大四上學期-實驗診斷10基因

第十章其他檢測

第一節(jié)基因診斷

講授內(nèi)容及要求

一、基因診斷的基本概念二、基因診斷的基本技術(shù)三、基因診斷的應(yīng)用

四、基因治療:概念、方式、程序、應(yīng)用

第一節(jié)基因診斷基本概念和流程

傳統(tǒng)對疾病的診斷主要是以疾病的表型改變?yōu)橐罁?jù)，如患者的癥狀、血尿各項指標的變化，或物理檢查的異常結(jié)果，然而表型的改變在許多情況下不是特異的，而且是在疾病發(fā)生的一定時間后才出現(xiàn)，因此常不能及時作出明確的診斷.表型的改變是由基因異常造成的

基因的改變是引起疾病的根本原因一基因和基因診斷的概念1.基因是攜帶有遺傳信息的DNA片段。蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)是基因的表達產(chǎn)物。2.利用分子生物學的原理和實驗技術(shù)，以探查導致相關(guān)疾病發(fā)生和發(fā)展的DNA結(jié)構(gòu)變異為中心內(nèi)容的診斷疾病的技術(shù)和方法稱為基因診斷。DNA診斷RNA診斷

染色體=DNA(螺旋折疊后)+蛋白質(zhì)

基因=染色體上有遺傳效應(yīng)的片段,也就是說,不是染色體上所有的部分都叫基因,只有一些說通俗點"有用的"部分才叫基因,這個"有用"就是所說的能夠翻譯成蛋白質(zhì).

基因診斷主要是對遺傳物質(zhì)（DNA\RNA）結(jié)構(gòu)、表達量進行檢測，是病因的診斷，既特異又靈敏，可以揭示尚未出現(xiàn)癥狀時與疾病相關(guān)的基因狀態(tài)，從而可以對表型正常的攜帶者及某種疾病的易感者作出診斷和預(yù)測，特別對確定有遺傳疾病家族史的個體或產(chǎn)前的胎兒是否攜帶致病基因的檢測具有指導意義基因變異的多樣性1.遺傳疾病的致病基因和易患基因都是相應(yīng)的正?；蛲蛔儺a(chǎn)生的。2.染色體的結(jié)構(gòu)與數(shù)目，如由于21號染色體增多(三倍體)導致的先天愚型。3.基因缺失，如α地中海貧血。4.基因片段的插入與缺失5.基因點突變：同義突變，錯義突變，無義突變，移碼突變，終止密碼突變和非編碼區(qū)的突變等等。

基因診斷的內(nèi)容

內(nèi)容評價基因突變的檢測點突變、基因片段的缺失或插入、基因重排等基因突變檢測基因連鎖分析一些疾病的致病基因尚不清楚基因表達的分析mRNA定量檢測及mRNA長度分析病原體診斷外來入侵病原微生物遺傳物質(zhì)的檢測

二、基因診斷的特點針對性強：以探測疾病基因為目標，屬于“病因診斷”。

特異性高：以分子雜交技術(shù)為基本原理

靈敏度高：基因探針帶有十分敏感的檢測標記，可從人類長達3×106kb的基因組中檢測出某一基因的單堿基改變。而且待測標本微量。

早期診斷：基因診斷不僅可對有表型出現(xiàn)的疾病作出明確診斷，它還可在產(chǎn)前早期診斷遺傳性疾病，可檢出感染疾病潛伏期的病原微生物、還可預(yù)測和早期發(fā)現(xiàn)某些惡性腫瘤。適應(yīng)性強：基因探針可為任何來源，任何種類，探針序列可為已知亦可未知，檢測目標可為內(nèi)源基因亦可外源基因，診斷范圍廣。

PCR、SSCP限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)DNA序列測定DNA芯片技術(shù)核酸分子雜交第二節(jié)基因診斷的基本技術(shù)第二節(jié)基因診斷的基本技術(shù)

1.基于核酸雜交的基因探針，等位基因特異性寡核苷酸探針（Allelespeceficoligonucleotide,ASO)，基因芯片等。2.基于核酸雜交與電泳的技術(shù)，如Southernblot和Northernblot等等。3.基于PCR和電泳技術(shù)的PCR-RFLP和PCR-SSCP等。4.基于電泳和免疫技術(shù)的免疫印跡（Westernblot)

（一）、核酸分子雜交（hybridization）

這是應(yīng)用最廣泛的一類基因診斷技術(shù)

