微生物藥物的分離精制鑒別

第三節(jié)微生物制藥1一、微生物藥物的幾個相關(guān)基本概念二、微生物藥物的分類三、微生物藥物的應用四、藥源微生物及微生物藥物的篩選技術(shù)五、微生物藥物的發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)六、微生物藥物的分離、精制和鑒別七、廢棄物的綜合利用和環(huán)境保護2六、微生物藥物的分離、精制和鑒別微生物藥物分離純化的重要原則考慮使用高選擇性的分離純化方法，保證產(chǎn)品要求的純度；考慮不影響產(chǎn)品的生物活性；獲得的最終產(chǎn)品必須達到或超過國家藥典（或出口國）的質(zhì)量標準。31、提取的過程和原則提取的3個階段：發(fā)酵液的預處理和固液分離提取（分離濃縮）精制（純化）4發(fā)酵液的預處理和固液分離目的：達到固液分離根據(jù)活性物質(zhì)的許可范圍，可以采取酸化、加熱、過濾、絮凝、離心等方法。5微生物藥物的分離、精制和鑒別1、發(fā)酵液的過濾和預處理分離細胞、菌體和其它懸浮顆粒（細胞碎片、核酸和蛋白質(zhì)的沉淀物），除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利于后繼各步操作。6（1）發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的去除pH的調(diào)節(jié)采用加熱使蛋白質(zhì)變性加入蛋白質(zhì)沉淀劑和絮凝劑在抗生素穩(wěn)定性好時可采用較強的無機酸調(diào)節(jié)pH，一般采用較為緩和的有機酸，如草酸。金屬鹽類：硫酸鋅、硫酸鋁、氯化鋁水溶性高分子化合物：聚苯乙烯衍生物7（2）發(fā)酵液中高價離子的去除Ca2+，草酸Mg2+，三聚磷酸鈉Fe3+，黃血鹽→普魯氏藍沉淀8（3）發(fā)酵液的過濾影響過濾速度的因素——菌種、發(fā)酵培養(yǎng)基的組成、發(fā)酵周期長短等；改善過濾性能——常用助濾劑硅藻土；過濾設(shè)備——鼓式真空過濾器，板框壓濾機9（4）不過濾提取主要用于離子交換法提取抗生素，如鏈霉素；一般采用反吸附，將經(jīng)稀釋后黏度降低的發(fā)酵液自下而上的流經(jīng)樹脂床，樹脂呈“沸騰狀”，吸附后的廢液（包括發(fā)酵液中的懸浮顆粒）一起流出離子交換罐外。10提取（分離濃縮）對活性物質(zhì)的濃縮方法：化學萃取，樹脂吸附，沉淀等11精制（純化）獲得活性物質(zhì)的純品方法：沉淀，吸附，結(jié)晶，脫色，色譜層析等。12分離提取的原則：操作時間應盡可能的短；操作溫度一般要低；分離純化操作應在藥物性質(zhì)許可的pH范圍內(nèi)；經(jīng)常清洗消毒，避免雜菌的污染；如果是注射用藥物，精制和成品階段應保證無菌操作。132、提取純化的基本方法吸附法沉淀法溶劑萃取法離子交換法14吸附法利用適當?shù)奈絼ㄈ缁钚蕴?、白土、氧化鋁等），在一定的pH條件下，使發(fā)酵液中的目的產(chǎn)物被吸附，然后改變pH，以適當?shù)南疵搫ㄒ话銥橛袡C溶劑）將產(chǎn)物洗下。早期的青霉素、鏈霉素及目前的絲裂霉素、放線菌酮等藥品的分離提取主要采用吸附法。操作簡單，成本較低，但吸附性能不穩(wěn)定，使用大量有機溶劑影響環(huán)境。發(fā)展趨勢——應用和開發(fā)新型大孔吸附樹脂。15大網(wǎng)格樹脂是一種非離子性吸附劑，具有選擇性好、解吸容易、樹脂性能穩(wěn)定、機械強度好、可反復使用等優(yōu)點。非極性——從極性溶液中吸附非極性物質(zhì)極性——從非極性溶液中吸附極性物質(zhì)中等極性——均具有吸附能力吸附法16沉淀法利用某些微生物代謝產(chǎn)物的兩性性質(zhì)，使其在等電點時沉淀，或在一定pH條件下，與酸堿鹽形成不溶性或幾乎不溶的復鹽。