第十三章基因工程與基因組學(xué)

第十三章基因工程與基因組學(xué)概述廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)教研室第一節(jié)基因工程一、基因工程概述二、基因工程工具酶三、基因工程的流程及相關(guān)技術(shù)四、基因工程的發(fā)展應(yīng)用一、基因工程概述遺傳工程（geneticengineering），也稱生物工程，利用工程技術(shù)的方法改造和修飾生物體，使其產(chǎn)生新的性狀或產(chǎn)品，從而改良生物體的一種遺傳學(xué)手段。核心是利用重組DNA技術(shù)，在分子水平上操作修飾改變生物體遺傳結(jié)構(gòu)?；蚬こ蹋╣eneengineering）：利用人工的方法把生物的遺傳物質(zhì)在體外進(jìn)行切割、拼接和重組，獲得重組DNA分子，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞或個(gè)體，使受體的遺傳特性得到修飾或改變的過程。二、基因工程的工具酶內(nèi)切核酸酶(endonuclease)DNA連接酶(ligase)DNA聚合酶（DNApolymerase）RNA聚合酶（RNApolymerase）反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）最重要的工具酶是限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease），也稱限制性酶(restrictionenzyme),能識(shí)別雙鏈DNA分子中一段特異的核苷酸序列，并在特定的位置將雙連DNA分子切斷。Eco

RⅠ屬名種名菌株名序號(hào)（一）限制性核酸內(nèi)切酶常見內(nèi)切酶（二）DNA連接酶連接5’－磷酸和3’－OH，形成磷酸二酯鍵，封閉DNA雙鏈上的缺刻。如：E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶載體(vector)將外源DNA片段運(yùn)送進(jìn)宿主細(xì)胞(hostcell)進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的運(yùn)載工具稱為載體。載體也是DNA分子。常用的載體有細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、病毒等。經(jīng)改造的黏粒(cosmid)、噬粒(phagemid)都要經(jīng)過人工改造。細(xì)菌人工染色體（BAC）、酵母菌人工染色體（YAC）和人類人工染色體（HAC）λ噬菌體載體YAC（1Mb）載體的基本條件①有獨(dú)立的復(fù)制原點(diǎn)(ori)，能獨(dú)立地自我復(fù)制，而且能帶動(dòng)外源DNA一起復(fù)制。②具有多種限制性酶的切點(diǎn)，用于連接外源DNA片段。③載體上的限制酶酶切位點(diǎn)對(duì)于任何一種限制酶來(lái)說只能有一個(gè)。④具有一個(gè)選擇標(biāo)記基因。獲得外外源DNA片段段（分分）限限制性性內(nèi)切切酶切切割外外源DNA片段段與載載體（（切））外外源源DNA片片段與與載體體連接接（接接）重重組DNA分子子轉(zhuǎn)入入宿主主細(xì)胞胞（轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)）重重組子子的篩篩選與與鑒定定（篩篩）目目的基基因的的確認(rèn)認(rèn)與分分析三、基因工工程的流程程及相關(guān)技技術(shù)（一）外源源DNA片片段的分離離方法構(gòu)建基因組組文庫(kù)分離離法差別顯示反反轉(zhuǎn)錄PCR利用聚合酶酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)應(yīng)技術(shù)擴(kuò)增增目的基因因1.構(gòu)建基基因組文庫(kù)庫(kù)分離法用克隆載體體將某種生生物的基因因組全部遺遺傳信息儲(chǔ)儲(chǔ)存于一個(gè)個(gè)受體菌的的群體，即即構(gòu)成了這這種生物的的基因組文文庫(kù)。若只只儲(chǔ)存某生生物基因組組的部分遺遺傳信息，，即構(gòu)成部部分基因組組文庫(kù)。供體生物的的基因組DNA切割割成許多片片段將所有片段段分別連接接到載體上上，構(gòu)成一一個(gè)重組DNA群體體這個(gè)群體包包含全基因因組的遺傳傳信息。保存、篩選選差別顯示分分析基本流流程2.差別顯顯示反轉(zhuǎn)錄錄PCR（（DDRT-PCR）3、利用聚聚合酶鏈?zhǔn)绞椒磻?yīng)技術(shù)術(shù)擴(kuò)增目的的基因（1）套式式PCR（2）反向向PCR（3）不對(duì)對(duì)稱PCR（4）錨定定PCR（5）長(zhǎng)程程PCR（6）反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄PCR4、人工工合成基因因根據(jù)已知的的基因序列列，或根據(jù)據(jù)氨基酸序序列推測(cè)DNA序列列將化學(xué)合成成寡核苷酸酸的方法與與酶促合成成DNA的的方法結(jié)合合起來(lái)，可可以很快地地人工合成成基因。通過用相同同的限制性性核酸內(nèi)切切酶切割，，連接形成成一個(gè)重組組DNA分分子（二）、外外源DNA片段與載載體的切割割和連接（三）、重重組DNA轉(zhuǎn)入宿主主細(xì)胞1.重組DNA轉(zhuǎn)入入原核細(xì)胞胞熱激轉(zhuǎn)化法法電穿孔轉(zhuǎn)化化法2.重組DNA轉(zhuǎn)入入真核細(xì)胞胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化化法重組DNA感受態(tài)細(xì)胞冰浴混合、靜置置42oC熱熱激加入培養(yǎng)基基擴(kuò)培轉(zhuǎn)化液涂含含抗菌素的的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱激轉(zhuǎn)化化法感受態(tài)細(xì)胞胞電轉(zhuǎn)儀調(diào)為為2.5kV25F脈沖控制器器200-400質(zhì)粒DNA混合加入培養(yǎng)液37℃中速震蕩涂板（2）電穿孔轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法2.重組DNA轉(zhuǎn)入入植物細(xì)胞胞農(nóng)桿菌介導(dǎo)導(dǎo)的Ti質(zhì)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化法（四）重組子的篩篩選與鑒定定核酸雜交PCR檢測(cè)測(cè)測(cè)序生物學(xué)活性性檢測(cè)1.插入抗性性失活2.藍(lán)白斑篩選1.插入失失活篩選法法藍(lán)白斑篩選選重組質(zhì)粒粒四、基因工工程的發(fā)展展應(yīng)用1、基因工工程是生物物科學(xué)基礎(chǔ)礎(chǔ)研究的重重要手段2、利用轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)術(shù)改良植物物已取得很很大進(jìn)展并并在生產(chǎn)上上應(yīng)用3、利用基基因工程獲獲得大量重重組的蛋白白、疫苗藥藥物4、利用基基因工程進(jìn)進(jìn)行不同物物種之間的的基因傳遞遞提供了可可能。轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)植植物--““生物工廠廠”5、疾病診診斷與基因因治療6、環(huán)境保保護(hù)4.利用用基因工程程改良動(dòng)物物推薦幾本參參考書：1、《基因因工程原理理與方法》》，孫樹漢漢編，人民民軍醫(yī)出版版社

