血清中葡萄糖濃度的測(cè)定

血清葡萄糖濃度的測(cè)定（GOD-POD法）小組成員：石子濤習(xí)文盛世豪蔣勇實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆彰阜y(cè)定血清葡萄糖濃度的原理。掌握血糖變化的臨床生理意義。知識(shí)窗酶法分析是指用酶作為工具定量測(cè)定某種物質(zhì)含量的分析方法。定量分析的目標(biāo)可以是酶的底物，輔酶，也可以是酶的激活劑或抑制劑。

其分類(lèi)如下：?jiǎn)蚊阜磻?yīng)定量法：指用一種酶為工具酶定量測(cè)定某種物質(zhì)的方法。偶聯(lián)酶反應(yīng)定量法：當(dāng)單酶反應(yīng)底物或產(chǎn)物反應(yīng)底物或產(chǎn)物噢物理化學(xué)手段無(wú)法區(qū)分時(shí)，還可以借助另一種酶作為指示酶，通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行定量分析。由于酶法檢測(cè)具有快速、漸變、準(zhǔn)確、無(wú)不良反應(yīng)、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已逐步取代其他方法，在臨床診斷中應(yīng)用廣泛。(詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)教程P103-104)實(shí)驗(yàn)原理酶法測(cè)定血清葡萄糖是用以過(guò)氧化物酶作指示酶的偶聯(lián)酶反應(yīng)定量法。葡萄糖氧化酶（GOD）利用氧將葡萄糖氧化成葡萄糖酸，同時(shí)釋放出過(guò)氧化氫。過(guò)氧化物酶(POD)催化過(guò)氧化氫氧化色素原，并使色素原氧化成紅色醌類(lèi)化合物（色素），即Trinder反應(yīng)。其生成量與葡萄糖含量成正比。補(bǔ)充：

葡萄糖氧化酶(GOD):是從特異青霉（Penicilliumnotatum）等霉菌和蜂蜜中發(fā)現(xiàn)的酶。近白色粉末,溶于水，幾不溶于乙醇、氯仿和乙醚。最適pH5.2最適溫度55°C

過(guò)氧化物酶(POD):是由微生物或植物所產(chǎn)生的一類(lèi)氧化還原酶,它們能催化很多反應(yīng)。過(guò)氧化物酶是以過(guò)氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶。主要存在于細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體中，以鐵卟啉為輔基，可催化過(guò)氧化氫氧化酚類(lèi)和胺類(lèi)化合物，具有消除過(guò)氧化氫和酚類(lèi)、胺類(lèi)毒性的雙重作用。實(shí)驗(yàn)器材與試劑（一）器材5ml移液管，50或100ul微量可調(diào)式移液器721E型分光光度計(jì)，37度恒溫水浴鍋（二）試劑（1）0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）：稱(chēng)取無(wú)水磷酸二氫鈉8.67g,稱(chēng)取無(wú)水磷酸二氫鉀5.3g，溶于蒸餾水800ml中，調(diào)節(jié)pH=7.0,定容至1L（2）酶試劑：取過(guò)氧化物酶12000U，葡萄糖氧化酶1200U,4-氨基安替比林10mg，疊氮化鈉100mg，溶入磷酸鹽緩沖液80ml中，用磷酸鹽緩沖液定容至100ml，置于4℃保存。（3）酚溶液：稱(chēng)取重蒸餾酚100mg，溶入蒸餾水100ml中，用棕色瓶?jī)?chǔ)存。（4）酶酚混合試劑：將酶試劑及酚溶液等量混合，4可放一個(gè)月。（5）苯甲酸鈉溶液(12mmol/L)：稱(chēng)取苯甲酸鈉1.6g，于800ml蒸餾水中加溫助溶，冷卻后加蒸餾水定容至1L。（6）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液（100mmol/L）：稱(chēng)取已干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖1.082g，溶入約70ml12mmol/L苯甲酸鈉溶液中定容至100ml。2h以后方可使用（7）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液（5mmol/L）：吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液5.00ml，用12mmol/L苯甲酸鈉溶液稀釋至100ml。操作步驟取試管3支，按表操作

試劑/ml

空白管

標(biāo)準(zhǔn)管

測(cè)定管血清──0.020葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液─0.020─蒸餾水0.020──酶酚混合試劑3.003.003.00

混勻，置37℃水域中，保溫25min,在波長(zhǎng)510nm比色處，以空白管調(diào)零，讀取標(biāo)準(zhǔn)管及測(cè)定管的吸光度血清中葡萄糖濃度的測(cè)定反應(yīng)式