根據(jù)堿基互補配對原則，將樣品DNA/RNA雙鏈經(jīng)變性處理，加入已標記的單鏈DNA/RNA探針，樣品中與探針互補的DNA/RNA序列可與探針形成雜交雙鏈DNA，通過顯示標記物或其它方法來檢測特定的核酸片段。

分子雜交技術(shù)過程☆探針制備及標記（同位素或非同位素）☆待測核酸樣品制備（分離，純化）☆雜交（液相，固相）☆雜交后處理（去掉非特異雜交分子）☆顯示結(jié)果（顯色，發(fā)光，放射自顯影）☆結(jié)果分析分子雜交的基本方法

原位雜交(ISH)斑點印跡雜交Southern印跡雜交Northern印跡雜交

1、原位雜交

(Insituhybridization，ISH)原位雜交技術(shù)(Insituhybridization，ISH)是指將特定標記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程?，F(xiàn)今原位雜交技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛.

不須提取DNA或RNA。直接用培養(yǎng)/采集的細胞（涂載玻片上）、組織切片（固定載玻片上）和細菌菌落（復印至濾膜上）與標記核酸探針雜交。

可測知特定基因的存在或表達狀況。還可觀察被測基因在細胞內(nèi)或染色體上的定位。原位雜交技術(shù)分類

1、基因組原位雜交(Genomeinsituhybridization，GISH)技術(shù)2、熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)

熒光原位雜交技術(shù)利用熒光標記的核酸片段為探針，與染色體上或DNA顯微切片上的特異fl-N：~行雜交，通過熒光檢測系統(tǒng)(熒光顯微鏡)檢測信號DNA序列在染色體或DNA顯微切片上的目的DNA序列，進而確定其雜交位點。FISH技術(shù)檢測時間短，檢測靈敏度高，無污染，已廣泛應(yīng)用于染色體的鑒定、基因定位和異常染色體檢測等領(lǐng)域。3、多彩色熒光原位雜交技術(shù)4、原位PCR

2、斑點印跡雜交

把提取的DNA/RNA樣本，直接點到硝酸纖維膜或尼龍膜上與標記核酸探針雜交。通過纖維素膜雜交斑點的放射自顯影或膠片斑點的光吸收值掃描可以測定待檢核酸的含量?？蓹z測特定基因的存在或表達情況。

3、Southern印跡雜交

1975年，英國Southern創(chuàng)建

概念:將制備的DNA經(jīng)酶切電泳、再轉(zhuǎn)印到固相支持物上，用探針雜交后進行檢測的方法，用于

DNA/DNA雜交。該方法主要用于檢測基因組中待測的基因或序列4、Northern印跡雜交Northern印跡雜交（Northernblot）。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)，RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對應(yīng)，故被稱為Northern印跡雜交.4、Northern印跡雜交

檢測RNA（主要是mRNA）的方法與Southern雜交的不同靶核酸：RNARNA電泳Northern印跡雜交主要用于觀測各種基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大小、轉(zhuǎn)錄量以及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特性分析?？俁NA/mRNA→變性電泳分離→轉(zhuǎn)移→雜交→放射自顯影/化學顯色DNA測序

DNA測序（DNAsequencing，或譯DNA定序）是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤的（G）排列方式?？焖俚腄NA測序方法的出現(xiàn)極大地推動了生物學和醫(yī)學的研究和發(fā)現(xiàn)。

在基礎(chǔ)生物學研究中，和在眾多的應(yīng)用領(lǐng)域，如診斷，生物技術(shù)，法醫(yī)生物學，生物系統(tǒng)學中，DNA序列知識已成為不可缺少的知識。具有現(xiàn)代的DNA測序技術(shù)的快速測序速度已經(jīng)有助于達到測序完整的DNA序列，或多種類型的基因組測序和生命物種，包括人類基因組和其他許多動物，植物和微生物物種的完整DNA序列。(三)聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）

PCR：一種體外基因擴增技術(shù)，對目的基因組DNA的信號進行放大的生物學技術(shù)。它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。PCR技術(shù)簡史DNA的復制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細胞內(nèi)的DNA復制最初采用E-coliDNA聚合酶進行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學獎基因組DNA獲取特定DNA片段擴增特定DNA片段PCR的原理PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點標準的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L1234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR(聚合酶鏈式反應(yīng)）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實際就是一個溫控設(shè)備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。PCR擴增產(chǎn)物電泳通過PCR能擴增出所需的特異性條帶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個RFU細菌檢測的最小檢出率為3個細菌簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時完成擴增擴增產(chǎn)物一般用電泳分析對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNA特點：特異性引物引物

