洗脫：——類似GC的程序升溫在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動(dòng)相的種類和比例，即不斷改變其極性（兩個(gè)泵）。適于分析極性差別較大的復(fù)雜組分

縮短分析周期；提高分離效果；改善峰形；增加檢測(cè)靈敏度有時(shí)引起基線漂移、重復(fù)性較差2023/2/1峰的鑒別：1．苯；2．氯苯；3．對(duì)二氯苯4．1，2，3三氯苯；

5．1，3，5三氯苯；6．1，2，4三氯苯；

7．1，2，3，4四氯苯；8．1，2，4，5四氯苯；

9．五氯苯；10.六氯苯（a）梯度洗脫兩種洗脫方式的比較（b）等度洗脫溶劑系統(tǒng)選擇的一般原則RBPC流動(dòng)相極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱。（1）溶劑種類：水+甲醇、水+乙腈（2）溶劑比例：水的比例增加，使k增大（3）溶劑pH：影響弱酸、弱減的離解流動(dòng)相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱堿k變小選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題：（1）盡量使用高純度試劑（色譜純）作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動(dòng)相的pH介于2~8一、輸液系統(tǒng)高壓輸液泵恒壓泵：流量精度不穩(wěn)恒流泵（常用）：在輸送流動(dòng)相過程中流量恒定。常用柱塞往復(fù)泵雙泵：為了克服流量的脈動(dòng)。有串聯(lián)式和并聯(lián)式高效液相色譜儀輸液泵應(yīng)具備的性能：流量精度高且穩(wěn)定流量范圍寬能在高壓下連續(xù)工作液缸容積小密封性能好，耐腐蝕

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。進(jìn)樣閥二、進(jìn)樣系統(tǒng)三、分離系統(tǒng)色譜柱（column）由柱管（不銹鋼管）和固定相組成分析柱（直徑4~6mm如4.6mm，柱長(zhǎng)10~30cm）、制備柱柱效評(píng)價(jià)：色譜系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)R≥1.5，n（符合規(guī)定），fs（0.95~1.05）柱再生：維護(hù)、保養(yǎng)、柱子的沖洗（了解）

保護(hù)柱

一般在分析柱前裝上較短的保護(hù)柱，不僅可除去溶劑中的顆粒雜質(zhì)和污染物，而且可除去樣品中含有與固定相不可逆結(jié)合的組分，以保護(hù)較昂貴的分析柱，延長(zhǎng)使用壽命。

柱恒溫器

對(duì)色譜柱嚴(yán)格控制溫度可獲得重現(xiàn)性更高保留值和更好分離色譜圖。四、檢測(cè)器

1、紫外檢測(cè)器：適于吸收紫外光的物質(zhì)

檢測(cè)原理：朗伯－比爾(Lambert-Beer)定律，響應(yīng)信號(hào)（吸光度）與濃度成正比A=εCl特點(diǎn)：靈敏度較高（10-6—10-9g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞樣品，應(yīng)用廣（分析、制備）。局限：只能檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)，流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)應(yīng)小于檢測(cè)波長(zhǎng)。專屬型、濃度型檢測(cè)器續(xù)前紫外檢測(cè)器類型：1）固定波長(zhǎng)檢測(cè)器：254nm2）可變波長(zhǎng)檢測(cè)器：光源：氘燈（和鎢燈），200—400（800）nm，單色器，流通池（試樣），光電管光路系統(tǒng)和紫外分光光度計(jì)相似3）光電二極管陣列檢測(cè)器(DAD)：在獲得色譜圖的同時(shí)，還可以獲得個(gè)組分的光譜圖。即獲得三維光譜－色譜圖。用途：吸收光譜用于組分的定性，色譜峰面積用于定量,判斷峰純度2.紅外吸收檢測(cè)器與一般光吸收檢測(cè)器光路設(shè)計(jì)相似，其吸收池窗口采用氯化鈉、氟化鈣等紅外透明材料，透過吸收池的紅外光一般以熱電敏感元件接收。這種檢測(cè)器可提供分子結(jié)構(gòu)信息，但由于大多數(shù)液相色譜流動(dòng)相溶劑都有紅外吸收及窗口材料限制，其應(yīng)用有限。

高靈敏度、高選擇性對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng).3.熒光檢測(cè)器(FluorescenceDetector，F(xiàn)D)除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器；可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；