葡萄糖＋O2＋H2O葡萄糖酸+2H2O2

2H2O2+4-氨基安替比林+苯酚紅色醌類(lèi)化合物計(jì)算公式血清葡萄糖濃度=A測(cè)定/A標(biāo)準(zhǔn)*5mmol/l(根據(jù)朗伯-比爾定律:A＝klc)參考值：空腹血清葡萄糖濃度：3.89—6.11mmol/LGODPOD血糖檢測(cè)如果不及時(shí)送檢和分離血清，全血中的血細(xì)胞會(huì)酵解血清中的G加以利用，使血糖的檢測(cè)結(jié)果偏低葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖時(shí)，由于血清中還原性物質(zhì)(Vitc，谷胱甘肽、尿酸、膽紅素等)競(jìng)爭(zhēng)與過(guò)氧化氫(H2O2)反應(yīng)，使反應(yīng)生成的紅色醌類(lèi)化合物減少，檢測(cè)結(jié)果偏低。受飲食、取血部位及測(cè)定方法的影響血糖檢測(cè)影響因素注意事項(xiàng)葡萄糖氧化酶對(duì)β-D-葡萄糖高度特異，溶液中的葡萄糖約36%α型，64%為β型。葡萄糖的完全氧化需要α型到β型的變旋反應(yīng)。新配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液主要是α型，故須放置2h以上，待變旋平衡后方可應(yīng)用。（1）葡萄糖氧化酶法可直接用于測(cè)定腦脊液葡萄糖含量，但不能直接測(cè)定尿液葡萄糖含量。因?yàn)槟蛞褐心蛩岬雀蓴_性物質(zhì)濃度過(guò)高，可干擾氧化酶反應(yīng)，造成結(jié)果假性偏低。（2）對(duì)于血液樣品需及時(shí)分離紅細(xì)胞因紅細(xì)胞的酵解將導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低，建議測(cè)定樣品以草酸鉀-氟化鈉為抗凝劑以抑制糖酵解。（取草酸鉀6g，氟化鈉4g，加水溶解至100ml，吸取0.1ml到試管內(nèi)，在80℃以下烤干使用，可使2到3ml血液在3到4天內(nèi)不凝固并抑制糖分解）（3）嚴(yán)重黃疸，溶血及乳糜樣血清應(yīng)先制備無(wú)蛋白血濾液，然后在進(jìn)行測(cè)定。（4）試劑避免與皮膚接觸，緩沖液中含疊氨鈉、酚試劑有毒臨床意義生理性高血糖：可見(jiàn)于攝于高糖食物后，或情緒緊張導(dǎo)致腎上腺分泌增加時(shí)。病理學(xué)高血糖：a糖尿病:病理性高血糖常見(jiàn)于胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足的糖尿病患者。b內(nèi)分泌腺功能障礙：甲狀腺功能亢進(jìn)，腎上腺皮質(zhì)功能及髓質(zhì)功能亢進(jìn)，引起各種對(duì)抗胰島素的激素分泌過(guò)多，或升高血糖的激素增多引起的高血糖，現(xiàn)已歸入特異性糖尿病中。c顱內(nèi)壓增高：刺激血糖中樞，如顱外傷，顱內(nèi)出血，腦膜炎等，引起血糖增高。d脫水引起的高血糖：如嘔吐，腹瀉和高熱等也可使血糖輕度增高。生理性低血糖：見(jiàn)于饑餓和劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)。病理性低血糖：特發(fā)性功能性低血糖最多見(jiàn)，依次是藥源性，肝源性和胰島素瘤等。思考題（1）標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖儲(chǔ)存液與應(yīng)用液中都含有苯甲酸鈉，苯甲酸鈉起什么作用？（2）查文獻(xiàn)，列舉幾種血清葡萄糖測(cè)定的方法與原理。

答:化學(xué)方法：鄰甲苯胺法，原理：葡萄糖為含一醛基的己糖，在酸性條件下加熱，可脫水生成5-羥甲基-2-呋喃醛，后者與鄰甲苯胺縮合成青色的席夫(schiff)堿(λmax=630nm),其顏色深淺與樣品中葡萄糖含量成正比。(詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)教程P143實(shí)驗(yàn)十三)；

酶━電極法，原理：葡萄糖氧化酶(GOD)在有氧條件下催化β─D─葡萄糖(葡萄糖水溶液狀態(tài))氧化，生成D─葡萄糖酸─δ─內(nèi)酯和過(guò)氧化氫。過(guò)氧化氫與過(guò)氧化氫型電極接觸產(chǎn)生