引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。PCR的類型和應(yīng)用研究基因克隆，DNA測序，分析突變診斷細菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測序，表達圖譜法醫(yī)犯罪現(xiàn)場標本分析腫瘤各種腫瘤檢測其他……病原體核酸的檢測——RealtimePCR實時熒光定量PCR：通過起始點定量和熒光檢測系統(tǒng)實時監(jiān)測累積熒光強度而實現(xiàn)核酸定量的一種技術(shù)。廣泛應(yīng)用于結(jié)核和麻風分枝桿菌、乙型肝炎病毒、丙型和戊型肝炎病毒、HIV、巨細胞病毒的檢查在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，添加了一條標記2個熒光基團的熒光雙標記探針。一個標記在探針的5‘端，稱為熒光報告基團（R）；另一個標記在探針的3’端，稱為熒光抑制基團（淬滅基團Q）。探針的3‘羥基（-OH）已被去除或封閉，不具有延伸能力。在探針分子完整的情況下，R發(fā)出的熒光被Q淬滅吸收。此時檢測不到熒光信號。當特異性PCR擴增發(fā)生時，探針會在PCR過程中被Taq酶的5’--3‘外切酶活性作用切斷，釋放出R基團,Q的抑制作用消失，從而引起報告基團熒光信號的產(chǎn)生,熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步

。熒光信號伴隨PCR產(chǎn)物的增長而增長目前用于臨床檢測的病原體基因診斷試劑絕大部分是此類。

實時熒光定量PCRRT-PCR

反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR）是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板經(jīng)行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。（三）、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）:

限制性核酸內(nèi)切酶能夠識別特定的DNA序列，并在其中的某一特定堿基位點（限制性位點）將DNA切斷，使

DNA形成限制性片段.粘性切口平端切口

PCR-RFLP1.目的基因的擴增2.擴增片段的酶切3.酶切產(chǎn)物的電泳4.多態(tài)性（突變）的確定RFLP技術(shù)珍斷疾病的機理:由于基因突變的結(jié)果,使DNA上原有的核酸內(nèi)切酶的識別序列發(fā)生改變,導致使用限制酶去切割時得到的結(jié)果與不發(fā)生突變的結(jié)果完全不同,可借此做出診斷.如:某些遺傳性疾病發(fā)生特異的點突變,而點突變位置正好是某些酶的識別和切割點,可用酶切方法做出診斷.RFLP的主要步驟

DNA→酶切→Southern雜交分析DNA→PCR→酶切→電泳分析

RFLP主要有以下兩種類型：

點多態(tài)性序列多態(tài)性點多態(tài)性

表現(xiàn)為DNA鏈中發(fā)生單堿基突變，且突變導致一個原有酶切位點的丟失或形成一個新的酶切位點。這類多態(tài)性實際是雙態(tài)的，即有或無酶切位點。據(jù)此，樣品DNA經(jīng)特定內(nèi)切酶消化或Southern印跡雜交即可診斷某些疾病。2.序列多態(tài)性

DNA鏈內(nèi)發(fā)生較大片段的缺失、重復、插入等變異。結(jié)果，內(nèi)切酶位點本身堿基序列雖未改變，但原有內(nèi)切酶位點在基因組中的相對位置改變了從而導致RFLP。也可用Southern印跡雜交診斷相關(guān)疾病。

單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)

主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數(shù)可達300萬個甚至更多。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致

基因芯片(Genechip,DNAchip),又稱為DNA微陣列(DNAMicroarray)，是指固定在載體上的高密度DNA微點陣。具體地說就是將已知DNA片段或cDNA片段作為探針，緊密有序地排列固定于支持物（多聚賴氨酸硅膠）上，然后與熒光標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子雜交信號的強度，獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。（四）、基因芯片

基因芯片的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法（southern

、northern）是一致的，都是應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補的靶核苷酸序列雜交，通過隨后的信號檢測進行定性與定量分析，基因芯片在一微小的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成了大量的分子識別探針，能夠在同一時間內(nèi)平行分析大量的基因，進行大信息量的篩選與檢測分析。