通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；4.示差折光檢測(cè)器（DifferentialRefrativeIndexDetector,RI）5.蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(EvaporationLightScatteringDetector,ELSD)ELSD的響應(yīng)不依賴與樣品的光學(xué)特性，可以檢測(cè)沒有紫外吸收的有機(jī)物質(zhì)，如人參皂苷、黃芪甲苷等。任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品均能被檢測(cè)，不受其官能團(tuán)的影響。（1）用惰性氣體霧化脫洗液（2）流動(dòng)相在加熱管（漂移管）中蒸發(fā)（3）樣品顆粒散射光后得到檢測(cè)。6.電化學(xué)檢測(cè)器

基于電化學(xué)原理和物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，主要有安培、極譜及電導(dǎo)等幾種類型，適用于測(cè)定具有電化學(xué)氧化還原性質(zhì)及電導(dǎo)的化合物，如含硝基、氨基等有機(jī)化合物及無機(jī)陰、陽離子等。1.氟塑料池體,2.工作電極,3.氟塑料或聚酯墊片,4.接參比電極，至廢液，5.接色譜柱。流動(dòng)相

泵色譜柱檢測(cè)器

泵輸液分離檢測(cè)

記錄AEGBCDF進(jìn)樣閥進(jìn)樣1、排氣2、進(jìn)樣閥3、跑基線4、開始進(jìn)樣，并進(jìn)行測(cè)試5、測(cè)試完畢，清洗進(jìn)樣閥和整個(gè)HPLC儀器6、流量調(diào)小，先關(guān)排液閥，再關(guān)泵7、先關(guān)計(jì)算機(jī)，再關(guān)液相色譜HPLC基本流程圖定性分析和定量分析主要影響因素：時(shí)間強(qiáng)度數(shù)據(jù)分析及影響因素流動(dòng)相和色譜柱2023/2/1第八節(jié)定性、定量分析方法（同GC法）一、定性分析方法

1.色譜鑒定法——保留時(shí)間

2.化學(xué)鑒定法

3.色譜-光譜聯(lián)用鑒定法（1）非在線色譜光譜聯(lián)用法（2）色譜-光譜聯(lián)用儀2023/2/1二、定量分析方法——同GC（自己看）

1.外標(biāo)法：應(yīng)用較為廣泛

2.內(nèi)標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)法分為工作曲線法、內(nèi)標(biāo)對(duì)比法等。

內(nèi)標(biāo)對(duì)比法：不需知校正因子，又具有內(nèi)標(biāo)法的定量準(zhǔn)確度與進(jìn)樣量無關(guān)的特點(diǎn)，方法簡(jiǎn)便實(shí)用。在藥物分析中分析結(jié)果（含量）常用標(biāo)示量％表示：§6-2定量方法1.定量依據(jù)m＝fi·Aifi定量校正因子Ai色譜峰峰面積（信號(hào)）m1+m2+m3+…+mi+…mn（1）歸一化法試樣中的成分都能出峰則有：Wi=mim=mi×100%2.測(cè)量方法：f1A1+f2A2+…+fiAi+…fnAnWi=mim=fiAi×100%即若f差別不大，則有A1+A2+…+Ai+…AnWi=Ai×100%也可以用峰高代替峰面積進(jìn)行計(jì)算

fx

Axmsmx

fsAs所以ms

fsAsmxfxAx已知內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度為cs，設(shè)未知樣品的濃度為cx，上機(jī)測(cè)定得到的峰面積分別為As

，Ax

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ms=fsAs未知物質(zhì)mx=fxAx==（不同物質(zhì)f不同）用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)出fx和fs,然后求得cx（2）內(nèi)標(biāo)法01二月202333內(nèi)標(biāo)物的選擇內(nèi)標(biāo)物峰與試樣中所有成分的峰完全分離。內(nèi)標(biāo)物峰與目標(biāo)成分峰保留時(shí)間不應(yīng)差太遠(yuǎn)。內(nèi)標(biāo)物具有與分析目標(biāo)成分類似的化學(xué)性質(zhì)。

理化性質(zhì)與待測(cè)物相近色譜響應(yīng)與待測(cè)物相近與待測(cè)物有良好的分離，但不能相距太遠(yuǎn)與待測(cè)物的峰面積比為0.7-1.3最好，因此要根據(jù)待測(cè)物的濃度確定內(nèi)標(biāo)物的添加量例