2、、《基因工工程原理》》，吳乃虎虎編，科學(xué)學(xué)出版社（（側(cè)重原理理）

3、、《現(xiàn)代基基因工程技技術(shù)導(dǎo)論》》，陳章良良編，科學(xué)學(xué)出版社（（側(cè)重應(yīng)用用）

4、、《分子克克隆》(第第三版)，，J.Sambrooketal.科科學(xué)出版版社（具體體的實(shí)驗(yàn)方方法，分子子生物學(xué)研研究的圣經(jīng)經(jīng)）第二節(jié)基基因組學(xué)學(xué)一、基因組學(xué)概述二、基因組組圖譜的構(gòu)構(gòu)建三、基因組組圖譜的應(yīng)應(yīng)用四、后基因因組學(xué)基因組(genome)泛指一個(gè)有有生命體、、病毒或細(xì)細(xì)胞器的全全部遺傳物物質(zhì)；在真真核生物，，基因組是是指一套染染色體（單單倍體）DNA。一、基因組學(xué)概概念及范疇疇基因組學(xué)(genomics)就是發(fā)展和和應(yīng)用DNA制圖、、測(cè)序新技技術(shù)以及計(jì)計(jì)算機(jī)程序序，分析生生命體（包包括人類））全部基因因組結(jié)構(gòu)及及功能?；蚪M學(xué)研研究的最終終目標(biāo)獲得生物體體全部基因因組序列鑒定所有基基因的功能能明確基因之之間的相互互作用關(guān)系系闡明基因組組的進(jìn)化規(guī)規(guī)律基因組學(xué)研研究?jī)?nèi)容結(jié)構(gòu)基因組組學(xué)(structuralgenomics)功能基因組組學(xué)(functionalgenomics)比較基因組組學(xué)(comparativegenomics)結(jié)構(gòu)基因組組學(xué)（structuralgenomics）基因定位基因組作圖圖測(cè)定核苷酸酸序列遺傳圖（連連鎖圖）物理圖轉(zhuǎn)錄圖序列圖二、基因組組圖譜的構(gòu)構(gòu)建基因組計(jì)劃劃的第一個(gè)個(gè)環(huán)節(jié)：構(gòu)構(gòu)建基因組組圖譜1.遺傳圖連鎖圖(linkagemap)，是指基因因標(biāo)志在染色色體上的遺傳傳距離，即確確定各基因在在基因組中的的相對(duì)位置和和排列順序。。遺傳距離通常常由基因在四四分體時(shí)期染染色體交換過過程中分離的的頻率厘摩（（cM）來(lái)表表示。遺傳標(biāo)記（Geneticmarker）指指可識(shí)別的等等位基因。它它具有兩個(gè)基基本特征，即即可遺傳性和和可識(shí)別性，，因此生物的的任何有差異異表型的基因因突變型均可可作為遺傳標(biāo)標(biāo)記。類型：形態(tài)標(biāo)記（morphologicalmarker））細(xì)胞學(xué)標(biāo)記(cytologicalmarker)生化標(biāo)記(biochemicalmarker)分子標(biāo)記(molecularmarker)2.、物理圖圖以已知核苷酸酸序列的DNA片斷（序序列標(biāo)簽位點(diǎn)點(diǎn),STS）為“路標(biāo)標(biāo)”，以堿基基對(duì)作為基本本測(cè)量單位（（圖距）的基基因組圖。DNA上兩點(diǎn)點(diǎn)的實(shí)際距離離，即確定基基因在染色體體上的實(shí)際排排列順序，從從而對(duì)基因定定位。