基因芯片主要技術(shù)流程包括：芯片的設(shè)計與制備；靶基因的標記；芯片雜交與雜交信號檢測。

基因芯片或微陣列是近年發(fā)展起來的分子生物學研究工具。在

1平方厘米的芯片上可以同時分析幾百至數(shù)萬個基因，具有高通量、快速獲取有關(guān)生物學信息的特點。目前基因芯片主要用于科研，要從實驗室研究推向臨床應(yīng)用還有一系列問題需要解決。如提高特異性、簡化操作、降低成本等。意義靈敏度高，是檢測病原體微生物最靈敏的方法，但具有一定的假陽性與假陰性。特異性強，陽性只表明存在某種病原體的核酸，是否正被感染應(yīng)結(jié)合臨床具體分析。特別適用于目前尚不能分離培養(yǎng)或很難分離培養(yǎng)的微生物。適用于核酸變異的病原微生物，如病毒第三節(jié)基因診斷的應(yīng)用一、遺傳性疾病的診斷二、感染性疾病基因診斷三、腫瘤的基因診斷四、基因診斷在法醫(yī)學中的應(yīng)用鐮狀細胞貧血的基因診斷一、遺傳性疾病的診斷

血紅蛋白(hemoglobin,Hb)鐮刀形紅細胞貧血

（sicklecellanemia）

分子病--鐮刀狀紅細胞性貧血成人血紅蛋白為α2β2鐮刀狀紅細胞性貧血的病因是

β鏈結(jié)構(gòu)異常(GAG→GTG)

1234567HbAN--Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-HbsN--Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-鐮狀細胞貧血的基因診斷ProGluGluCCTGAGGAGHbAProValGluCCTGTGGAGHbSMstIIMstIIMstIICCTNAGG1.1kb0.2kbMstIIMstII1.3kb567HbA:2053bp點突變,發(fā)生在限制性內(nèi)切酶位點上Southernblot檢測鐮狀細胞貧血制備血液DNAMstII消化瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜與標記的珠蛋白DNA雜交放射自顯影PCR擴增檢測PCR擴增珠蛋白基因MstII消化瓊脂糖電泳EB染色

純合子雜合子1.3Kb1.1Kb鐮狀細胞貧血癥患者的血樣本DNA經(jīng)MstII（識別序列CCTGAGG）酶切后電泳檢測。294191103bpSSAAASPCR擴增檢測結(jié)果二、感染性疾病基因診斷

感染性疾病由病原微生物引起，致病的病原微生物主要有病毒、細菌、衣原體、支原體和螺旋體等。這些病原體的傳統(tǒng)檢測方法通常采用形態(tài)學檢查，體外培養(yǎng)和免疫學試驗。但對某些難以培養(yǎng)的病原體，抗原抗體檢測不能判斷體內(nèi)病原體DNA或RNA的復制情況，或存在檢測靈敏度低等問題。自聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)問世以來，基因診斷技術(shù)作為病原體檢測的新方法得到突飛猛進的發(fā)展實時熒光定量PCR（RealTimeFlourescencequantitativePCR,FQ—PCR）病原體基因診斷的主要技術(shù)方法目前病原體基因診斷在臨床上最大的用途是1.檢測難于培養(yǎng)的病原體2.在治療中檢測病毒載量以評價療效3.治療過程中檢測耐藥基因突變4.用于血液篩查5.用基因分型方法進行病原體種群分類。已通過國家藥品食品監(jiān)督管理局（SFDA）審批的基因診斷試劑序號試劑盒名稱

1乙型肝炎病毒（HBV）核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒2乙肝病毒核酸熒光定量檢測及YMDD變異檢測試劑盒

丙肝病毒（HCV）核酸擴增（PCR）—熒光檢測試劑盒結(jié)核分支桿菌（TB）核酸擴增（PCR）—熒光檢測試劑盒沙眼衣原體（CT）核酸擴增（PCR）—熒光檢測試劑盒6沙眼衣原體和淋球菌（CT&NG）核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒7人乳頭瘤病毒（HPV）核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒

8人類免疫缺陷病毒（HIV—1）核酸擴增（PCR）熒光定量檢測試劑盒9新型冠狀病毒（SARS）核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒10神經(jīng)管畸形基因檢測（PCR—RFLP）試劑盒11地中海貧血基因檢測試劑盒（基因芯片法)