如四環(huán)素類藥物的提取。設(shè)備簡單，成本低，收率高。但不是所有的藥物都可以使用沉淀法提取的，且反應形成的沉淀物過濾困難。實際操作中常與溶劑萃取法結(jié)合使用。17溶劑萃取法利用微生物藥物在水和與水不互溶的有機溶劑中的溶解性的差異，將藥物從一種液體轉(zhuǎn)移到另一種液體中，從而達到濃縮和提純的目的，如目前的青霉素提取。產(chǎn)品的濃縮倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高，操作周期短，可以連續(xù)生產(chǎn)。但對設(shè)備的要求較高，大量消耗有機溶劑，污染環(huán)境。18青霉素的提取及精制青霉素：酸性化合物，酸性時為游離酸，易溶于有機溶劑。在pH7以上以鹽狀態(tài)存在，易溶于水。pH2.5，濾液→醋酸丁酯pH7.0，緩沖液pH2.5，醋酸丁酯丁酯提取液冷凍脫水，加入醋酸鉀-乙醇溶液→青霉素鉀鹽結(jié)晶反萃取19紅霉素的提取及精制紅霉素：堿性化合物，在堿性條件下溶于有機溶劑，在酸性時溶于水。erythromycin20發(fā)酵液預處理、過濾將濾液pH調(diào)節(jié)到9.8-10.2，用醋酸丁酯提取提取液用pH4.0-4.2的酸性緩沖液反提取將pH調(diào)節(jié)到9.8-10.2，用醋酸丁酯二次提取提取液加入一定量丙酮，冷卻至-5℃，放置后析出紅霉素結(jié)晶過濾，干燥，得成品紅霉素的提取及精制21離子交換法利用某些微生物藥物能夠解離成陰離子或陽離子的特性，通過離子交換樹脂的選擇性交換，實現(xiàn)產(chǎn)物的分離。如卡那霉素、慶大霉素是堿性化合物，可以采用陽離子交換樹脂來提取。分離純化的成本低，需要的設(shè)備簡單，操作方便，使用的有機溶劑少，不污染環(huán)境。但工藝周期長，操作過程中pH變化大，很多微生物藥物不能耐受。22鏈霉素的提取鏈霉素是3價陽離子，具有很強的堿性，在堿性條件下不穩(wěn)定。23鏈霉素的提取選用鈉型的弱酸性陽離子交換樹脂101×4或110在中性條件下進行吸附，飽和的樹脂用稀硫酸解吸。高交聯(lián)度氫型磺酸基陽離子交換樹脂1×25或1×20去除Na+、Mg2+等無機離子。用堿性羥基型樹脂中和洗脫液的酸性，并去除鏈霉胍等小分子有機雜質(zhì)。精制液經(jīng)濃縮、脫色、噴霧干燥，得成品。243、微生物藥物提取方法的選擇分離純化方法的確定需要由小試決定。具體實施時應考慮因素有：產(chǎn)品的基本理化性能化合物的穩(wěn)定性盡可能避免二次污染254、微生物藥物的鑒別早期鑒別最終鑒別和結(jié)構(gòu)測定26（1）早期鑒別微生物藥物的提取方法及其溶解性，微生物藥物本身的特異顏色，微生物藥物對酸、堿、溫度、光線的穩(wěn)定性等都可以作為微生物藥物鑒別用的一個“指紋”。27用微量注射器針頭或微細管把樣品點一小點在層析床的一端。要求層析床必須完全干燥，點樣之后轉(zhuǎn)入裝有展層劑的玻璃槽中。當展層劑的前沿跑到濾紙全長的80％-90％時，將層析床取出。

紙層析28可以用相對遷移率（Rf）來表示一種物質(zhì)的遷移：或者也可以用相對于一種已知遷移率的標準物的遷移（Rx）來表示：待測物移動的距離標準物移動的距離Rx=組分移動的距離溶劑移動的距離Rf=在分析待測樣品時，應在同一層析床上同時分析一種或多種標準物質(zhì)，來檢驗樣品的Rf值。

29薄層掃描儀快速；可用腐蝕性試劑顯色；易于制備少量樣品。薄層層析30十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的薄層色譜圖1:乙酰螺旋霉素;2:麥迪霉素;3:麥白霉素;4:吉他霉素;5:乙酰吉他霉素31（2）微生物藥物的快速、準確鑒別LC