3、轉(zhuǎn)錄圖以EST（expressedsequencetag，表達(dá)達(dá)序列標(biāo)簽））為標(biāo)記，根根據(jù)轉(zhuǎn)錄順序序的位置和距距離繪制的圖圖譜。4.、序列圖圖序列圖是指整整個(gè)人類基因因組的核苷酸酸序列圖，也也是最詳盡的的物理圖，既既包括可轉(zhuǎn)錄錄序列，也包包括非轉(zhuǎn)錄序序列，是轉(zhuǎn)錄錄序列、調(diào)節(jié)節(jié)序列和功能能未知序列的的總和。這是人類基因因組計(jì)劃最繁繁重、耗時(shí)最最多的工作。。CREDIT:JOESUTLIFFScience,Vol291:1221.FishinginaMoreEffectiveWay!人類基因組計(jì)計(jì)劃1990，美美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生生研究所和能能源部投資＄＄30億，啟啟動(dòng)了人類基基因組計(jì)劃，，預(yù)計(jì)15年年時(shí)間完成人人類基因組全全部序列的測(cè)測(cè)定1996，完完成標(biāo)記密度度為0.6cM的人類基基因組遺傳圖圖譜，100kb的物理理圖譜2000，完完成草圖2001年2月，公布人人類基因組圖圖譜的修訂版版2002，完完成測(cè)序工作作國(guó)際人類基因因組測(cè)序協(xié)作作組（公共計(jì)計(jì)劃組）由6個(gè)國(guó)家、20個(gè)研究中中心的2000多位科學(xué)學(xué)工作者組成成。國(guó)家承擔(dān)的測(cè)序任務(wù)美國(guó)54%英國(guó)33%日本7%法國(guó)2.8%德國(guó)2.2%中國(guó)1%1999年9月中國(guó)獲獲準(zhǔn)加入人類類基因組計(jì)劃劃，負(fù)責(zé)測(cè)定定人類基因組組全部序列的的1%，負(fù)責(zé)責(zé)第3號(hào)染色色體3千萬(wàn)核核苷酸的序列列測(cè)定工作。。中國(guó)是繼美美、英、日、、德、法之后后第6個(gè)國(guó)際際人類基因組組計(jì)劃參與者者，也是參與與這一計(jì)劃的的唯一發(fā)展中中國(guó)家。人類基因組計(jì)計(jì)劃1%測(cè)序序中國(guó)實(shí)驗(yàn)室室2000年6月26日科學(xué)家公布人人類基因組工工作草圖，標(biāo)標(biāo)志著人類在在解讀自身““生命之書””的路上邁出出了重要一步步。HGP對(duì)人類類基因面貌的的新發(fā)現(xiàn)基因數(shù)量少得得驚人人類基因組中中存在“熱點(diǎn)點(diǎn)”和大片““荒漠”三分之一為““垃圾”DNA種族歧視毫無(wú)無(wú)根據(jù)男性基因突變變比例更高2000年是是基因組之年年，完成了人人類基因組的的工作框架圖圖，完成了一一系列模式生生物和微生物物的基因組序序列分析。2000年年12月月美、英等國(guó)國(guó)科學(xué)家宣布布繪出擬南芥芥基因組的完完整圖譜，這這是人類首次次全部破譯出出一種植物的的基因序列。。三、后基因組組學(xué)（postgenomics)完成一個(gè)生物物體全部基因因組測(cè)序后即即進(jìn)入功能基基因組學(xué)階段段，也稱后基因組階段段——詳盡分