拉米夫定治療慢性乙肝療效顯著，但長期使用拉米夫定會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。使用一年、二年、三年、四年的耐藥比率為15-32%、38%、49%、66%。因此，服藥前期及服藥期間監(jiān)測YMDD的變化及HBVDNA含量就顯得十分重要。拉米夫定耐藥的主要原因是病毒多聚酶基因的YMDD（酪氨酸－蛋氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸）區(qū)域發(fā)生突變，即由YMDD突變?yōu)閅IDD或YVDD，從而產(chǎn)生耐藥。蛋氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幄窕蚶i氨酸Ⅴ，從而降低了拉米夫定的親和力，減弱拉米夫定對突變病毒復制的抑制能力1、提高自動化程度。從標本預(yù)處理、核酸提取到基因擴增和產(chǎn)物檢測都有望實現(xiàn)自動化，可將人為誤差降到最小，提高檢測的精確度，提高工作效率。2、測定方法和工作程序的標準化。通過標準化改善實驗室測定準確度，從而提高不同實驗室間結(jié)果的可比性。3、在嚴密設(shè)計的臨床應(yīng)用研究基礎(chǔ)上，確定每一個基因診斷項目適用的范圍，避免濫用造成的困擾和不必要的費用。4、開發(fā)更加快捷廉價的檢測方法病原體基因診斷的發(fā)展趨勢三、腫瘤的基因診斷腫瘤相關(guān)基因包括癌基因、原癌基因、腫瘤抑制基因、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、腫瘤耐藥基因四、基因診斷在法醫(yī)學中的應(yīng)用法醫(yī)學中對生物樣本檢測的主要目的是達到個人識別和親子鑒定80年代以來，以核酸分子雜交和PCR技術(shù)為核心的基因診斷學的迅速發(fā)展，有逐漸取代傳統(tǒng)法醫(yī)物證鑒別法的趨勢法醫(yī)學基因診斷的分子基礎(chǔ)是基于人類基因組結(jié)構(gòu)中存在一些可作為個體特征標示的序列,即可變串連重復序列（小衛(wèi)星DNA）的多態(tài)性三.基因診斷在法醫(yī)學中的應(yīng)用DNA指紋技術(shù)：遺傳基礎(chǔ)是DNA的多態(tài)性個體特征標志的序列建立于1985年Humangenome:3.3billionbpwith<40000genes1.1%:exons;(Codingregion)))24%introns,75%intergenicNoncodingGenome:1、

Codingregion(編碼區(qū))：<5%inhumangenome(1.5%).2.

Noncoding(非編碼)DNA:introns(內(nèi)含子),tandemlyrepeated(串連重復)sequences(e.g.satelliteDNA)orinterspersedrepeats分散重復(e.g.Aluelement).可變串聯(lián)重復序列（variablenumberoftantemrepeatVNTR)5’–ATAAACTATAAACTATAAACT–3’3’–TATTTGATATTTGATATTTGA–5’n（核心序列）Satellitescomprisemorethan40%ofthegenome小衛(wèi)星DNA核心序列長10-70bp，主要分布于基因組的非編碼區(qū)。不同個體重復次數(shù)相差懸殊，因而長度變化較大，呈現(xiàn)多態(tài)性?？梢杂脕龛b別個體(小衛(wèi)星DNA)DNA指紋技術(shù)：遺傳基礎(chǔ)是DNA的多態(tài)性個體特征標志的序列建立于1985年方法:指紋圖譜法:用HinfI切割染色體DNA.由于該酶在小衛(wèi)星DNA的重復序列上無切點,因此電泳后在用標記的小衛(wèi)星DNA做探針雜交時,不同個體出現(xiàn)不同的雜交帶型,稱為指紋圖譜.至今世界上還未發(fā)現(xiàn)有兩個人的雜交帶型完全相同.不同的個體或群體有不同的DNA指紋圖:英國遺傳學家杰弗里斯對白種人研究表明，兩個隨機個體具有完全相同的DNA指紋圖的概率，為三千億分之一(即3×10-11)。兩個同胞個體具有相同圖譜的概率也僅僅為二百萬分之一(即2×10-6)。但同卵雙胞胎的DNA指紋圖完全相同。DNA指紋術(shù)的工作原理及步驟

提取DNA(樣品:毛發(fā)、血痕、精斑、人體組織或白骨等)用限制性內(nèi)切酶HinfI切割，將DNA切割成許多長度不同的小片段。對酶解完全后的DNA片段進行電泳，分離各酶切片段。先用堿性溶液使凝膠板中雙鏈DNA片段變性為單鏈片段，然后將凝膠板夾在尼龍膜中，使這些單鏈DNA片段轉(zhuǎn)印到尼龍膜上。讓放射性核心序列探針與尼龍膜上的單鏈DNA片段進行分子雜交。用放射性膠片與尼龍薄膜疊放，尼龍膜上的放射性探針便會發(fā)出X射線使膠片曝光，從而使雜交帶顯影在膠片上。

獲得DNA片段條狀圖譜,便是所謂的DNA指紋。DNA指紋技術(shù)的原理：AnapplicationofrepeatedDNAsequencesfoundinmammaliangenomesHighlyvariablebetweenindividualsNotwopeoplearethesame,exceptidenticaltwins1．高度的特異性2．穩(wěn)定的遺傳性：DNA是人的遺傳物質(zhì)，其特征是由父母遺傳的。分析發(fā)現(xiàn)，DNA指紋圖譜中幾乎每一條帶紋都能在其雙親之一的圖譜中找到，這種帶紋符合經(jīng)典的孟德爾遺傳規(guī)律，即雙方的特征平均傳遞50％給子代。3．體細胞穩(wěn)定性：即同一個人的不同組織如血液、肌肉、毛發(fā)、精液等產(chǎn)生的DNA指紋圖形完全一致。DNA指紋的特點流式細胞術(shù)及其應(yīng)用流式細胞儀常用熒光素流式細胞術(shù)介紹數(shù)據(jù)分析什么是流式細胞術(shù)？利用流式細胞儀（flowcytometry,FCM）對處在快速、直線、流動狀態(tài)中的單個微粒多參數(shù)、快速定量分析，也可以同時對特定群體進行分選的技術(shù)分析對象包括細胞、細菌、熒光微球等，0.4m~40m什么是流式細胞儀？六種技術(shù)：激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算機技術(shù)、細胞熒光化學技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)四個系統(tǒng)：液流系統(tǒng)、光學系統(tǒng)、電路系統(tǒng)、分析系統(tǒng)流式細胞儀構(gòu)造激光源計算機分析濾光片（長通、短通、帶通）包括流動室、鞘液和樣本流信號檢測器BDFACSCalibur雙光源，488nm和633nm可同時檢測四種抗原可分選（理論上）流式細胞儀檢測什么信號？散射光信號前向散射光（forwardscatterlight,fsc

）反映細胞大小側(cè)向散射光（sidescatterlight,ssc）反映細胞內(nèi)部顆粒、核膜等FSC檢測器SSC檢測器外周血裂紅后FSC/SSC分布R1:淋巴細胞R2:單核細胞R3:中性粒細胞R4:裂解碎片流式細胞儀檢測什么信號？熒光信號細胞抗原抗體熒光素激光束抗原抗體反應(yīng)單克隆熒光抗體標記常用熒光素不同的激光器搭配不同的熒光素，原理是激發(fā)光波長有所不同數(shù)據(jù)分析設(shè)門（gating）：根據(jù)某些特性將分析細胞群圈起來。淋巴細胞：FSC/SSCCD45++/SSCdimT淋巴細胞：CD3+/SSCdim數(shù)據(jù)分析直方圖單參數(shù)分析橫坐標：信號強度縱坐標：細胞數(shù)量數(shù)據(jù)分析散點圖雙參數(shù)分析橫、縱坐標代表的均是信號強度UL:cd3-cd4+UR:cd3+cd4+LL:cd3-cd4-LR:cd3+cd4-標本染色的一般方法已開展的臨床項目FCM的臨床應(yīng)用其他臨床應(yīng)用標本來源：

外周血、骨髓、組織塊、培養(yǎng)細胞、腦脊液、胸腹水、肺泡灌洗液(BALF)及其脫落細胞。血清和各類體液樣本（可溶性蛋白）標本染色的一般方法前期處理CSF、BALF、胸腹水等：過濾、離心后制成單細胞懸液，并調(diào)整目標細胞濃度約106/ml骨髓、紅細胞：調(diào)整樣本中目標細胞濃度106/ml50～100l標本(血小板1～5l)+熒光抗體室溫，避光，抗體孵育20min(胞內(nèi)因子檢測需置4℃)抗體孵育如果需要破壞樣本中紅細胞：

加入1ml紅細胞裂解液避光，10min溶血離心棄上清，加入PBS，混勻后離心，棄去上清用400lPBS充懸，避光待上機。胞內(nèi)抗原檢測：

按照說明書加入固定劑、破膜劑及胞內(nèi)熒光抗體，避光反應(yīng)30~40min。胞內(nèi)染色洗滌上機已開展的項目淋巴細胞亞群HLA-B27CD55、CD59檢測CD34造血干細胞計數(shù)白血病和淋巴瘤免疫分型雜項（BALF、胸腹水等CD分子檢測）TH1/TH2細胞檢測血小板活化炎癥感染指標CD64CBA網(wǎng)織紅細胞/血小板檢測微小殘留病灶（MRD）腫瘤細胞倍體（DNA）細胞凋亡

……流式細胞術(shù)的臨床應(yīng)用其他臨床應(yīng)用淋巴細胞亞群試劑：BDIMK-LymphocyteKit標本：外周血（常用）檢測指標：T細胞（CD3、CD4、CD8）

B細胞（CD19）

NK細胞（CD3-CD16＋56＋）已開展的項目實驗室報告醫(yī)生報告臨床意義：體內(nèi)免疫狀態(tài)判斷某些免疫缺陷、自身免疫性疾病、病毒感染

SCID、AIDS、SLE、RA急性GVHD、移植排斥、惡性腫瘤免疫球蛋白缺乏癥或分泌過多結(jié)合淋巴細胞絕對數(shù)來看待百分比的改變AIDS淋巴細胞亞群HLA-B27試劑：BDHLA-B27Kit標本：外周血檢測指標：T

(CD3+)淋巴細胞上HLA-B27

定性檢測已開展的項目臨床意義：強直性脊柱炎（高度相關(guān)）遺傳性關(guān)節(jié)炎

Reiter’s綜合征

反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎

急性前葡萄膜炎、腸炎性關(guān)節(jié)炎、HLA-B27CD55、CD59試劑：CD59-FITC、CD55-PE標本：外周血（紅細胞、白細胞）檢測指標：CD55、CD59百分比

CD55、CD59熒光強度已開展的項目臨床意義：陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）酸化血清溶血試驗（Ham’s試驗）糖水試驗蛇毒因子溶血試驗補體溶血敏感實驗FCM檢測（金標準）CD55、CD59以紅細胞檢測為例normalPNH造血干細胞計數(shù)試劑：BDProcount?ProgenitorCellEnumerationKit標本：骨髓、動員后的外周血檢測指標：CD34＋％及濃度已開展的項目藍色－熒光微球（數(shù)量已知）；紅色－CD34＋細胞干細胞特征：

CD45表達弱→陰性

(R2)CD34表達弱→強

(R4)DNA/RNA含量多，染色性較強(R1)大?。‵SC）和顆粒度（SSC）淋巴細胞相似臨床意義：血液系統(tǒng)疾病的造血干細胞移植

數(shù)量的檢測采集時機的確定

某些腫瘤

造血干細胞計數(shù)白血病和淋巴瘤（L&L）免疫分型試劑：各種單克隆熒光抗體標本：骨髓、外周血、胸腹水、腦脊液、淋巴組織檢測指標：我室目前開展了將近40種指標的檢測可滿足大部分L&L的分型要求已開展的項目分型方案：CD45設(shè)門，四色標記，臨床意義：客觀、快速地分析確定異常細胞系來源及分化階段區(qū)分雙克隆或雙表型的HAL判斷預(yù)后白血病和淋巴瘤（L&L）免疫分型正常骨髓細胞CD45/SSCR1:淋巴細胞R2:幼稚細胞R3:單核細胞R4:中性粒細胞R5:有核紅細胞AML-M1R2占94％，表達cd33,cd34,cd117,cd71,cd13,cd64,mpoALL(B)R2占65％，表達cd79a,cd19,cd34,cd22,cd10,cd38,hla-drMMR2占17％，表達cd38(+++),ckappa輕鏈臨床意義：結(jié)節(jié)病和特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化肺部腫瘤疾病已開展的項目肺泡灌洗液（BALF）淋巴細胞檢測cd4/cd8≈5.04TH1/TH2細胞檢測TH1，抗胞內(nèi)病原體遲發(fā)型超敏反應(yīng)、炎癥

IL-2、IFN-γ、TNF-α介導細胞免疫CD4+TTH1/TH2TH2，蠕蟲感染環(huán)境變應(yīng)原